工频磁场对细胞蛋白质酪氨酸磷酸化影响的研究*
作者：孙文均 余应年 付一提 鲁德强 姜槐
单位：孙文均 付一提 鲁德强 姜槐 浙江医科大学微波研究室 (杭州 310031)；余应年 浙江医科大学病理生理学教研室
关键词：电磁场；蛋白质类；酪氨酸；磷酸化
工频磁场对细胞蛋白质酪氨酸磷酸化影响的研究 摘 要 目的：研究50Hz工频磁场对细胞胞浆蛋白质酪氨酸磷酸化的影响，以初步探讨工频磁场生物效应有关细胞信息转导的机制。方法：对分别经两个不同强度的工频磁场(正弦)作不同时间辐照处理后的细胞，提取其胞浆蛋白质，定量后，以Western blot方法测定并比较细胞胞浆蛋白质酪氨酸磷酸化的程度。结果：0.4 mT和0.8 mT两个强度的工频磁场均可影响胞浆蛋白质酪氨酸磷酸化。其中，两个强度都能影响分子量为38、 97.4(×103)蛋白质的酪氨酸磷酸化。此外，0.4 mT强度还可使61.7、105及112(×103)的蛋白质酪氨酸磷酸化发生改变，而0.8 mT强度却使79、150(×103)的蛋白质酪氨酸磷酸化发生变化。并且上述蛋白质酪氨酸磷酸化的变化均存在着时间相关性。结论：提示工频磁场可以使细胞内一些胞浆蛋白质酪氨酸磷酸化产生时间相关性的变化。
, 百拇医药
Studies on effects of power-frequency magnetic fields on
protein tyrosine phosphorylation in culture cells
SUN Wen-Jun, YU Ying-Nian, FU Yi-Ti, LU De-Qiang, JIANG Huai.
Microwave Institute, Zhejiang Medical University, Hangzhou (310031)
Abstract AIM:To study the effects of the power-frequency magnetic fields on protein tyrosine phosphorylation, and explore the related mechanism of cell signal transduction of power-frequency magnetic fields.METHODS：Chinese hamster lung (CHL) cell line was exposed to power-frequency magnetic fields with two intensities and different exposure time, then cytoplasmic protein was extracted and Western blotting analysis was used to measure and compare the degrees of protein tyrosine phosphorylation.RESULTS：Both 0.4 mT and 0.8 mT power-frequency magnetic fields can affect the protein tyrosine phosphorylation in cultured cells. Both intensities can affect the tyrosine phosphorylation of 38(×103) and 97.4 (×103) molecular weight proteins. In addition, 0.4 mT can affect tyrosine phosphorylation of 61.7, 105 and 112 (×103) molecular weight proteins, but 0.8 mT affects the tyrosine phosphorylation of 79 (×103) and 150 (×103) proteins. Moreover, all the tyrosine phosphorylation changing of these proteins is a time-relative course. CONCLUSION：Power-frequency magnetic fields can cause the time-relative alteration of cellular protein tyrosine phosphorylation.
