反义bcl-2 DNA促进裸鼠荷人鼻咽癌细胞株CNE2-baxα凋亡*
作者：张清秀 朱振宇 吴金浪 周宁宁 马涧泉
单位：
张清秀 朱振宇 马涧泉 中山医科大学 生物化学教研室；周宁宁 肿瘤防治中心；吴金浪 电镜室(广州 510089)
关键词：基因；鼻咽肿瘤；寡核苷酸类；反义；小鼠；裸
中国病理生理杂志990812 摘 要 目的：在裸鼠活体水平上观察bcl-2反义寡聚核苷酸(antisense oligodeoxynucleotide, ASON)对鼻咽癌细胞株CNE2-baxα凋亡的影响。方法：DNA合成仪合成22nt ASON片段，RT-PCR检测bcl-2表达，电镜观察细胞凋亡。结果：反义bcl-2 DNA片段局部注射CNE2-baxα致瘤组织，RT-PCR检测肿瘤组织中bcl-2表达被封闭，电镜观察视野下可见大量癌细胞凋亡，癌细胞数目减少，细胞间组织大量纤维化；凋亡的癌细胞电子密度增加，具典型凋亡特征。反义bcl-2封闭1周，抑瘤率74.4%，第2周为46.0%。结论：反义bcl-2抑制鼻咽癌细胞株CNE2-baxα致瘤性，促进细胞凋亡。
, 百拇医药
Antisense bcl-2 DNA enhances apoptosis of nasopharyngeal
carcinoma cell line CNE2-baxα habouring in nude mice
ZHANG Qing-Xiu ZHU Zhen-Yu
Dept. of Biochemistry,WU Jin-Lang
Electron Microscopy Laboratory
ZHOU Ning-Ning, MA Jian-Quan
Sun-Yat-sen University of Medical Sciences, Guangzhou(510089)
, 百拇医药
Abstract AIM: To observe the effect of bcl-2 antisense oligod eoxynucleotide (ASON) on nude mice habouring tumor by inoculated human nasopharyngeal carcinoma cell line CNE2-baxα. METHOD: 22nt bcl-2 ASON was synthesized using DNA synthesizer. Apoptosis of neoplastic cells were observed with electron microscopy. RESULTS: Tumors were growing after CNE2 baxα cells were subcutaneously inoculated in nude mice. Suppression of bcl-2 expression was verified with RT-PCR assay after bcl-2 ASON was injected into the tumors. We also identified by electron microscopy that after ASON treatment large amount of tumor cells underwent apoptosis and the number of tumor cells reduced. The electron density of apoptotic cells was increased and apoptotic bodies formed.7 days after antisense bcl-2 DNA injection, the tumor-inhibiting rate was 74.4%, 14 days after, the rate was 46.0%. CONCLUSION:Antisense bcl-2 DNA inhibits the CNE2-baxα tumor growth and enhances apoptosis of CNE2-baxα cells.
