锌缺乏对大鼠阴茎海绵体一氧化氮合酶Ⅰ的影响
作者：王德才 徐红岩 周序斌 周利军
单位：王德才 徐红岩 周序斌 周利军 山东医科大学基础医学院药理学教研室(济南 250012)；王德才 山东省枣庄卫校(枣庄277101)
关键词：锌；缺乏；睾酮；阴茎；一氧化氮；免疫组织化学
中国病理生理杂志990816 摘 要 目的和方法：缺锌饲养大鼠5周，复制缺锌模型，采用免疫组化染色观察缺锌对阴茎海绵体一氧化氮合酶Ⅰ(NOS1)的影响。结果：缺锌组大鼠生长发育迟缓，血浆及睾丸内睾酮含量和阴茎海绵体NOS1水平显著低于锌适量组和对饲组。结论：锌缺乏可抑制睾酮合成，降低阴茎海绵体NOS1水平。
Effect of zinc deficiency on nitric oxide synthase Ⅰ
, 百拇医药
in corpus cavernosum penis of rats
WANG De-Cai,XU Hong-Yan,ZHOU Xu-Bin,ZHOU Li-Jun
Department of Pharmacology,Shandong Medical University,Jinan(250012)
Abstract AIM and METHODS： Thirty male Wistar rats were randomly divided into three groups which were given the synthetic diets for 5 weeks.The effect of zinc deficiency (ZD)on nitric oxide synthase Ⅰ(NOS1)in the corpus cavernosum penis (CCP) was observed by means of immunohistochemistry.RESULTS：Zinc contents in plasma and organs of ZD rats decreased significantly.The growth and development were retarded.The contents of testosterone in plasma and testis,and NOS1 level in CCP of ZD group were all lower than those of adequate zinc fed (AF) or pair-fed (PF) groups.Testosterone content in testis and NOS1 level in CCP of PF group were lower,compared with AF group.CONCLUSION：Zinc deficiency could inhibit testosterone synthesis and reduce NOS1level in CCP,which is due to a combination of a non-specific effect caused by the low food intake and a specific effect due to zinc deficiency.
, 百拇医药
MeSH Zinc,deficiency;Testosterone;Penis;Nitric oxide;Immunohistochemistry
一氧化氮(nitric oxide,NO)作为一种新型神经介质，在生殖系统中的作用愈来愈受重视，阴茎勃起机理的NO调控论已被许多学者接受[1，2]。因NO的不稳定性，许多研究则集中于一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)[2]。NOS有3种同工酶，存在于神经元胞浆中的NOSⅠ型(NOS1)与阴茎勃起的关系尤为密切[3]。锌具有广泛的生物学效应，锌缺乏导致性功能障碍已被大量实验及临床资料所证实[4]。本文利用缺锌大鼠模型，观察缺锌对阴茎海绵体NOS1的影响，旨在探讨缺锌导致性功能障碍的机制。
材料与方法
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1.复制动物模型：3周龄雄性Wistar大鼠30只，体重60～80 g，山东省卫生防疫站实验动物中心提供。适应性饲养1周后，随机分成3组，每组10只。缺锌组(zinc deficiency,ZD)自由食用缺锌饲料(参考Flanagan配方配制[5]，含锌1.56 mg/kg);锌适量组(adequate zinc fed,AF)自由食用含锌饲料(在缺锌饲料基础上添加硫酸锌，含锌49.80 mg/kg);对饲组(pair-fed,PF)食用含锌饲料，但食量控制为ZD组前1天的平均进食量。各组动物喂饲实验饲料5周。自由饮用蒸馏水(含锌<0.01 mg/L)。室温24℃左右，光照12 h，人工控制。
