甲基硝基亚硝基胍诱发的遗传不稳定细胞DNA聚合酶β mRNA表达水平研究*
作者：冯朝晖 余应年 陈星若
单位：浙江医科大学病理生理教研室及分子生物学实验室(杭州 310031)
关键词：诱变；DNA聚合酶类；基因表达；聚合酶链反应
中国病理生理杂志990808 摘 要 目的和方法：本实验室曾报道，低浓度0.2 μmol/L烷化剂甲基硝基亚硝基胍(N-methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine, MNNG)可以诱导哺乳类细胞遗传不稳定状态。为明确其发生机制，本文利用定量RT-PCR方法，研究了该低浓度MNNG对人HeLa及猴肾vero细胞DNA聚合酶β(pol β) mRNA表达水平的影响。结果：经0.2 μmol/L MNNG 2.5 h处理后，HeLa细胞pol β mRNA水平在6～24 h内升高约1倍；而vero细胞pol β mRNA水平在12～30 h内亦升高1倍左右。结论：提示pol β mRNA水平改变可能参与MNNG诱发细胞遗传不稳定的发生。
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mRNA expression of DNA polymerase β in MNNG induced genetically unstable cells
FENG Zhao-Hui, YU Ying-Nian, CHEN Xing-Ruo
Department of Pathophysiology and Laboratory of Molecular Biology, Zhejiang Medical University, Hangzhou (310031)
Abstract AIM and METHODS: It was reported from our laboratory that low concentration N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine (MNNG) could induce genetic instability in mammalian cells. To elucidate its mechanism, quantitative RT-PCR was used to study mRNA expression of DNA polymerase β in MNNG induced genetically unstable cells. RESULTS：It was demonstrated that mRNA level of polymerase β increased by nearly one-fold in HeLa cells from the 6th to 24th hour after being treated with 0.2 μmol/L MNNG for 2.5 h;and the same was demonstrated in vero cells from 12 th to 30 th hour after 0.2 μmol/L MNNG treatment. CONCLUSION：The alteration of polymerase β expression might be involved in the genesis of MNNG induced genetic instability in mammalian cells.
, 百拇医药
MeSH Mutagenesis; DNA polymerase; Gene expression; polymerase chain reaction
化学物质或离子辐射可以诱发哺乳类细胞遗传不稳定状态(genetic instability)，但其发生机制尚不明确[1]。本室证实低浓度0.2 μmol/L烷化剂甲基硝基亚硝基胍(N-methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine, MNNG)处理细胞2.5 h，可诱发细胞遗传不稳定状态产生[2]；同时有DNA复制保真度明显下降[3]，及许多基因表达水平的改变[4]；转录抑制剂可阻断该状态产生[5]。提示其产生与有关基因表达水平改变有关。
许多研究提示DNA聚合酶β(pol β)可能与MNNG诱发细胞遗传不稳定有关。pol β具有较低的DNA复制保真度，及较强的跨损伤误性DNA修复等特性。MMS、 AAF、 H2O2、 TPA及大剂量MNNG(≥20 μmol/L)可诱导细胞pol β mRNA水平的改变；甲基亚硝基脲(N-methyl-N-nitrosourea, MNU)诱导的小鼠胸腺淋巴瘤细胞中发现有DNA复制保真度下降及pol β mRNA水平升高[8]；对烷化剂耐受的肿瘤细胞中也发现pol β表达水平改变[9]。为明确MNNG诱发的遗传不稳定细胞中是否有pol β表达水平的改变，我们对0.2 μmol/L MNNG处理后的人宫颈癌HeLa细胞，及猴肾vero细胞中pol β mRNA水平进行了研究。