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MeSH Electromagnetic fields; Proteins; Tyrosine; Phosphorylation
随着电力事业的飞速发展和各种电器设备的广泛应用，人们生活空间中的工频磁场强度日益增加。许多研究表明，工频磁场可以产生广泛的生物效应。为了探索工频磁场生物效应的机理，我们从细胞缝隙连接通讯和基因转录角度进行研究，并发现一定强度的工频磁场不仅可以抑制细胞间的缝隙连接通讯[1，2]，还可以影响基因的转录[3]；一些学者[4，5]从细胞内第二信使Ca2+着手，研究工频磁场的细胞内信息转导过程；Uckun等[6]从细胞Lyn激酶水平来研究；也有从细胞膜电位[7]、或物理作用过程[8]等方面来解释工频磁场生物效应的机制，然而工频磁场产生效应的机制至今尚未能阐明。这不仅影响了对极低频辐射可能危害的认识和防护，也限制了一些有益效应的应用。哺乳类细胞中除了受体-第二信使信息转导通路外，还普遍存在着Ras等重要的信息转导途径，而且这些途径在转导外界信息时常通过蛋白质间级联磷酸化进行的[9]。工频磁场是否可通过蛋白质级联磷酸化过程进行信息转导，国内外在这一方面的研究很少。因此，本研究试图通过测定工频磁场对胞浆蛋白质酪氨酸磷酸化的影响，来初步探索工频磁场可能存在的新的信息转导过程，为进一步研究工频磁场生物效应的有关细胞信息转导机制提供有效的基础资料。
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材料与方法
一、材料：
1.细胞株：中国仓鼠肺成纤维细胞(Chinese hamsterlung cell line, CHL)。
2.主要试剂：Phosphotyrosine western blotting kit.(德国Boehringe Mannheim公司)。
3.主要仪器：凝胶电泳及转膜系统(美国Bio-Rad公司)，光密度扫描仪(瑞典Pharmacia公司)，低温高速离心机(美国Beckman公司)，细胞培养箱(美国Forma公司)，Model 120场强仪(美国)。
4.工频磁场辐照系统：该系统主要由一对边长36 cm、高度8 cm、168匝的Helmholtz线圈，一只等长等高、60匝的中置补偿线圈，两只调压器及细胞培养箱构成。其中，3只线圈相互串联后叠放于细胞培养箱中的铁制屏蔽箱内，线圈的两个端线与培养箱外的调压器相连。3只线圈内的空间区域即构成了一个恒温、均匀、强度于0～0.8 mT之间连续可调的50 Hz正弦磁场辐照区。
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二、方法：
1.细胞培养、分组及处理：CHL细胞在含FCS(15%)、青霉素(100 ×103 U/L)、链霉素(100 mg/L)、卡那霉素(100 mg/L)的MEM培养基、5% CO2及37℃条件下常规培养，3 d (72 h)后作辐照处理。实验分为0.4 mT及0.8 mT两个剂量组，每个剂量组又按不同的辐照时间分为5、10、15、30、60 min及12 h和24 h 7个亚组及假辐照空白对照组。不同时间亚组的细胞于距收获相应的时间放入辐照系统进行处理，于第4 d(96 h)同时收获。
2.细胞蛋白质样品制备：经处理后的细胞立即弃去培养液，4℃PBS洗涤细胞2遍，吸尽残液，每瓶各加2 mL 0.05%胰酶消化1～2 min(4℃)，弃去胰酶并加4 mL PBS制成细胞悬液，将细胞悬液移至5 mL离心管，5000 r/min离心5 min，弃上清后加4 mL PBS重悬细胞，再离心并重复1次。吸尽残液，加预冷细胞裂解液0.5 mL，吹散细胞沉淀，4℃放置60 min,然后于4℃下14 000 r/min离心15 min，取上清备用。
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3.蛋白质定量：以改良Lowry氏法测定蛋白质含量[10]。
4.蛋白质电泳及印迹电转移：按Bio-Rad说明配置SDS-聚丙烯酰胺凝胶(含5%积层胶，12%分离胶)。取含等量蛋白质的样品液，加入1/3体积的点样缓冲液，煮沸3 min，冷却后上样。电泳条件为：80 V 1 h， 160 V 2 h。电泳结束后，取下平板凝胶，按Bio-Rad操作说明进行印迹转膜。条件为：120 mA 60 min。
5.Western blotting分析：转膜后，取下NC膜，用丽春红染色，以观察转膜效果。然后，以去离子水清洗数遍，再作蛋白质印迹杂交：TBS洗膜1 min×2次，室温下封闭液处理30 min后，弃去封闭液，加入anti-phosphotyrosine-POD,置于37℃震荡水浴箱内作用70 min，然后室温下洗膜5 min×6次，弃去洗液，移至暗室，加入化学发光探测试剂，室温下反应1 min，暗盒曝光3～10 min，取出胶片后及时冲洗。光密度扫描仪测定蛋白质条带光密度并以光密度百分值作比较分析。每个强度组重复2次以上。