2.锌含量测定：样品经相应预处理后，用日本Z—8000型原子吸收分光光度计测定。大鼠血浆锌平均回收率96.3%，变异系数2.34%。
3.睾酮含量测定：放射免疫法。睾酮放免测试盒由中美合资九鼎医学生物工程有限公司提供。血浆及睾丸组织匀浆离心后的上清液，按试剂盒方法测定。
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4.阴茎海绵体NOS1水平检测：大鼠活杀后即刻取阴茎中段组织，经OCT包理，液氮冷冻，制成5 μm厚冰冻切片，裱在预处理的载玻片上，用链霉菌抗生物素蛋白—过氧化物酶(streptavidin-peroxidase,SP)法进行免疫组化染色。步骤：①3%过氧化氢孵化5 min，磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline,PBS)洗片5 min，重复3次。②1∶100正常血清封闭，室温下孵育30 min。③滴加1：50NOS1抗体，37℃孵育60 min。④PBS洗片后加入1∶100生物素标记的第二抗体，37℃孵育30 min。⑤PBS洗片，滴加1∶100 SP，37℃孵育30 min。⑥PBS洗片后DAB显色，苏木素复染。用PBS代替NOS1抗体作为阴性对照。光镜观察并计数随意5个高倍(×400)视野中阳性染色的神经纤维总和。SP药盒为美国Zymed公司产品，NOS1抗体为美国Santa Cruz公司产品，均购自北京中山公司。
, 百拇医药
结 果
1.大鼠一般情况的变化：实验前三组大鼠体重无显著差异。饲养过程中ZD大鼠摄食摄水量逐渐减少，生长缓慢，皮毛杂乱稀疏无光泽，活动性差，5周后体重(166.8±16.1) g显著低于AF组(297.2±19.4) g显著低于AF组(2.113±0.068) nmol/L,(33.50±1.69) ng/g和PF组(223.9±24.1) g，均P<0.01。
2.血浆及器官锌含量变化：ZD大鼠血浆及肝、肾、睾丸锌含量均显著低于AF和PF组，均P<0.01。PF组仅见肝锌略低于AF组(P<0.05)。见表1。
表1 大鼠血浆及器官锌含量变化
Tab 1 The changes of zinc contents in plasma and organs of the rats (μmol/L,μmol/g,
±s) Group
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Plasma
(n=10)
Liver
(n=6)
Kidney
(n=6)
Testis
(n=6)
AF
21.0±4.68
0.479±0.037
0.395±0.030
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0.385±0.025
PF
20.38±3.07
0.415±0.035*
0.376±0.029
0.396±0.021
ZD
6.62±1.41**ΔΔ
0.266±0.020**ΔΔ
0.260±0.017**ΔΔ
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0.305±0.013**ΔΔ
*P<0.05,**P<0.01，vs AF group;ΔΔP<0.01，vs PF group
3.血浆及睾丸睾酮含量变化：ZD大鼠血浆睾酮浓度(0.448±0.077) nmol/L和睾丸内睾酮含量(7.83±2.07) ng/g显著低于AF组(2.113±0.068) nmol/L,(33.50±1.69) ng/g和PF组(1.652±0.070) nmol/L,(19.82±1.79) ng/g,均P<0.01。PF组睾丸内睾酮含量亦低于AF组(P<0.05)。
4.阴茎海绵体NOS1水平变化：AF大鼠阴茎海绵体中，可见大量棕黄色的阳性染色，即含NOS1的神经纤维，分布于血管和窦状隙周围及小梁内的平滑肌束。在阴性对照中无神经纤维着色。PF大鼠的阳性染色亦见减少。ZD大鼠仅见少量阳性染色分布于窦状隙周围。见图1。在5个高倍视野中阳性染色的神经纤维数，ZD组(41.20±6.27)显著低于AF组(112.70±11.10)和PF组(84.90±12.08),均P<0.01。PF组与AF组相比也有显著差异(P<0.01)。
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Fig 1 Immunohistochemical staining of NOS1 in corpus cavernosum penis of rats (×400)