, http://www.100md.com
MeSH Genes; Nasopharyngeal neoplasms; Oligonucleotides, antisense; Mice, nude
80年代初发现反义RNA，随后又发现反义寡聚脱氧核苷酸(antisense oligodeoxynucleotide, ASON)可抑制有害基因的表达，无论在细胞水平，还是个体水平，它的调节作用均已被证实。反义bcl-2寡聚核苷酸可抑制正常骨髓干细胞和白血病细胞中bcl-2的表达，缩短细胞生存期；减少培养中细胞形成克隆的数目[1,2]。但是反义bcl-2抑制基因表达在鼻咽癌细胞尤其是活体水平的研究未见报道。bcl-2与bax是互相拮抗的蛋白，bcl-2能使细胞生存期延长和抵抗凋亡，bax促进细胞凋亡[3]。本研究设计将反义的bcl-2 DNA直接注入CNE2-baxα细胞株接种形成的肿瘤组织，研究bcl-2被封闭后肿瘤组织细胞的变化。
, http://www.100md.com 材料与方法
一、材料：
1. 细胞株CNE2-baxα，本研究室将凋亡基因baxα导入CNE2细胞获得[4]。
2. BALB/c裸鼠，4～6周龄，本校实验动物中心提供。
3. ASON片段：根据bcl-2 cDNA序列选择第264～285的22个核苷酸为靶序列，由上海细胞研究所合成，序列为5’GGTGCCCACCTGTGGTCCACCTG3’，溶于生理盐水，参照文献[2]，确定ASON浓度为45 μmol/L，即为反义bcl-2 DNA溶液。
二、方法：
1.接种肿瘤细胞：CNE2-baxα细胞培养至3×106个细胞，体积0.5 mL，注射入裸鼠颈背部皮下，1周后，取肿瘤组织剪成1 mm×1 mm×1 mm大小接种于16只裸鼠颈部双侧皮下。
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2. 给药：接种1周后，量取肿瘤组织大小为5 mm×3 mm，并将45 μmol/L反义bcl-2 DNA 50 μL注入右侧肿瘤组织[5]。左侧注入生理盐水对照，隔周测量双侧肿瘤大小。用公式(1)/(2)LW2(L为肿瘤长径，W为肿瘤横径)计算肿瘤重量[6]。
抑瘤率=
×100%
3. RT-PCR检测bcl-2封闭情况：注射反义bcl-2 DNA后1周取肿瘤组织，参照文献[4]，抽提总RNA，检测其中mRNA 水平bcl-2的表达。
4 电镜观察癌细胞凋亡：反义bcl-2 DNA注射1周后，取两侧肿瘤组织块，2.5%戊二醛预固定，固定，磷酸-蔗糖缓冲液漂洗过夜，1%锇酸固定，系列乙醇-丙酮脱水，Epon812包埋，超薄切片，醋酸铀、柠檬酸铅复染，HITACHI电镜观察。
, 百拇医药
结 果
一、RT-PCR检测肿瘤组织中bcl-2封闭的效果：
反义bcl-2 DNA处理1周后，抽提对照组与试验组肿瘤组织总RNA, RT-PCR测定。
图1显示，在对照组中的较明显的bcl-2 459bp条带，在试验组中未出现，说明肿瘤组织bcl-2的表达被反义片段封闭。
Fig 1 RT-PCR analysis of bcl-2 mRNA in tumor
1. DNA Marker; 2.RT-PCR of bcl-2 and β-actin in control group；3.RT-PCR results of bcl-2 in experimental group (negative)；4.RT-PCR of β-actin as control in experimental group
, 百拇医药
图1 RT-PCR扩增肿瘤组织bcl-2 mRNA 电泳分析
二、 反义bcl-2的抑瘤率：
反义bcl-2 DNA片段溶液注射入肿瘤组织后，分别于7、14 d量取双侧肿瘤大小，计算瘤重结果如表1。
表1 反义bcl-2的抑瘤作用
Tab 1 Antisense bcl-2 inhibits tumor growth (
±s) Group
Time(d)
Number of
sample
, http://www.100md.com
Tumor
weight(mg)
Tumor-inhibiting
rate(%)
Group A
7
16
418±55
—
Control
14
14
931±139
, 百拇医药
—
Group B
7
16
107±7
74.4
Experiment
14
14
502±8
46.0
表1结果说明对于CNE2-baxα细胞形成的肿瘤组织，反义bcl-2的封闭作用第1周的抑瘤率74.4%，第2周的抑瘤率达46.0%。反义bcl-2表现出强的抑制肿瘤生长作用。
, 百拇医药
三、 电镜观察bcl-2表达被封闭后肿瘤细胞凋亡情况：
电镜下观察，bcl-2表达被封闭后，视野下可见鼻咽癌细胞大面积发生凋亡，如图2所示。
Fig 2 Tumor cell (2a EM×3000) compared with normal cells (2bEM×4000),tumor cells shrink, cells become smaller, chromosomes accumulate under nuclear membrane. The electron density of apoptotic tumor cells increases, apoptotic body forms, but membrane in cell is intact(2a EM×3000).Fibrosis forms in intercellular tissues, number of tumor cells reduce (2c EM×3000)