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结 果
(一) 0.4 mT工频磁场对蛋白质酪氨酸磷酸化的影响：经不同时间处理后发现，分子量为38、 61.7、 97.4、 105及112(×103)的蛋白质，其酪氨酸磷酸化的程度发生变化。38(×103)蛋白质磷酸化呈先上升，30 min达到高峰，后缓慢下降的单峰变化过程，变化的幅度很大；97.4 (×103)蛋白质磷酸化呈双峰变化，5 min达到第一高峰，15 min为波谷，12 h再达到高峰，变化的幅度达2倍之差；61.7(×103)蛋白质磷酸化也呈先升后降的单峰形式，10 min达高峰，30 min基本恢复并略有上升，但其变化的幅度不大。112 (×103)蛋白质的变化与61.7(×103)蛋白质相似，而105 (×103)蛋白质的变化却相反。磁场作用后，其磷酸化的程度反而下降，并于30 min达波谷，之后缓慢恢复但未能恢复至对照水平，变化幅度也达2倍之差。(见表1及图1)
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表1 对0.4 mT工频磁场产生反应的蛋白质的相对光密度值
Tab 1 The relative photodensity rate of proteins
that respond to 0.4 mT power-frequency magnetic field
Protein
(×103)
Relative photodensity rate
S
5min
10min
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15min
30min
1h
12h
24h
112.0
14.2
16.8
14.3
13.7
12.3
10.8
12.6
, 百拇医药
11.9
105.0
17.5
17.0
15.7
16.1
9.2
12.3
12.4
11.2
97.4
2.5
4.3
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3.9
2.5
3.9
4.1
5.0
4.4
61.7
7.2
8.7
9.4
7.9
7.4
8.3
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6.3
7.5
38.0
0.1
0.2
0.1
0.1
1.3
0.4
0.6
0.5
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Fig1 Effects of 0.4 mT power-frequency magnetic
field on protein tyrosine phosphorylation
M:marker; S:sham exposure; P:positive control
图1 0.4 mT工频磁场对蛋白质酪氨酸磷酸化的影响
(二) 0.8 mT工频磁场对蛋白质酪氨酸磷酸化的影响：分子量为38、 79、 97.4及150 (×103)的蛋白质，其酪氨酸磷酸化的程度可受到0.8 mT工频磁场的影响。其中，38 (×103)蛋白质磷酸化呈先略下降，后迅速上升，30 min达到高峰，之后又迅速下降的单峰变化过程，变化的幅度达2倍；97.4 (×103)蛋白质磷酸化也呈单峰变化，表现为15 min达到高峰，24 h时恢复至空白水平。其变化的幅度也达2倍之差；150 (×103)蛋白质磷酸化变化过程与0.4 mT组105 (×103)蛋白质基本一致，但变化的幅度比后者大，达3倍之差。79 (×103)蛋白质酪氨酸磷酸化也呈单峰变化，15 min达到高峰，此后恢复到对照水平，但变化幅度不及150 (×103)蛋白质。(见表2及图2)
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表2 对0.8 mT工频磁场产生反应的蛋白质的相对光密度值
Tab 2 The relative photodensity rate of proteins
that respond to 0.8 mT power-frequency magnetic field
Proteins
(×103)
Relative photodensity rate
S
5min
10min
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15min
30min
1h
12h
24h
150.0
9.0
7.1
6.2
6.6
2.9
4.8
4.2
, 百拇医药
3.3
97.4
2.3
2.8
2.7
5.3
4.7
4.1
4.1
2.1
79.0
8.2
12.1
, 百拇医药
11.5
13.0
12.6
10.0
9.6
6.9
38.0
0.5
0.3
0.4
0.5
1.0
0.3
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0.2
0.1