a.Negative control; b. AF group; c. PF group; d. ZD group
图1 大鼠阴茎海绵体NOS1免疫组化染色
讨 论
Flanagan的缺锌饲料配方保证了蛋白质、糖、脂肪、维生素、矿物质及锌以外微量元素的摄入及营养的需要，因此本动物模型的变化仅受锌的影响。根据ZD大鼠的一般表现及锌含量指标显著降低，说明缺锌大鼠模型是成功的。
实验显示缺锌可抑制食欲，降低动物摄食量，抑制生长发育。PF大鼠因食量被控制，生长发育也迟于AF组，但锌储备减少不明显，睾丸锌仍与AF组相似。然睾丸内睾酮含量和阴茎海绵体NOS1水平则显著低于AF组，与其摄食量相同的ZD组差异更显著。由此我们认为ZD大鼠睾酮含量和NOS1水平的显著下降由两方面因素构成：一是生殖器官尤其睾丸内锌缺乏产生的直接作用；二是缺锌引起食欲减退，热量摄入不足造成的间接影响。睾丸组织内锌缺乏导致酶活性的改变，以及蛋白质、脂质和核酸的氧化损伤增强等[6]，均可导致睾酮合成障碍。另外，血浆睾酮的下降也与缺锌时睾酮在肝脏内转化为雌二醇增加有关[7]。
, 百拇医药
在阴茎的螺旋动脉和海绵体平滑肌肌有一氧化氮能神经(nitrergic nerve)分布。存在于神经元胞浆中的NOS1专一性催化L-精氨酸转化为L-胍氨酸和NO[3]。目前认为在受外界影响的心理和生理因素刺激下，支配阴茎海绵体平滑肌和血管的神经释放NO，NO进入平滑肌细胞，激活鸟苷酸环化酶，导致cGMP形成，进而引起平滑肌舒张，海绵体充血，使阴茎勃起[1](即通过NO-cGMP系统实现阴茎勃起)。实验证明睾酮能显著提高阴茎中NOS蛋白量和活性[8]。因此，本实验中ZD大鼠阴茎海绵体NOS1水平降低的主要原因可能是血浆睾酮浓度降低的结果。另外，雄激素受体是一种调节基因表达的锌结合蛋白[9]，缺锌可能干扰雄激素受体—效应偶联，使睾酮诱导的功能蛋白质如NOS1合成减少。阴茎组织的NO—cGMP系统缺陷在性功能减退和阳痿的发病中占重要地位，NOS mRNA表达减少可能导致该系统缺陷[10]。阴茎海绵体NOS1水平降低，诱发或加重NO—cGMP系统缺陷，可能是缺锌导致性功能减退的机制之一。
, 百拇医药
参考文献
1 Burnett AL.Nitric oxide control of lower genitourinary tract functions:A review.Urology,1995,45:1071.
2 白文俊，朱积川，王晓峰.氧化氮与阳茎勃起.中华泌尿外科杂志，1995，16：178.
3 Rand ML,Li CG.Nitric oxide as a neurotransmitter in the peripheral nerves:nature of transmitter and mechanism of transmission.Annu Rev Physiol,1995,57:659.
4 Vallee BL,Falchuk KH.Biochemical basis of zinc physiology.Physiol Rev,1993,73:79.
, 百拇医药
5 Flanagan PR.A model to produce pure zinc deficiency in rats and its use to demonstrate that dietary phytate increases the excretion of endogenous zinc.J Nutr,1984,114:493.
6 Oteiza PI,Olin KL,Fraga CG, et al.Zinc deficiency causes oxidative damage to proteins, lipids and DNA in rat testes.J Nutr,1995,125:823.
7 Om AS,Chung K W.Dietary zinc deficiency alters 5 alpha-reduction and aromatization of testosterone and androgen and estrogen receptors in rat liver.J Nutr,1996,126:842.
, 百拇医药
8 Chamness SL,Ricker DD,Crone JK,et al.The effect of androgen on nitric oxide synthase in the male reproductive tract of the rat.Fertil Steril,1995,63:1101.
9 岑小波.锌与基因表达.国外医学卫生学分册，1996，23：257.
10 高冰，薛兆英，李倩虹，等.大鼠阴茎组织—氧化氮合成酶基因表达的检测及意义.中华泌尿外科杂志，1996，17：171.