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材料与方法
一、细胞培养及处理：
单层生长的HeLa,vero细胞培养于含10%小牛血清的DMEM培养基(Gibco)中。用0.2 μmol/L MNNG(Sigma, 0.1% 二甲基亚砜DMSO作溶剂)处理细胞2.5 h后，经彻底漂洗，加入新鲜培养基，分别培养一定时间，对照组细胞用0.1% DMSO处理2.5 h。
二、PCR引物合成：
根据Genbank公布的人类基因序列，合成人pol β及β2-微球蛋白基因(β2m) 等二对PCR引物(上海细胞所)。其中pol β引物分别为：5’-CTT TGA GAA GAA CGT GAG CC-3’(正义)，5’-CTC GTA TCA TCC TGC CGA AT-3’(反义)，PCR产物长210 bp; β2m引物分别为：5’-C ACC CCC ACT GAA AAA GAT GA-3’(正义)，5’-C ATC TTC AAA CCT CCA TGA TG-3’(反义)，PCR产物长120 bp。
, 百拇医药
三、定量RT-PCR分析基因mRNA表达水平：
用TRIZol试剂(Gibco)按厂家说明书上方法提取HeLa细胞总RNA。取2 μg细胞总RNA， 0.5 μg d(N)6随机引物，200 μmol/L-MLV逆转录酶(Promega)，25 μL总体积，37℃反应1.5 h逆转录反应合成cDNA第一链。
取对照组细胞逆转录产物2.5 μL， 20 pmol pol β及内参照β 2m基因PCR引物，总体积50 μL，对两基因同时进行PCR扩增。扩增条件：94℃ 1 min, 57℃ 35 s, 72℃ 1 min。从20个循环数起，每增加3个循环数进行一次PCR扩增，直至40个循环数为止。产物经3%琼脂糖凝胶电泳后，溴乙锭染色，紫外灯下拍照，对产物电泳条带进行光密度扫描，计算pol β和β2m条带光密度比值(OD polβ/OD β2m)，以确定PCR定量扩增靶基因的合适循环数。
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分别取各处理组细胞逆转录产物2.5 μL，严格按上述条件和选定的合适PCR循环数，对pol β和β2m基因同时进行扩增。PCR产物按上述方法进行定量分析，pol β基因表达水平以pol β和β2m PCR产物电泳条带光密度比值(OD pol β/OD β2m)来表示。各样本至少重复3次RT-PCR过程。
按上述方法，利用人β2m， polβ基因PCR引物对MNNG处理后的vero细胞中polβ基因mRNA水平进行定量分析。
结 果
以β 2m基因为内参照，扩增对照组HeLa细胞中polβ基因。对经溴乙锭染色的产物电泳条带进行光密度扫描，发现从23至32个循环间，polβ和β2m基因PCR产物条带光密度比值(OD polβ/ODβ2m)恒定。表明在此循环数范围内，polβ和β2m基因均呈指数扩增，适合作定量分析。故此选定27个循环数作为定量RT-PCR扩增的循环数(图1)。
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Fig 1 RT-PCR products of DNA polymerase β and β2-microglobin in HeLa cells after amplification with different PCR cycle numbers. Lane 1: pGEM-7zf(+)Hae Ⅲ marker. OD polβ/OD β2m: Lane 2:0.584; Lane 3:0.713; Lane 4:0.552; Lane 5:0.654; Lane 6:1.116;
图1 经不同PCR循环数扩增后的HeLa细胞中DNA聚合酶β和β2-微球蛋白基因RT-PCR产物
HeLa细胞经0.2 μmol/L MNNG处理2.5 h后，分别于0， 6， 12， 24， 36 h，提取总RNA， 以β2m基因为内参照，对pol β进行定量RT-PCR扩增。扩增条件同前，循环数为27个。产物电泳条带经光密度扫描，分别计算OD polβ/OD β2m比值，每样本至少经3次定量RT-PCR分析。结果发现，polβ在MNNG处理细胞后6～24 h间升高约1倍左右(图2，表1)。
, 百拇医药
Fig 2 RT-PCR products of DNA polymerase β gene in HeLa cells treated with 0.2 μmol/L MNNG for 2.5 h. Lane 1: pGEM-7zf(+) Hae Ⅲ marker. Lane 2: control; Lane 3～7:0.2 μmol/L MNNG
图2 经0.2 μmol/L MNNG 2.5 h处理后，HeLa细胞中DNA聚合酶β基因RT-PCR产物