Fig 2 Effects of 0.8 mT power-frequency magnetic
field on protein tyrosine phosphorylation
M:marker S:sham exposure P:positive control
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图2 0.8 mT工频磁场对蛋白质酪氨酸磷酸化的影响
讨 论
实验结果经扫描后显示，胞浆中可发生酪氨酸残基磷酸化的蛋白质种类占胞浆总蛋白的比例较大，是胞浆中较为主要的蛋白质。0.4 mT和0.8 mT两个强度及不同时间组之间，酪氨酸残基发生磷酸化的蛋白质种类基本一致，即辐照前后及经不同强度、不同时间处理后，发生酪氨酸磷酸化的蛋白质种类没有增减，因此认为工频磁场作用24 h之内，可能没有新的可发生酪氨酸残基磷酸化的蛋白质的产生或原有蛋白质的消失。
进一步分析显示，两个强度的工频磁场经不同时间作用后，部分胞浆蛋白质酪氨酸磷酸化的程度可发生明显的变化。其中，两个强度都可影响38、97.4 (×103)蛋白质的酪氨酸磷酸化。受两个强度作用后，38 (×103)蛋白质酪氨酸磷酸化的变化比较相似，两者均呈单峰变化过程，都在30 min前达到高峰，之后逐渐下降，而且变化的幅度都达到2倍以上。与之相比，97.4 (×103)的蛋白质磷酸化存在着较大的差异，0.4 mT组呈双峰变化，5 min达到第一高峰，15 min为波谷，12 h再达到高峰，之后恢复到对照水平。而0.8 mT作用后则呈单峰变化，表现为15 min达到高峰，24 h时恢复至空白水平，但变化的幅度也都达2倍之差。此外，两个强度的工频磁场对蛋白质酪氨酸磷酸化的影响也表现出一定的差异：0.4 mT强度还可使61.7、105及112 (×103)蛋白质酪氨酸磷酸化发生改变，而0.8 mT强度却使79及150 (×103)的蛋白质磷酸化发生变化。这一结果提示，细胞内可能存在着一类对工频磁场都能产生反应的共性蛋白质，同时也存在着一些针对不同强度的工频磁场产生特定反应的、特异性较高的蛋白质。Uckun等[6]在研究低能量的电磁场对B淋巴细胞Lyn激酶的影响时，也有相似的结果。然而，这些产生共性与特异性反应的蛋白质，是否普遍存在于每个细胞株，以及这些蛋白质的具体属性、功能和作用等一些重要的问题，都还有待于进一步的探索。
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上述结果表明，工频磁场确实可以影响胞浆蛋白质酪氨酸磷酸化。从以上蛋白质酪氨酸磷酸化变化的时间性来看，所有对工频磁场产生反应的蛋白质，都在磁场作用5 min内即呈现出酪氨酸磷酸化的改变，而且基本上在30 min内达到变化的高峰，这一结果与Uckun等[6]的研究相一致。因此这些蛋白质酪氨酸磷酸化的变化应属于早期的细胞反应。细胞内蛋白质的磷酸化，尤其是酪氨酸的磷酸化，通常是细胞内蛋白质(如激酶)发生活化并产生功能(如信息转导)的前提。所以这些早期发生酪氨酸磷酸化反应的蛋白质可能介导着晚期的细胞反应，即起细胞信息转导的作用。我们以往的研究结果提示，相同强度的工频磁场可以影响基因的转录[3]。从细胞反应的时间来看，蛋白质酪氨酸磷酸化的变化早于基因转录的改变，磷酸化或脱磷酸化的蛋白质是否可直接影响基因的转录，即两者之间是否存在着直接的联系，过程如何，还有待于进一步的研究。此外，本实验未能确切认识上述蛋白质为何种蛋白质，因此尚不能明确其真实的功能。同时每一种分子量的蛋白质可能包含着一类分子量相同的蛋白质，而且也存在着某些磁场敏感的蛋白质因含量过低而未能测出其酪氨酸磷酸化变化的可能性。因而，在这些方面都很值得作进一步的探讨，我们将逐步深入地进行有关研究。
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* 国家自然科学基金重点项目资助(No.39630100)
参考文献
1 李昌敏， 姜 槐， 付一提，等.工频磁场对细胞缝隙连接通讯功能的影响.中华劳动卫生职业病杂志，1996，14：210.
2 李昌敏， 姜 槐， 付一提，等.工频磁场抑制细胞缝隙连接通讯功能的剂量一效应研究.中华预防医学杂志， 1998，32：142.
3 Wu RY, Chiang H, Fu YT, et al. Use of differential display to identify differentially expressed genes induced by ELF magnetic field. Abstract Book of Twentieth Annual Meeting of BEMS, 1998,216.
, 百拇医药
4 Lindstrom E, Lindstrom P, Berglund A, et al. Intracellular calcium oscillations induced in a T-cell line by a weak 50Hz magnetic field. J Cell Physiol, 1993, 156:395.