(1997年12月24日收稿，1998年11月2日修回), 百拇医药
单位：王德才 徐红岩 周序斌 周利军 山东医科大学基础医学院药理学教研室(济南 250012)；王德才 山东省枣庄卫校(枣庄277101)
关键词：锌；缺乏；睾酮；阴茎；一氧化氮；免疫组织化学
中国病理生理杂志990816 摘 要 目的和方法：缺锌饲养大鼠5周，复制缺锌模型，采用免疫组化染色观察缺锌对阴茎海绵体一氧化氮合酶Ⅰ(NOS1)的影响。结果：缺锌组大鼠生长发育迟缓，血浆及睾丸内睾酮含量和阴茎海绵体NOS1水平显著低于锌适量组和对饲组。结论：锌缺乏可抑制睾酮合成，降低阴茎海绵体NOS1水平。
Effect of zinc deficiency on nitric oxide synthase Ⅰ
, 百拇医药
in corpus cavernosum penis of rats
WANG De-Cai,XU Hong-Yan,ZHOU Xu-Bin,ZHOU Li-Jun
Department of Pharmacology,Shandong Medical University,Jinan(250012)
Abstract AIM and METHODS： Thirty male Wistar rats were randomly divided into three groups which were given the synthetic diets for 5 weeks.The effect of zinc deficiency (ZD)on nitric oxide synthase Ⅰ(NOS1)in the corpus cavernosum penis (CCP) was observed by means of immunohistochemistry.RESULTS：Zinc contents in plasma and organs of ZD rats decreased significantly.The growth and development were retarded.The contents of testosterone in plasma and testis,and NOS1 level in CCP of ZD group were all lower than those of adequate zinc fed (AF) or pair-fed (PF) groups.Testosterone content in testis and NOS1 level in CCP of PF group were lower,compared with AF group.CONCLUSION：Zinc deficiency could inhibit testosterone synthesis and reduce NOS1level in CCP,which is due to a combination of a non-specific effect caused by the low food intake and a specific effect due to zinc deficiency.
, 百拇医药
MeSH Zinc,deficiency;Testosterone;Penis;Nitric oxide;Immunohistochemistry
一氧化氮(nitric oxide,NO)作为一种新型神经介质，在生殖系统中的作用愈来愈受重视，阴茎勃起机理的NO调控论已被许多学者接受[1，2]。因NO的不稳定性，许多研究则集中于一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)[2]。NOS有3种同工酶，存在于神经元胞浆中的NOSⅠ型(NOS1)与阴茎勃起的关系尤为密切[3]。锌具有广泛的生物学效应，锌缺乏导致性功能障碍已被大量实验及临床资料所证实[4]。本文利用缺锌大鼠模型，观察缺锌对阴茎海绵体NOS1的影响，旨在探讨缺锌导致性功能障碍的机制。
材料与方法
, http://www.100md.com
1.复制动物模型：3周龄雄性Wistar大鼠30只，体重60～80 g，山东省卫生防疫站实验动物中心提供。适应性饲养1周后，随机分成3组，每组10只。缺锌组(zinc deficiency,ZD)自由食用缺锌饲料(参考Flanagan配方配制[5]，含锌1.56 mg/kg);锌适量组(adequate zinc fed,AF)自由食用含锌饲料(在缺锌饲料基础上添加硫酸锌，含锌49.80 mg/kg);对饲组(pair-fed,PF)食用含锌饲料，但食量控制为ZD组前1天的平均进食量。各组动物喂饲实验饲料5周。自由饮用蒸馏水(含锌<0.01 mg/L)。室温24℃左右，光照12 h，人工控制。