表1 经0.2 μmol/L MNNG 2.5 h处理后的HeLa\, vero细胞中DNA聚合酶β基因mRNA表达水平
Tab 1 mRNA expression of DNA polymerase β in HeLa, vero cells after treatment
, 百拇医药
of 0.2 μmol/L MNNG for 2.5 h (
±s, n=3)
OD polβ/OD β2m
Control
Time after MNNG treatment(h)
0
3
6
12
24
30
, 百拇医药 36
HeLa
0.628±0.124
0.597±0.136
—+
1.152±0.165*
1.213±0.173*
1.084±0.126*
—
0.587±0.078
Vero
, 百拇医药
0.485±0.086
0.463±0.062
0.312±0.074
0.476±0.105
0.975±0.092*
1.013±0.081*
0.964±0.116*
0.510±0.075
Quantitative RT-PCR was used to amplify pol β and β2m gene in cells. PCR products were electrophoresed and the bands were measured with optical density scanning. The expression levels of pol β were expressed as the ratio of the bands of pol β to that of β2m (OD pol β/ODβ2m)
, 百拇医药
*P<0.05, vs control group
利用人β2m\, polβ基因PCR引物，对vero细胞中相应基因进行扩增，发现其RT-PCR产物大小与 HeLa细胞中的大小完全一致。由于上述两基因所选定的PCR引物及扩增区域cDNA序列非常保守，在果蝇、小鼠、人不同真核生物中均有很高的同源性，故此认为所得产物即为β2m,polβ基因。发现从23至32个循环间，两基因均呈指数扩增，其PCR产物带光密度比值恒定。在此基础上，同样用27个循环进行PCR扩增，对MNNG诱发的遗传不稳定vero细胞pol βmRNA表达情况进行分析，同样发现在0.2 μmol/L MNNG处理后12～30 h内pol β mRNA水平升高约1倍(图3，表1)。
Fig 3 RT-PCR products of DNA polymerase β gene in vero cells treated with 0.2 μmol/L MNNG for 2.5 h. Lane 1～7: 0.2 μmol/L MNNG; Lane 8: control; Lane 9: pGEM-7zf(+) Hae Ⅲ marker
, 百拇医药
图3 经0.2 μmol/L MNNG 2.5 h处理后，vero细胞中DNA聚合酶β和RT-PCR产物
讨 论
目前为止，在哺乳类细胞中已发现有五类核DNA聚合酶(pol α,β,δ，ε，ζ)，分别参与DNA复制、修复以及DNA损伤后诱发突变形成等过程，与DNA复制保真度直接相关。其表达水平可以被某些烷化剂、射线所诱导，在某些肿瘤细胞中也发现有所改变[6，7]。我们曾通过定量RT-PCR方法对0.2 μmol/L MNNG处理后的HeLa细胞中DNA pol α，δ及ε mRNA水平进行了动态观察，均未见明显改变。
目前对polβ研究尚未透彻，由于缺少3’→5'核酸外切酶校读活性，polβ在体外DNA聚合反应中有很高的单碱基错误掺入率(1/1000-1/6600)，为复制保真度最低的DNA聚合酶。它可以通过碱基切除修复途径参与烷化剂、射线造成的DNA损伤修复。同时，pol β具有很强的跨损伤易误性DNA修复功能，在体外能够跨过AP位点或d(GpG)-顺铂加合物等DNA损伤，造成碱基缺失或替换突变[6，7]。最近发现，polβ能跨06-mG损伤(MNNG造成的主要DNA损伤类型)，在新链相应位置上插入一d(A)，认为是烷化剂损伤后造成细胞G→A突变的重要原因[10]。考虑到polβ的特性，尤其是复制的低保真度，本实验中MNNG处理后细胞中polβ表达水平的上升，是否与MNNG诱发细胞DNA复制保真度下降及遗传不稳定发生有关，我们拟通过反义RNA技术阻断细胞中polβ基因的表达，观察细胞非定标性突变率是否有明显改变，进一步研究在进行之中。
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* 国家自然科学基金(No.39870684)、浙江省自然科学基金(No.397454)资助
参考文献
1 Murnane JP. Role of induced genetic instability in the mutagenic effects of chemicals and radiation. Mutat Res, 1996, 367:11.