5 Barbier E, Dufy B, Veyret B. Stimulation of Ca2+ influx in rat pituitary cells under exposure to a 50Hz magnetic field. Bioelectromagnetics, 1996,17:303.
6 Uckun, FM, Kurosaki T, Jin JZh, et al. Exposure of B-lineage lymphoid cells to low energy electromagnetic fields stimulates Lyn kinase. J Biol Chem, 1995,270:27666.
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7 Beech JA. Bioelectric potential gradients may initiate cell cycling ELF and Zeta potential gradients may mimic this effects. Bioelectromagnetics, 1997, 18:341.
8 Lednev VV. Possible mechanism for the influence of weak magnetic fields on biological system. Bioelectromagnetics, 1991,12:71.
9 刘学永，贺福初，吴祖泽.生长因子及细胞因子的两条主要信号转导通路.生物化学与生物物理学进展，1996，23：4.
10 姚劲松.实验2改良Lowry氏法测定蛋白质含量.见：黄如彬，主编.生物化学实验教程.北京：世界图书出版公司，1995.13.
(1998年11月5日收稿，1999年1月29日修回), http://www.100md.com
单位：孙文均 付一提 鲁德强 姜槐 浙江医科大学微波研究室 (杭州 310031)；余应年 浙江医科大学病理生理学教研室
关键词：电磁场；蛋白质类；酪氨酸；磷酸化
工频磁场对细胞蛋白质酪氨酸磷酸化影响的研究 摘 要 目的：研究50Hz工频磁场对细胞胞浆蛋白质酪氨酸磷酸化的影响，以初步探讨工频磁场生物效应有关细胞信息转导的机制。方法：对分别经两个不同强度的工频磁场(正弦)作不同时间辐照处理后的细胞，提取其胞浆蛋白质，定量后，以Western blot方法测定并比较细胞胞浆蛋白质酪氨酸磷酸化的程度。结果：0.4 mT和0.8 mT两个强度的工频磁场均可影响胞浆蛋白质酪氨酸磷酸化。其中，两个强度都能影响分子量为38、 97.4(×103)蛋白质的酪氨酸磷酸化。此外，0.4 mT强度还可使61.7、105及112(×103)的蛋白质酪氨酸磷酸化发生改变，而0.8 mT强度却使79、150(×103)的蛋白质酪氨酸磷酸化发生变化。并且上述蛋白质酪氨酸磷酸化的变化均存在着时间相关性。结论：提示工频磁场可以使细胞内一些胞浆蛋白质酪氨酸磷酸化产生时间相关性的变化。
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protein tyrosine phosphorylation in culture cells
SUN Wen-Jun, YU Ying-Nian, FU Yi-Ti, LU De-Qiang, JIANG Huai.
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Abstract AIM:To study the effects of the power-frequency magnetic fields on protein tyrosine phosphorylation, and explore the related mechanism of cell signal transduction of power-frequency magnetic fields.METHODS：Chinese hamster lung (CHL) cell line was exposed to power-frequency magnetic fields with two intensities and different exposure time, then cytoplasmic protein was extracted and Western blotting analysis was used to measure and compare the degrees of protein tyrosine phosphorylation.RESULTS：Both 0.4 mT and 0.8 mT power-frequency magnetic fields can affect the protein tyrosine phosphorylation in cultured cells. Both intensities can affect the tyrosine phosphorylation of 38(×103) and 97.4 (×103) molecular weight proteins. In addition, 0.4 mT can affect tyrosine phosphorylation of 61.7, 105 and 112 (×103) molecular weight proteins, but 0.8 mT affects the tyrosine phosphorylation of 79 (×103) and 150 (×103) proteins. Moreover, all the tyrosine phosphorylation changing of these proteins is a time-relative course. CONCLUSION：Power-frequency magnetic fields can cause the time-relative alteration of cellular protein tyrosine phosphorylation.