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图2 bcl-2表达被封闭后电镜观察结果
讨 论
最早发现于滤泡淋巴瘤的bcl-2原癌基因，编码一种26 kD蛋白质，定位于线粒体内膜、内质网和核膜上，转染bcl-2细胞株在生长因子缺乏的培养基中生存时间延长，还对化疗药物诱导的凋亡具高度抗性[7,8]。
最近研究显示，bcl-2在上皮细胞中与LMP1的共表达可抗LMP1过表达对细胞的毒性作用，延长细胞在低浓度血清下的生存期；该细胞能在半固体软琼脂培养基中形成克隆[9]。免疫组化分析bcl-2存在于80%鼻咽癌组织中，特别存在于与EB病毒密切相关的低分化的鼻咽癌组织[10]，说明bcl-2在鼻咽癌组织中的重要性。
我们已成功将baxα导入低分化鼻咽癌细胞株，并获得baxα稳定表达的CNE2-baxα细胞株，并证实无血清诱导凋亡条件下baxα的加强表达可促进细胞凋亡，但凋亡率不高，仅为6.1%～11.3%，说明此时baxα的促进凋亡效应未得到有效发挥。因而本研究采用反义bcl-2 DNA局部注射CNE2-baxα株致瘤的鼻咽癌组织，观察到反义bcl-2 DNA明显抑制肿瘤的生长，bcl-2的表达被有效封闭，电镜观察大量肿瘤细胞发生凋亡，肿瘤组织大面积纤维化，研究结果提示，bcl-2在鼻咽癌肿瘤失控生长中起着关键作用。当bcl-2被封闭后无须任何刺激即可启动凋亡，其精确机理还须进一步研究。推测bcl-2的表达可能部分与鼻咽癌复杂的肿瘤发生机理有关。
, http://www.100md.com
本实验结果证明反义bcl-2 DNA可有效抑制鼻咽肿瘤生长，为基因治疗肿瘤提供了一个可能的途径。
* 国家教委博士点基金资助
参考文献
1 McManaway ME, Neckers LM, Loke SL, et al. Tumor-specific inhibition of lymphoma growth by an antisense oligodeoxynucleotide. Lancet, 1990,335:808.
2 张涛，孙秉中，王成济，等. bcl-2反义寡聚脱氧核苷酸抑制HL-60细胞生长的研究.实验血液学杂志，1996，4(4)：353.
3 Oltvai ZN, Milliman CT, Korsmeyer SJ. BclV-2 heterodimerizes in vivo with a conserved homolog, bax, that accelerates programmed cell death. Cell, 1993,74:609.
, http://www.100md.com
4 张清秀， 朱振宇， 孔庆瑜，等.baxα 加强表达促进鼻咽癌细胞CNE2株凋亡.中国病理生理杂志， 1999，15(6)：502.
5 Bijsterbosch MK, Manoharan M, Rump ET, et al. In vivo fate of phosphorothioate antisense oligodeoxynucleotides: predominant uptake by scavenger receptors on endothelial liver cells. Nucleic Acids Res, 1997, 25(16): 3290.
6 Wang J, Sun L, Myeroff L, et al. Demonstration that mutation of the type II transforming growth factor β receptor inactivates is tumor suppressor activity in replication error positive colon carcinoma cells. J Biol Chem,1995,270:22044.
, http://www.100md.com
7 Nunez G, London L, Hockenberg D, et al. Deregulated bcl-2 gene expression selectively prolongs survival of growth factor-deprived hemopoietic cell lines. J Immunol,1990,144:3602.
8 Miyashita T, Reed J C. bcl-2 oncoprotein blocks chemotherapy induced apoptosis in a human leukemia cell line. Blood,1995,81:151.
9 Lu JJ, Chen JY, et al. Cooperative interaction between Bcl-2 and Epstein-Barr virus latent membrane protein l in the growth transformation of human epithelial cells. J Gen Virol,1997,78:2975.
10 Lu QL, Elia G, Lucas S, et al. bcl-2 proto-oncogene expression Epstein-Barr virus-associated nasopharyngeal carcinoma. Inter J Cancer,1993,53:29.