2.锌含量测定：样品经相应预处理后，用日本Z—8000型原子吸收分光光度计测定。大鼠血浆锌平均回收率96.3%，变异系数2.34%。
3.睾酮含量测定：放射免疫法。睾酮放免测试盒由中美合资九鼎医学生物工程有限公司提供。血浆及睾丸组织匀浆离心后的上清液，按试剂盒方法测定。
, 百拇医药
4.阴茎海绵体NOS1水平检测：大鼠活杀后即刻取阴茎中段组织，经OCT包理，液氮冷冻，制成5 μm厚冰冻切片，裱在预处理的载玻片上，用链霉菌抗生物素蛋白—过氧化物酶(streptavidin-peroxidase,SP)法进行免疫组化染色。步骤：①3%过氧化氢孵化5 min，磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline,PBS)洗片5 min，重复3次。②1∶100正常血清封闭，室温下孵育30 min。③滴加1：50NOS1抗体，37℃孵育60 min。④PBS洗片后加入1∶100生物素标记的第二抗体，37℃孵育30 min。⑤PBS洗片，滴加1∶100 SP，37℃孵育30 min。⑥PBS洗片后DAB显色，苏木素复染。用PBS代替NOS1抗体作为阴性对照。光镜观察并计数随意5个高倍(×400)视野中阳性染色的神经纤维总和。SP药盒为美国Zymed公司产品，NOS1抗体为美国Santa Cruz公司产品，均购自北京中山公司。
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结 果
1.大鼠一般情况的变化：实验前三组大鼠体重无显著差异。饲养过程中ZD大鼠摄食摄水量逐渐减少，生长缓慢，皮毛杂乱稀疏无光泽，活动性差，5周后体重(166.8±16.1) g显著低于AF组(297.2±19.4) g显著低于AF组(2.113±0.068) nmol/L,(33.50±1.69) ng/g和PF组(223.9±24.1) g，均P<0.01。
2.血浆及器官锌含量变化：ZD大鼠血浆及肝、肾、睾丸锌含量均显著低于AF和PF组，均P<0.01。PF组仅见肝锌略低于AF组(P<0.05)。见表1。
表1 大鼠血浆及器官锌含量变化
Tab 1 The changes of zinc contents in plasma and organs of the rats (μmol/L,μmol/g,
±s) Group, http://www.100md.com
Plasma
(n=10)
Liver
(n=6)
Kidney
(n=6)
Testis
(n=6)
AF
21.0±4.68
0.479±0.037
0.395±0.030
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0.385±0.025
PF
20.38±3.07
0.415±0.035*
0.376±0.029
0.396±0.021
ZD
6.62±1.41**ΔΔ
0.266±0.020**ΔΔ
0.260±0.017**ΔΔ
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0.305±0.013**ΔΔ
*P<0.05,**P<0.01，vs AF group;ΔΔP<0.01，vs PF group
3.血浆及睾丸睾酮含量变化：ZD大鼠血浆睾酮浓度(0.448±0.077) nmol/L和睾丸内睾酮含量(7.83±2.07) ng/g显著低于AF组(2.113±0.068) nmol/L,(33.50±1.69) ng/g和PF组(1.652±0.070) nmol/L,(19.82±1.79) ng/g,均P<0.01。PF组睾丸内睾酮含量亦低于AF组(P<0.05)。
4.阴茎海绵体NOS1水平变化：AF大鼠阴茎海绵体中，可见大量棕黄色的阳性染色，即含NOS1的神经纤维，分布于血管和窦状隙周围及小梁内的平滑肌束。在阴性对照中无神经纤维着色。PF大鼠的阳性染色亦见减少。ZD大鼠仅见少量阳性染色分布于窦状隙周围。见图1。在5个高倍视野中阳性染色的神经纤维数，ZD组(41.20±6.27)显著低于AF组(112.70±11.10)和PF组(84.90±12.08),均P<0.01。PF组与AF组相比也有显著差异(P<0.01)。
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Fig 1 Immunohistochemical staining of NOS1 in corpus cavernosum penis of rats (×400)
a.Negative control; b. AF group; c. PF group; d. ZD group
图1 大鼠阴茎海绵体NOS1免疫组化染色
讨 论