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MeSH Electromagnetic fields; Proteins; Tyrosine; Phosphorylation
随着电力事业的飞速发展和各种电器设备的广泛应用，人们生活空间中的工频磁场强度日益增加。许多研究表明，工频磁场可以产生广泛的生物效应。为了探索工频磁场生物效应的机理，我们从细胞缝隙连接通讯和基因转录角度进行研究，并发现一定强度的工频磁场不仅可以抑制细胞间的缝隙连接通讯[1，2]，还可以影响基因的转录[3]；一些学者[4，5]从细胞内第二信使Ca2+着手，研究工频磁场的细胞内信息转导过程；Uckun等[6]从细胞Lyn激酶水平来研究；也有从细胞膜电位[7]、或物理作用过程[8]等方面来解释工频磁场生物效应的机制，然而工频磁场产生效应的机制至今尚未能阐明。这不仅影响了对极低频辐射可能危害的认识和防护，也限制了一些有益效应的应用。哺乳类细胞中除了受体-第二信使信息转导通路外，还普遍存在着Ras等重要的信息转导途径，而且这些途径在转导外界信息时常通过蛋白质间级联磷酸化进行的[9]。工频磁场是否可通过蛋白质级联磷酸化过程进行信息转导，国内外在这一方面的研究很少。因此，本研究试图通过测定工频磁场对胞浆蛋白质酪氨酸磷酸化的影响，来初步探索工频磁场可能存在的新的信息转导过程，为进一步研究工频磁场生物效应的有关细胞信息转导机制提供有效的基础资料。
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材料与方法
一、材料：
1.细胞株：中国仓鼠肺成纤维细胞(Chinese hamsterlung cell line, CHL)。
2.主要试剂：Phosphotyrosine western blotting kit.(德国Boehringe Mannheim公司)。
3.主要仪器：凝胶电泳及转膜系统(美国Bio-Rad公司)，光密度扫描仪(瑞典Pharmacia公司)，低温高速离心机(美国Beckman公司)，细胞培养箱(美国Forma公司)，Model 120场强仪(美国)。
4.工频磁场辐照系统：该系统主要由一对边长36 cm、高度8 cm、168匝的Helmholtz线圈，一只等长等高、60匝的中置补偿线圈，两只调压器及细胞培养箱构成。其中，3只线圈相互串联后叠放于细胞培养箱中的铁制屏蔽箱内，线圈的两个端线与培养箱外的调压器相连。3只线圈内的空间区域即构成了一个恒温、均匀、强度于0～0.8 mT之间连续可调的50 Hz正弦磁场辐照区。
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二、方法：
1.细胞培养、分组及处理：CHL细胞在含FCS(15%)、青霉素(100 ×103 U/L)、链霉素(100 mg/L)、卡那霉素(100 mg/L)的MEM培养基、5% CO2及37℃条件下常规培养，3 d (72 h)后作辐照处理。实验分为0.4 mT及0.8 mT两个剂量组，每个剂量组又按不同的辐照时间分为5、10、15、30、60 min及12 h和24 h 7个亚组及假辐照空白对照组。不同时间亚组的细胞于距收获相应的时间放入辐照系统进行处理，于第4 d(96 h)同时收获。
2.细胞蛋白质样品制备：经处理后的细胞立即弃去培养液，4℃PBS洗涤细胞2遍，吸尽残液，每瓶各加2 mL 0.05%胰酶消化1～2 min(4℃)，弃去胰酶并加4 mL PBS制成细胞悬液，将细胞悬液移至5 mL离心管，5000 r/min离心5 min，弃上清后加4 mL PBS重悬细胞，再离心并重复1次。吸尽残液，加预冷细胞裂解液0.5 mL，吹散细胞沉淀，4℃放置60 min,然后于4℃下14 000 r/min离心15 min，取上清备用。
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3.蛋白质定量：以改良Lowry氏法测定蛋白质含量[10]。
4.蛋白质电泳及印迹电转移：按Bio-Rad说明配置SDS-聚丙烯酰胺凝胶(含5%积层胶，12%分离胶)。取含等量蛋白质的样品液，加入1/3体积的点样缓冲液，煮沸3 min，冷却后上样。电泳条件为：80 V 1 h， 160 V 2 h。电泳结束后，取下平板凝胶，按Bio-Rad操作说明进行印迹转膜。条件为：120 mA 60 min。