2 Zhang X, Yu Y, Chen X. Evidece for nontargeted mutagenesis in a monkey kidney cell line and analysis of its sequence spectificity using a shuttle-vector plasmid. Mutat Res, 1994, 323:105.
, 百拇医药
3 冯朝晖，余应年，张小山，等.MNNG诱发的遗传不稳定vero细胞中DNA体外复制保真度的研究.中国药理学与毒理学杂志，1998，12(2)：144.
4 胡文蔚，余应年，张小山，等.N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍引起Vero细胞基因表达改变及有关cDNA片段的初步鉴定.中国药理学与毒理学杂志，1998，12：62.
5 孙雪敏，余应年，张小山，等.转录和翻译抑制对哺乳类细胞非定标性突变形成的影响.癌变.畸变.突变，1996，8：286.
6 Budd ME, Campbell JL. The roles of the eukaryotic DNA polymerases in DNA repair synthesis. Mutat Res, 1997, 384:157.
, http://www.100md.com
7 Wang TSF. Eukaryotic DNA polymerase. Ann Rev Biochem, 1991, 60:513.
8 Kubota Y, Kimiko MM, Shimada Y, et al. Reduced fidelity of DNA synthesis in cell extracts from chemically induced primary thymic lymphomas of mice. Cancer Res, 1995, 55:3777.
9 Friedman HS, Dolan ME, Kaufmann SH, et al. Elevated DNA polymerase α, DNA polymerase β, and topoisomerase Ⅱ in a melphalan-resistant rhabdomyosarcoma xenograft that is cross-resistant to nitrosoureas and topotecan. Cancer Res, 1994, 54:3487.
10 Singh J, Su L, Snow ET. Replication across O6-methylguanine by human DNA polymerase β in vitro. J Biol Chem, 1996, 271:28391.
(1998年4月15日收稿，1998年8月28日修回), http://www.100md.com
单位：浙江医科大学病理生理教研室及分子生物学实验室(杭州 310031)
关键词：诱变；DNA聚合酶类；基因表达；聚合酶链反应
中国病理生理杂志990808 摘 要 目的和方法：本实验室曾报道，低浓度0.2 μmol/L烷化剂甲基硝基亚硝基胍(N-methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine, MNNG)可以诱导哺乳类细胞遗传不稳定状态。为明确其发生机制，本文利用定量RT-PCR方法，研究了该低浓度MNNG对人HeLa及猴肾vero细胞DNA聚合酶β(pol β) mRNA表达水平的影响。结果：经0.2 μmol/L MNNG 2.5 h处理后，HeLa细胞pol β mRNA水平在6～24 h内升高约1倍；而vero细胞pol β mRNA水平在12～30 h内亦升高1倍左右。结论：提示pol β mRNA水平改变可能参与MNNG诱发细胞遗传不稳定的发生。
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mRNA expression of DNA polymerase β in MNNG induced genetically unstable cells
FENG Zhao-Hui, YU Ying-Nian, CHEN Xing-Ruo
Department of Pathophysiology and Laboratory of Molecular Biology, Zhejiang Medical University, Hangzhou (310031)
Abstract AIM and METHODS: It was reported from our laboratory that low concentration N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine (MNNG) could induce genetic instability in mammalian cells. To elucidate its mechanism, quantitative RT-PCR was used to study mRNA expression of DNA polymerase β in MNNG induced genetically unstable cells. RESULTS：It was demonstrated that mRNA level of polymerase β increased by nearly one-fold in HeLa cells from the 6th to 24th hour after being treated with 0.2 μmol/L MNNG for 2.5 h;and the same was demonstrated in vero cells from 12 th to 30 th hour after 0.2 μmol/L MNNG treatment. CONCLUSION：The alteration of polymerase β expression might be involved in the genesis of MNNG induced genetic instability in mammalian cells.