(1999年元月11日收稿，1999年6月2日修回), http://www.100md.com
单位：
张清秀 朱振宇 马涧泉 中山医科大学 生物化学教研室；周宁宁 肿瘤防治中心；吴金浪 电镜室(广州 510089)
关键词：基因；鼻咽肿瘤；寡核苷酸类；反义；小鼠；裸
中国病理生理杂志990812 摘 要 目的：在裸鼠活体水平上观察bcl-2反义寡聚核苷酸(antisense oligodeoxynucleotide, ASON)对鼻咽癌细胞株CNE2-baxα凋亡的影响。方法：DNA合成仪合成22nt ASON片段，RT-PCR检测bcl-2表达，电镜观察细胞凋亡。结果：反义bcl-2 DNA片段局部注射CNE2-baxα致瘤组织，RT-PCR检测肿瘤组织中bcl-2表达被封闭，电镜观察视野下可见大量癌细胞凋亡，癌细胞数目减少，细胞间组织大量纤维化；凋亡的癌细胞电子密度增加，具典型凋亡特征。反义bcl-2封闭1周，抑瘤率74.4%，第2周为46.0%。结论：反义bcl-2抑制鼻咽癌细胞株CNE2-baxα致瘤性，促进细胞凋亡。
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Antisense bcl-2 DNA enhances apoptosis of nasopharyngeal
carcinoma cell line CNE2-baxα habouring in nude mice
ZHANG Qing-Xiu ZHU Zhen-Yu
Dept. of Biochemistry,WU Jin-Lang
Electron Microscopy Laboratory
ZHOU Ning-Ning, MA Jian-Quan
Sun-Yat-sen University of Medical Sciences, Guangzhou(510089)
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Abstract AIM: To observe the effect of bcl-2 antisense oligod eoxynucleotide (ASON) on nude mice habouring tumor by inoculated human nasopharyngeal carcinoma cell line CNE2-baxα. METHOD: 22nt bcl-2 ASON was synthesized using DNA synthesizer. Apoptosis of neoplastic cells were observed with electron microscopy. RESULTS: Tumors were growing after CNE2 baxα cells were subcutaneously inoculated in nude mice. Suppression of bcl-2 expression was verified with RT-PCR assay after bcl-2 ASON was injected into the tumors. We also identified by electron microscopy that after ASON treatment large amount of tumor cells underwent apoptosis and the number of tumor cells reduced. The electron density of apoptotic cells was increased and apoptotic bodies formed.7 days after antisense bcl-2 DNA injection, the tumor-inhibiting rate was 74.4%, 14 days after, the rate was 46.0%. CONCLUSION:Antisense bcl-2 DNA inhibits the CNE2-baxα tumor growth and enhances apoptosis of CNE2-baxα cells.