5.Western blotting分析：转膜后，取下NC膜，用丽春红染色，以观察转膜效果。然后，以去离子水清洗数遍，再作蛋白质印迹杂交：TBS洗膜1 min×2次，室温下封闭液处理30 min后，弃去封闭液，加入anti-phosphotyrosine-POD,置于37℃震荡水浴箱内作用70 min，然后室温下洗膜5 min×6次，弃去洗液，移至暗室，加入化学发光探测试剂，室温下反应1 min，暗盒曝光3～10 min，取出胶片后及时冲洗。光密度扫描仪测定蛋白质条带光密度并以光密度百分值作比较分析。每个强度组重复2次以上。
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(一) 0.4 mT工频磁场对蛋白质酪氨酸磷酸化的影响：经不同时间处理后发现，分子量为38、 61.7、 97.4、 105及112(×103)的蛋白质，其酪氨酸磷酸化的程度发生变化。38(×103)蛋白质磷酸化呈先上升，30 min达到高峰，后缓慢下降的单峰变化过程，变化的幅度很大；97.4 (×103)蛋白质磷酸化呈双峰变化，5 min达到第一高峰，15 min为波谷，12 h再达到高峰，变化的幅度达2倍之差；61.7(×103)蛋白质磷酸化也呈先升后降的单峰形式，10 min达高峰，30 min基本恢复并略有上升，但其变化的幅度不大。112 (×103)蛋白质的变化与61.7(×103)蛋白质相似，而105 (×103)蛋白质的变化却相反。磁场作用后，其磷酸化的程度反而下降，并于30 min达波谷，之后缓慢恢复但未能恢复至对照水平，变化幅度也达2倍之差。(见表1及图1)
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表1 对0.4 mT工频磁场产生反应的蛋白质的相对光密度值
Tab 1 The relative photodensity rate of proteins
that respond to 0.4 mT power-frequency magnetic field
Protein
(×103)
Relative photodensity rate
S
5min
10min
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15min
30min
1h
12h
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17.5
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Fig1 Effects of 0.4 mT power-frequency magnetic
field on protein tyrosine phosphorylation
M:marker; S:sham exposure; P:positive control
图1 0.4 mT工频磁场对蛋白质酪氨酸磷酸化的影响
(二) 0.8 mT工频磁场对蛋白质酪氨酸磷酸化的影响：分子量为38、 79、 97.4及150 (×103)的蛋白质，其酪氨酸磷酸化的程度可受到0.8 mT工频磁场的影响。其中，38 (×103)蛋白质磷酸化呈先略下降，后迅速上升，30 min达到高峰，之后又迅速下降的单峰变化过程，变化的幅度达2倍；97.4 (×103)蛋白质磷酸化也呈单峰变化，表现为15 min达到高峰，24 h时恢复至空白水平。其变化的幅度也达2倍之差；150 (×103)蛋白质磷酸化变化过程与0.4 mT组105 (×103)蛋白质基本一致，但变化的幅度比后者大，达3倍之差。79 (×103)蛋白质酪氨酸磷酸化也呈单峰变化，15 min达到高峰，此后恢复到对照水平，但变化幅度不及150 (×103)蛋白质。(见表2及图2)
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表2 对0.8 mT工频磁场产生反应的蛋白质的相对光密度值
Tab 2 The relative photodensity rate of proteins
that respond to 0.8 mT power-frequency magnetic field
Proteins
(×103)
Relative photodensity rate
S
5min
10min
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15min
30min
1h
12h
24h
150.0
9.0
7.1
6.2
6.6
2.9
4.8
4.2
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3.3
97.4
2.3
2.8
2.7
5.3
4.7
4.1
4.1
2.1
79.0
8.2
12.1