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MeSH Mutagenesis; DNA polymerase; Gene expression; polymerase chain reaction
化学物质或离子辐射可以诱发哺乳类细胞遗传不稳定状态(genetic instability)，但其发生机制尚不明确[1]。本室证实低浓度0.2 μmol/L烷化剂甲基硝基亚硝基胍(N-methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine, MNNG)处理细胞2.5 h，可诱发细胞遗传不稳定状态产生[2]；同时有DNA复制保真度明显下降[3]，及许多基因表达水平的改变[4]；转录抑制剂可阻断该状态产生[5]。提示其产生与有关基因表达水平改变有关。
许多研究提示DNA聚合酶β(pol β)可能与MNNG诱发细胞遗传不稳定有关。pol β具有较低的DNA复制保真度，及较强的跨损伤误性DNA修复等特性。MMS、 AAF、 H2O2、 TPA及大剂量MNNG(≥20 μmol/L)可诱导细胞pol β mRNA水平的改变；甲基亚硝基脲(N-methyl-N-nitrosourea, MNU)诱导的小鼠胸腺淋巴瘤细胞中发现有DNA复制保真度下降及pol β mRNA水平升高[8]；对烷化剂耐受的肿瘤细胞中也发现pol β表达水平改变[9]。为明确MNNG诱发的遗传不稳定细胞中是否有pol β表达水平的改变，我们对0.2 μmol/L MNNG处理后的人宫颈癌HeLa细胞，及猴肾vero细胞中pol β mRNA水平进行了研究。
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材料与方法
一、细胞培养及处理：
单层生长的HeLa,vero细胞培养于含10%小牛血清的DMEM培养基(Gibco)中。用0.2 μmol/L MNNG(Sigma, 0.1% 二甲基亚砜DMSO作溶剂)处理细胞2.5 h后，经彻底漂洗，加入新鲜培养基，分别培养一定时间，对照组细胞用0.1% DMSO处理2.5 h。
二、PCR引物合成：
根据Genbank公布的人类基因序列，合成人pol β及β2-微球蛋白基因(β2m) 等二对PCR引物(上海细胞所)。其中pol β引物分别为：5’-CTT TGA GAA GAA CGT GAG CC-3’(正义)，5’-CTC GTA TCA TCC TGC CGA AT-3’(反义)，PCR产物长210 bp; β2m引物分别为：5’-C ACC CCC ACT GAA AAA GAT GA-3’(正义)，5’-C ATC TTC AAA CCT CCA TGA TG-3’(反义)，PCR产物长120 bp。
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三、定量RT-PCR分析基因mRNA表达水平：
用TRIZol试剂(Gibco)按厂家说明书上方法提取HeLa细胞总RNA。取2 μg细胞总RNA， 0.5 μg d(N)6随机引物，200 μmol/L-MLV逆转录酶(Promega)，25 μL总体积，37℃反应1.5 h逆转录反应合成cDNA第一链。
取对照组细胞逆转录产物2.5 μL， 20 pmol pol β及内参照β 2m基因PCR引物，总体积50 μL，对两基因同时进行PCR扩增。扩增条件：94℃ 1 min, 57℃ 35 s, 72℃ 1 min。从20个循环数起，每增加3个循环数进行一次PCR扩增，直至40个循环数为止。产物经3%琼脂糖凝胶电泳后，溴乙锭染色，紫外灯下拍照，对产物电泳条带进行光密度扫描，计算pol β和β2m条带光密度比值(OD polβ/OD β2m)，以确定PCR定量扩增靶基因的合适循环数。
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分别取各处理组细胞逆转录产物2.5 μL，严格按上述条件和选定的合适PCR循环数，对pol β和β2m基因同时进行扩增。PCR产物按上述方法进行定量分析，pol β基因表达水平以pol β和β2m PCR产物电泳条带光密度比值(OD pol β/OD β2m)来表示。各样本至少重复3次RT-PCR过程。
按上述方法，利用人β2m， polβ基因PCR引物对MNNG处理后的vero细胞中polβ基因mRNA水平进行定量分析。
结 果
以β 2m基因为内参照，扩增对照组HeLa细胞中polβ基因。对经溴乙锭染色的产物电泳条带进行光密度扫描，发现从23至32个循环间，polβ和β2m基因PCR产物条带光密度比值(OD polβ/ODβ2m)恒定。表明在此循环数范围内，polβ和β2m基因均呈指数扩增，适合作定量分析。故此选定27个循环数作为定量RT-PCR扩增的循环数(图1)。