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MeSH Genes; Nasopharyngeal neoplasms; Oligonucleotides, antisense; Mice, nude
80年代初发现反义RNA，随后又发现反义寡聚脱氧核苷酸(antisense oligodeoxynucleotide, ASON)可抑制有害基因的表达，无论在细胞水平，还是个体水平，它的调节作用均已被证实。反义bcl-2寡聚核苷酸可抑制正常骨髓干细胞和白血病细胞中bcl-2的表达，缩短细胞生存期；减少培养中细胞形成克隆的数目[1,2]。但是反义bcl-2抑制基因表达在鼻咽癌细胞尤其是活体水平的研究未见报道。bcl-2与bax是互相拮抗的蛋白，bcl-2能使细胞生存期延长和抵抗凋亡，bax促进细胞凋亡[3]。本研究设计将反义的bcl-2 DNA直接注入CNE2-baxα细胞株接种形成的肿瘤组织，研究bcl-2被封闭后肿瘤组织细胞的变化。
, http://www.100md.com 材料与方法
一、材料：
1. 细胞株CNE2-baxα，本研究室将凋亡基因baxα导入CNE2细胞获得[4]。
2. BALB/c裸鼠，4～6周龄，本校实验动物中心提供。
3. ASON片段：根据bcl-2 cDNA序列选择第264～285的22个核苷酸为靶序列，由上海细胞研究所合成，序列为5’GGTGCCCACCTGTGGTCCACCTG3’，溶于生理盐水，参照文献[2]，确定ASON浓度为45 μmol/L，即为反义bcl-2 DNA溶液。
二、方法：
1.接种肿瘤细胞：CNE2-baxα细胞培养至3×106个细胞，体积0.5 mL，注射入裸鼠颈背部皮下，1周后，取肿瘤组织剪成1 mm×1 mm×1 mm大小接种于16只裸鼠颈部双侧皮下。
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2. 给药：接种1周后，量取肿瘤组织大小为5 mm×3 mm，并将45 μmol/L反义bcl-2 DNA 50 μL注入右侧肿瘤组织[5]。左侧注入生理盐水对照，隔周测量双侧肿瘤大小。用公式(1)/(2)LW2(L为肿瘤长径，W为肿瘤横径)计算肿瘤重量[6]。
抑瘤率=
×100%3. RT-PCR检测bcl-2封闭情况：注射反义bcl-2 DNA后1周取肿瘤组织，参照文献[4]，抽提总RNA，检测其中mRNA 水平bcl-2的表达。
4 电镜观察癌细胞凋亡：反义bcl-2 DNA注射1周后，取两侧肿瘤组织块，2.5%戊二醛预固定，固定，磷酸-蔗糖缓冲液漂洗过夜，1%锇酸固定，系列乙醇-丙酮脱水，Epon812包埋，超薄切片，醋酸铀、柠檬酸铅复染，HITACHI电镜观察。
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结 果
一、RT-PCR检测肿瘤组织中bcl-2封闭的效果：
反义bcl-2 DNA处理1周后，抽提对照组与试验组肿瘤组织总RNA, RT-PCR测定。
图1显示，在对照组中的较明显的bcl-2 459bp条带，在试验组中未出现，说明肿瘤组织bcl-2的表达被反义片段封闭。
Fig 1 RT-PCR analysis of bcl-2 mRNA in tumor
1. DNA Marker; 2.RT-PCR of bcl-2 and β-actin in control group；3.RT-PCR results of bcl-2 in experimental group (negative)；4.RT-PCR of β-actin as control in experimental group
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图1 RT-PCR扩增肿瘤组织bcl-2 mRNA 电泳分析
二、 反义bcl-2的抑瘤率：
反义bcl-2 DNA片段溶液注射入肿瘤组织后，分别于7、14 d量取双侧肿瘤大小，计算瘤重结果如表1。
表1 反义bcl-2的抑瘤作用
Tab 1 Antisense bcl-2 inhibits tumor growth (
±s) GroupTime(d)
Number of
sample
, http://www.100md.com
Tumor
weight(mg)
Tumor-inhibiting
rate(%)
Group A
7
16
418±55
—
Control
14
14
931±139
, 百拇医药
—
Group B
7
16
107±7
74.4
Experiment
14
14
502±8
46.0
表1结果说明对于CNE2-baxα细胞形成的肿瘤组织，反义bcl-2的封闭作用第1周的抑瘤率74.4%，第2周的抑瘤率达46.0%。反义bcl-2表现出强的抑制肿瘤生长作用。
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三、 电镜观察bcl-2表达被封闭后肿瘤细胞凋亡情况：
电镜下观察，bcl-2表达被封闭后，视野下可见鼻咽癌细胞大面积发生凋亡，如图2所示。
Fig 2 Tumor cell (2a EM×3000) compared with normal cells (2bEM×4000),tumor cells shrink, cells become smaller, chromosomes accumulate under nuclear membrane. The electron density of apoptotic tumor cells increases, apoptotic body forms, but membrane in cell is intact(2a EM×3000).Fibrosis forms in intercellular tissues, number of tumor cells reduce (2c EM×3000)
