钩体内鞭毛蛋白基因重组质粒的构建、表达和免疫保护性研究游自立
作者：戴保民 陈 庄 方之茂 李胜富
单位：华西医科大学(成都 610041)
关键词：
中国病理生理杂志990876 对钩端螺旋体病的有效预防亟需广谱、高效、安全、价廉的疫苗。为了获得重组表达的钩体内鞭毛亚单位蛋白抗原，以探讨制备新疫苗的途径，我们设计一对引物(P1=5’-GCC GTC GAC ATG ATT ATC AAT-3’，P2=5’-GGC TAG CTA TTA GAT ATG CTG CAG-3’)，以赖型017株钩体DNA为模板，利用PCR扩增其编码基因完整的开放阅读框架，扩增产物经Sal I、Cla I双酶切消化后定向克隆于pT7-7载体上，构建原核表达重组质粒pLF2。将该质粒转化入大肠杆菌JM109(DE3)中，经IPTG诱导表达，SDS-PAGE显示此产物相对分子量为34 kd。用插入片段为探针，Southern杂交提示可能有两个相关的基因存在于钩体的基因组内。Western杂交证实该表达蛋白可与内鞭毛抗血清在34 kd处出现印迹，与钩体内鞭毛同类蛋白带位置一致。质粒pLF2在大肠杆菌中的表达蛋白能诱导家兔产生特异性抗体，并对豚鼠有免疫保护作用。我们进一步研究赖型构体内鞭毛蛋白基因在动物体内的表达及其免疫保护性。采用另一对引物(P3=5’-GCG CGT CGA CAA ATG ATT ATC AAT CAC AAC-3’，P4=5’-CGC GAT ATC TTA CTG CAG AAG CTT GAG AAC-3’)，以PCR扩增内鞭毛蛋白编码基因，经Sal I、EcoRV酶切，以表达质粒VR1012为载体，构建了含有钩体的内鞭毛基因用于哺乳类动物体内表达的重组质粒VR1012+flaB2。在新西兰白兔四头肌内注射VR1012+flaB2重组质粒DNA 500 μg/只，重复3次，每次间隔3周，于每次注射前和未次注射3周后，检查血清抗赖型钩体抗体效价。结果显示它可引起兔产生特异的抗体反应，ELISA抗体效价显著升高，豚鼠免疫保护试验表明该DNA重组质粒有明显免疫保护作用，豚鼠在受强毒力钩体赖型017株攻击后有很高的存活率。本实验为钩体核酸疫苗的研究奠定了基础。, 百拇医药
单位：华西医科大学(成都 610041)
关键词：
中国病理生理杂志990876 对钩端螺旋体病的有效预防亟需广谱、高效、安全、价廉的疫苗。为了获得重组表达的钩体内鞭毛亚单位蛋白抗原，以探讨制备新疫苗的途径，我们设计一对引物(P1=5’-GCC GTC GAC ATG ATT ATC AAT-3’，P2=5’-GGC TAG CTA TTA GAT ATG CTG CAG-3’)，以赖型017株钩体DNA为模板，利用PCR扩增其编码基因完整的开放阅读框架，扩增产物经Sal I、Cla I双酶切消化后定向克隆于pT7-7载体上，构建原核表达重组质粒pLF2。将该质粒转化入大肠杆菌JM109(DE3)中，经IPTG诱导表达，SDS-PAGE显示此产物相对分子量为34 kd。用插入片段为探针，Southern杂交提示可能有两个相关的基因存在于钩体的基因组内。Western杂交证实该表达蛋白可与内鞭毛抗血清在34 kd处出现印迹，与钩体内鞭毛同类蛋白带位置一致。质粒pLF2在大肠杆菌中的表达蛋白能诱导家兔产生特异性抗体，并对豚鼠有免疫保护作用。我们进一步研究赖型构体内鞭毛蛋白基因在动物体内的表达及其免疫保护性。采用另一对引物(P3=5’-GCG CGT CGA CAA ATG ATT ATC AAT CAC AAC-3’，P4=5’-CGC GAT ATC TTA CTG CAG AAG CTT GAG AAC-3’)，以PCR扩增内鞭毛蛋白编码基因，经Sal I、EcoRV酶切，以表达质粒VR1012为载体，构建了含有钩体的内鞭毛基因用于哺乳类动物体内表达的重组质粒VR1012+flaB2。在新西兰白兔四头肌内注射VR1012+flaB2重组质粒DNA 500 μg/只，重复3次，每次间隔3周，于每次注射前和未次注射3周后，检查血清抗赖型钩体抗体效价。结果显示它可引起兔产生特异的抗体反应，ELISA抗体效价显著升高，豚鼠免疫保护试验表明该DNA重组质粒有明显免疫保护作用，豚鼠在受强毒力钩体赖型017株攻击后有很高的存活率。本实验为钩体核酸疫苗的研究奠定了基础。, 百拇医药