Flanagan的缺锌饲料配方保证了蛋白质、糖、脂肪、维生素、矿物质及锌以外微量元素的摄入及营养的需要，因此本动物模型的变化仅受锌的影响。根据ZD大鼠的一般表现及锌含量指标显著降低，说明缺锌大鼠模型是成功的。
实验显示缺锌可抑制食欲，降低动物摄食量，抑制生长发育。PF大鼠因食量被控制，生长发育也迟于AF组，但锌储备减少不明显，睾丸锌仍与AF组相似。然睾丸内睾酮含量和阴茎海绵体NOS1水平则显著低于AF组，与其摄食量相同的ZD组差异更显著。由此我们认为ZD大鼠睾酮含量和NOS1水平的显著下降由两方面因素构成：一是生殖器官尤其睾丸内锌缺乏产生的直接作用；二是缺锌引起食欲减退，热量摄入不足造成的间接影响。睾丸组织内锌缺乏导致酶活性的改变，以及蛋白质、脂质和核酸的氧化损伤增强等[6]，均可导致睾酮合成障碍。另外，血浆睾酮的下降也与缺锌时睾酮在肝脏内转化为雌二醇增加有关[7]。
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在阴茎的螺旋动脉和海绵体平滑肌肌有一氧化氮能神经(nitrergic nerve)分布。存在于神经元胞浆中的NOS1专一性催化L-精氨酸转化为L-胍氨酸和NO[3]。目前认为在受外界影响的心理和生理因素刺激下，支配阴茎海绵体平滑肌和血管的神经释放NO，NO进入平滑肌细胞，激活鸟苷酸环化酶，导致cGMP形成，进而引起平滑肌舒张，海绵体充血，使阴茎勃起[1](即通过NO-cGMP系统实现阴茎勃起)。实验证明睾酮能显著提高阴茎中NOS蛋白量和活性[8]。因此，本实验中ZD大鼠阴茎海绵体NOS1水平降低的主要原因可能是血浆睾酮浓度降低的结果。另外，雄激素受体是一种调节基因表达的锌结合蛋白[9]，缺锌可能干扰雄激素受体—效应偶联，使睾酮诱导的功能蛋白质如NOS1合成减少。阴茎组织的NO—cGMP系统缺陷在性功能减退和阳痿的发病中占重要地位，NOS mRNA表达减少可能导致该系统缺陷[10]。阴茎海绵体NOS1水平降低，诱发或加重NO—cGMP系统缺陷，可能是缺锌导致性功能减退的机制之一。
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参考文献
1 Burnett AL.Nitric oxide control of lower genitourinary tract functions:A review.Urology,1995,45:1071.
2 白文俊，朱积川，王晓峰.氧化氮与阳茎勃起.中华泌尿外科杂志，1995，16：178.
3 Rand ML,Li CG.Nitric oxide as a neurotransmitter in the peripheral nerves:nature of transmitter and mechanism of transmission.Annu Rev Physiol,1995,57:659.
4 Vallee BL,Falchuk KH.Biochemical basis of zinc physiology.Physiol Rev,1993,73:79.
, 百拇医药
5 Flanagan PR.A model to produce pure zinc deficiency in rats and its use to demonstrate that dietary phytate increases the excretion of endogenous zinc.J Nutr,1984,114:493.
6 Oteiza PI,Olin KL,Fraga CG, et al.Zinc deficiency causes oxidative damage to proteins, lipids and DNA in rat testes.J Nutr,1995,125:823.
7 Om AS,Chung K W.Dietary zinc deficiency alters 5 alpha-reduction and aromatization of testosterone and androgen and estrogen receptors in rat liver.J Nutr,1996,126:842.
, 百拇医药
8 Chamness SL,Ricker DD,Crone JK,et al.The effect of androgen on nitric oxide synthase in the male reproductive tract of the rat.Fertil Steril,1995,63:1101.
9 岑小波.锌与基因表达.国外医学卫生学分册，1996，23：257.
10 高冰，薛兆英，李倩虹，等.大鼠阴茎组织—氧化氮合成酶基因表达的检测及意义.中华泌尿外科杂志，1996，17：171.
(1997年12月24日收稿，1998年11月2日修回), 百拇医药