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图2 bcl-2表达被封闭后电镜观察结果
讨 论
最早发现于滤泡淋巴瘤的bcl-2原癌基因，编码一种26 kD蛋白质，定位于线粒体内膜、内质网和核膜上，转染bcl-2细胞株在生长因子缺乏的培养基中生存时间延长，还对化疗药物诱导的凋亡具高度抗性[7,8]。
最近研究显示，bcl-2在上皮细胞中与LMP1的共表达可抗LMP1过表达对细胞的毒性作用，延长细胞在低浓度血清下的生存期；该细胞能在半固体软琼脂培养基中形成克隆[9]。免疫组化分析bcl-2存在于80%鼻咽癌组织中，特别存在于与EB病毒密切相关的低分化的鼻咽癌组织[10]，说明bcl-2在鼻咽癌组织中的重要性。
我们已成功将baxα导入低分化鼻咽癌细胞株，并获得baxα稳定表达的CNE2-baxα细胞株，并证实无血清诱导凋亡条件下baxα的加强表达可促进细胞凋亡，但凋亡率不高，仅为6.1%～11.3%，说明此时baxα的促进凋亡效应未得到有效发挥。因而本研究采用反义bcl-2 DNA局部注射CNE2-baxα株致瘤的鼻咽癌组织，观察到反义bcl-2 DNA明显抑制肿瘤的生长，bcl-2的表达被有效封闭，电镜观察大量肿瘤细胞发生凋亡，肿瘤组织大面积纤维化，研究结果提示，bcl-2在鼻咽癌肿瘤失控生长中起着关键作用。当bcl-2被封闭后无须任何刺激即可启动凋亡，其精确机理还须进一步研究。推测bcl-2的表达可能部分与鼻咽癌复杂的肿瘤发生机理有关。
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本实验结果证明反义bcl-2 DNA可有效抑制鼻咽肿瘤生长，为基因治疗肿瘤提供了一个可能的途径。
* 国家教委博士点基金资助
参考文献
1 McManaway ME, Neckers LM, Loke SL, et al. Tumor-specific inhibition of lymphoma growth by an antisense oligodeoxynucleotide. Lancet, 1990,335:808.
2 张涛，孙秉中，王成济，等. bcl-2反义寡聚脱氧核苷酸抑制HL-60细胞生长的研究.实验血液学杂志，1996，4(4)：353.
3 Oltvai ZN, Milliman CT, Korsmeyer SJ. BclV-2 heterodimerizes in vivo with a conserved homolog, bax, that accelerates programmed cell death. Cell, 1993,74:609.
, http://www.100md.com
4 张清秀， 朱振宇， 孔庆瑜，等.baxα 加强表达促进鼻咽癌细胞CNE2株凋亡.中国病理生理杂志， 1999，15(6)：502.
5 Bijsterbosch MK, Manoharan M, Rump ET, et al. In vivo fate of phosphorothioate antisense oligodeoxynucleotides: predominant uptake by scavenger receptors on endothelial liver cells. Nucleic Acids Res, 1997, 25(16): 3290.
6 Wang J, Sun L, Myeroff L, et al. Demonstration that mutation of the type II transforming growth factor β receptor inactivates is tumor suppressor activity in replication error positive colon carcinoma cells. J Biol Chem,1995,270:22044.
, http://www.100md.com
7 Nunez G, London L, Hockenberg D, et al. Deregulated bcl-2 gene expression selectively prolongs survival of growth factor-deprived hemopoietic cell lines. J Immunol,1990,144:3602.
8 Miyashita T, Reed J C. bcl-2 oncoprotein blocks chemotherapy induced apoptosis in a human leukemia cell line. Blood,1995,81:151.
9 Lu JJ, Chen JY, et al. Cooperative interaction between Bcl-2 and Epstein-Barr virus latent membrane protein l in the growth transformation of human epithelial cells. J Gen Virol,1997,78:2975.
10 Lu QL, Elia G, Lucas S, et al. bcl-2 proto-oncogene expression Epstein-Barr virus-associated nasopharyngeal carcinoma. Inter J Cancer,1993,53:29.
(1999年元月11日收稿，1999年6月2日修回), http://www.100md.com