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Fig 1 RT-PCR products of DNA polymerase β and β2-microglobin in HeLa cells after amplification with different PCR cycle numbers. Lane 1: pGEM-7zf(+)Hae Ⅲ marker. OD polβ/OD β2m: Lane 2:0.584; Lane 3:0.713; Lane 4:0.552; Lane 5:0.654; Lane 6:1.116;
图1 经不同PCR循环数扩增后的HeLa细胞中DNA聚合酶β和β2-微球蛋白基因RT-PCR产物
HeLa细胞经0.2 μmol/L MNNG处理2.5 h后，分别于0， 6， 12， 24， 36 h，提取总RNA， 以β2m基因为内参照，对pol β进行定量RT-PCR扩增。扩增条件同前，循环数为27个。产物电泳条带经光密度扫描，分别计算OD polβ/OD β2m比值，每样本至少经3次定量RT-PCR分析。结果发现，polβ在MNNG处理细胞后6～24 h间升高约1倍左右(图2，表1)。
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Fig 2 RT-PCR products of DNA polymerase β gene in HeLa cells treated with 0.2 μmol/L MNNG for 2.5 h. Lane 1: pGEM-7zf(+) Hae Ⅲ marker. Lane 2: control; Lane 3～7:0.2 μmol/L MNNG
图2 经0.2 μmol/L MNNG 2.5 h处理后，HeLa细胞中DNA聚合酶β基因RT-PCR产物
表1 经0.2 μmol/L MNNG 2.5 h处理后的HeLa\, vero细胞中DNA聚合酶β基因mRNA表达水平
Tab 1 mRNA expression of DNA polymerase β in HeLa, vero cells after treatment
, 百拇医药
of 0.2 μmol/L MNNG for 2.5 h (
±s, n=3)OD polβ/OD β2m
Control
Time after MNNG treatment(h)
0
3
6
12
24
30
, 百拇医药 36
HeLa
0.628±0.124
0.597±0.136
—+
1.152±0.165*
1.213±0.173*
1.084±0.126*
—
0.587±0.078
Vero
, 百拇医药
0.485±0.086
0.463±0.062
0.312±0.074
0.476±0.105
0.975±0.092*
1.013±0.081*
0.964±0.116*
0.510±0.075
Quantitative RT-PCR was used to amplify pol β and β2m gene in cells. PCR products were electrophoresed and the bands were measured with optical density scanning. The expression levels of pol β were expressed as the ratio of the bands of pol β to that of β2m (OD pol β/ODβ2m)
, 百拇医药
*P<0.05, vs control group
利用人β2m\, polβ基因PCR引物，对vero细胞中相应基因进行扩增，发现其RT-PCR产物大小与 HeLa细胞中的大小完全一致。由于上述两基因所选定的PCR引物及扩增区域cDNA序列非常保守，在果蝇、小鼠、人不同真核生物中均有很高的同源性，故此认为所得产物即为β2m,polβ基因。发现从23至32个循环间，两基因均呈指数扩增，其PCR产物带光密度比值恒定。在此基础上，同样用27个循环进行PCR扩增，对MNNG诱发的遗传不稳定vero细胞pol βmRNA表达情况进行分析，同样发现在0.2 μmol/L MNNG处理后12～30 h内pol β mRNA水平升高约1倍(图3，表1)。
Fig 3 RT-PCR products of DNA polymerase β gene in vero cells treated with 0.2 μmol/L MNNG for 2.5 h. Lane 1～7: 0.2 μmol/L MNNG; Lane 8: control; Lane 9: pGEM-7zf(+) Hae Ⅲ marker
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图3 经0.2 μmol/L MNNG 2.5 h处理后，vero细胞中DNA聚合酶β和RT-PCR产物