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11.5
13.0
12.6
10.0
9.6
6.9
38.0
0.5
0.3
0.4
0.5
1.0
0.3
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0.2
0.1
Fig 2 Effects of 0.8 mT power-frequency magnetic
field on protein tyrosine phosphorylation
M:marker S:sham exposure P:positive control
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图2 0.8 mT工频磁场对蛋白质酪氨酸磷酸化的影响
讨 论
实验结果经扫描后显示，胞浆中可发生酪氨酸残基磷酸化的蛋白质种类占胞浆总蛋白的比例较大，是胞浆中较为主要的蛋白质。0.4 mT和0.8 mT两个强度及不同时间组之间，酪氨酸残基发生磷酸化的蛋白质种类基本一致，即辐照前后及经不同强度、不同时间处理后，发生酪氨酸磷酸化的蛋白质种类没有增减，因此认为工频磁场作用24 h之内，可能没有新的可发生酪氨酸残基磷酸化的蛋白质的产生或原有蛋白质的消失。
进一步分析显示，两个强度的工频磁场经不同时间作用后，部分胞浆蛋白质酪氨酸磷酸化的程度可发生明显的变化。其中，两个强度都可影响38、97.4 (×103)蛋白质的酪氨酸磷酸化。受两个强度作用后，38 (×103)蛋白质酪氨酸磷酸化的变化比较相似，两者均呈单峰变化过程，都在30 min前达到高峰，之后逐渐下降，而且变化的幅度都达到2倍以上。与之相比，97.4 (×103)的蛋白质磷酸化存在着较大的差异，0.4 mT组呈双峰变化，5 min达到第一高峰，15 min为波谷，12 h再达到高峰，之后恢复到对照水平。而0.8 mT作用后则呈单峰变化，表现为15 min达到高峰，24 h时恢复至空白水平，但变化的幅度也都达2倍之差。此外，两个强度的工频磁场对蛋白质酪氨酸磷酸化的影响也表现出一定的差异：0.4 mT强度还可使61.7、105及112 (×103)蛋白质酪氨酸磷酸化发生改变，而0.8 mT强度却使79及150 (×103)的蛋白质磷酸化发生变化。这一结果提示，细胞内可能存在着一类对工频磁场都能产生反应的共性蛋白质，同时也存在着一些针对不同强度的工频磁场产生特定反应的、特异性较高的蛋白质。Uckun等[6]在研究低能量的电磁场对B淋巴细胞Lyn激酶的影响时，也有相似的结果。然而，这些产生共性与特异性反应的蛋白质，是否普遍存在于每个细胞株，以及这些蛋白质的具体属性、功能和作用等一些重要的问题，都还有待于进一步的探索。
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上述结果表明，工频磁场确实可以影响胞浆蛋白质酪氨酸磷酸化。从以上蛋白质酪氨酸磷酸化变化的时间性来看，所有对工频磁场产生反应的蛋白质，都在磁场作用5 min内即呈现出酪氨酸磷酸化的改变，而且基本上在30 min内达到变化的高峰，这一结果与Uckun等[6]的研究相一致。因此这些蛋白质酪氨酸磷酸化的变化应属于早期的细胞反应。细胞内蛋白质的磷酸化，尤其是酪氨酸的磷酸化，通常是细胞内蛋白质(如激酶)发生活化并产生功能(如信息转导)的前提。所以这些早期发生酪氨酸磷酸化反应的蛋白质可能介导着晚期的细胞反应，即起细胞信息转导的作用。我们以往的研究结果提示，相同强度的工频磁场可以影响基因的转录[3]。从细胞反应的时间来看，蛋白质酪氨酸磷酸化的变化早于基因转录的改变，磷酸化或脱磷酸化的蛋白质是否可直接影响基因的转录，即两者之间是否存在着直接的联系，过程如何，还有待于进一步的研究。此外，本实验未能确切认识上述蛋白质为何种蛋白质，因此尚不能明确其真实的功能。同时每一种分子量的蛋白质可能包含着一类分子量相同的蛋白质，而且也存在着某些磁场敏感的蛋白质因含量过低而未能测出其酪氨酸磷酸化变化的可能性。因而，在这些方面都很值得作进一步的探讨，我们将逐步深入地进行有关研究。
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* 国家自然科学基金重点项目资助(No.39630100)
参考文献
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10 姚劲松.实验2改良Lowry氏法测定蛋白质含量.见：黄如彬，主编.生物化学实验教程.北京：世界图书出版公司，1995.13.
(1998年11月5日收稿，1999年1月29日修回), http://www.100md.com