讨 论
目前为止，在哺乳类细胞中已发现有五类核DNA聚合酶(pol α,β,δ，ε，ζ)，分别参与DNA复制、修复以及DNA损伤后诱发突变形成等过程，与DNA复制保真度直接相关。其表达水平可以被某些烷化剂、射线所诱导，在某些肿瘤细胞中也发现有所改变[6，7]。我们曾通过定量RT-PCR方法对0.2 μmol/L MNNG处理后的HeLa细胞中DNA pol α，δ及ε mRNA水平进行了动态观察，均未见明显改变。
目前对polβ研究尚未透彻，由于缺少3’→5'核酸外切酶校读活性，polβ在体外DNA聚合反应中有很高的单碱基错误掺入率(1/1000-1/6600)，为复制保真度最低的DNA聚合酶。它可以通过碱基切除修复途径参与烷化剂、射线造成的DNA损伤修复。同时，pol β具有很强的跨损伤易误性DNA修复功能，在体外能够跨过AP位点或d(GpG)-顺铂加合物等DNA损伤，造成碱基缺失或替换突变[6，7]。最近发现，polβ能跨06-mG损伤(MNNG造成的主要DNA损伤类型)，在新链相应位置上插入一d(A)，认为是烷化剂损伤后造成细胞G→A突变的重要原因[10]。考虑到polβ的特性，尤其是复制的低保真度，本实验中MNNG处理后细胞中polβ表达水平的上升，是否与MNNG诱发细胞DNA复制保真度下降及遗传不稳定发生有关，我们拟通过反义RNA技术阻断细胞中polβ基因的表达，观察细胞非定标性突变率是否有明显改变，进一步研究在进行之中。
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* 国家自然科学基金(No.39870684)、浙江省自然科学基金(No.397454)资助
参考文献
1 Murnane JP. Role of induced genetic instability in the mutagenic effects of chemicals and radiation. Mutat Res, 1996, 367:11.
2 Zhang X, Yu Y, Chen X. Evidece for nontargeted mutagenesis in a monkey kidney cell line and analysis of its sequence spectificity using a shuttle-vector plasmid. Mutat Res, 1994, 323:105.
, 百拇医药
3 冯朝晖，余应年，张小山，等.MNNG诱发的遗传不稳定vero细胞中DNA体外复制保真度的研究.中国药理学与毒理学杂志，1998，12(2)：144.
4 胡文蔚，余应年，张小山，等.N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍引起Vero细胞基因表达改变及有关cDNA片段的初步鉴定.中国药理学与毒理学杂志，1998，12：62.
5 孙雪敏，余应年，张小山，等.转录和翻译抑制对哺乳类细胞非定标性突变形成的影响.癌变.畸变.突变，1996，8：286.
6 Budd ME, Campbell JL. The roles of the eukaryotic DNA polymerases in DNA repair synthesis. Mutat Res, 1997, 384:157.
, http://www.100md.com
7 Wang TSF. Eukaryotic DNA polymerase. Ann Rev Biochem, 1991, 60:513.
8 Kubota Y, Kimiko MM, Shimada Y, et al. Reduced fidelity of DNA synthesis in cell extracts from chemically induced primary thymic lymphomas of mice. Cancer Res, 1995, 55:3777.
9 Friedman HS, Dolan ME, Kaufmann SH, et al. Elevated DNA polymerase α, DNA polymerase β, and topoisomerase Ⅱ in a melphalan-resistant rhabdomyosarcoma xenograft that is cross-resistant to nitrosoureas and topotecan. Cancer Res, 1994, 54:3487.
10 Singh J, Su L, Snow ET. Replication across O6-methylguanine by human DNA polymerase β in vitro. J Biol Chem, 1996, 271:28391.
(1998年4月15日收稿，1998年8月28日修回), http://www.100md.com