人α-防御素HNP1基因在气管上皮细胞的转染表达
作者：唐彬 黄宁 吴琦 王伯瑶
单位：华西医科大学感染免疫研究室、病生教研室(成都 610041)
关键词：
人α 已有报道将HNP1 cDNA重组到pBabe/neo质粒载体中，并转染体外培养的无内源防御素的小鼠巨噬细胞系，结果检测到HNP1 mRNA的表达，同时发现这些巨噬细胞的抗菌活性得到了增强。本实验用脂质体转染法首次将HNP1 cDNA重组真核表达质粒pBabe-Neo-HNP1导入体外培养的人和兔气管上皮细胞，用RT-PCR和免疫组化方法检测其mRNA和蛋白的表达。表达质粒pBabe-Neo-HNP1转化宿主菌XL 1-Blue MRF'进行扩增，按Qiagen公司质粒提取试剂盒说明书提取和纯化其质粒。应用DOSPER脂质体按转染试剂盒说明，将HNP1基因真核表达质粒转染原代培养的人和兔气管上皮细胞。为检测HNP-1 mRNA在气管上皮细胞的表达，根据HNP1的cDNA序列，设计一对引物：5′端引物为TAGAGTCGACGTGACCCCAG；3′端引物为TTTGGATCCAAGCTCAGCAG。引物由Gibco公司合成。用TRIZOL试剂并按其说明从气管上皮细胞提取总RNA。依据一管法RT-PCR试剂盒说明进行RT-PCR操作。其反应程序为50℃保温30 min，使mRNA逆转录为cDNA；94℃预变性2 min；然后进入35个PCR循环：94℃变性30 s，60℃退火30 s，68℃延伸45 s；最后在68℃继续延伸7 min。RT-PCR产物在1.2%的琼脂糖凝胶上电泳，其结果可见在经pBabe-Neo-HNP1转染的人和兔气管粘膜上皮细胞的总RNA中扩增出一条DNA片段，该片段大小与HNP1 cDNA表达质粒pBabe-Neo-HNP1的PCR扩增产物一致。阴性对照人气管粘膜上皮细胞(未进行HNP1 cDNA重组质粒的转染)的总RNA提取产物经RT-PCR及PCR后，虽能扩增出β-肌动蛋白DNA，但检测不出任何HNP1 DNA信号，从而证实HNP1只在转染细胞中表达。经HNP-1免疫组化分析亦证明只有转染了HNP-1基因的气管上皮细胞才呈阳性反应，表面表达了HNP-1肽分子。, http://www.100md.com
单位：华西医科大学感染免疫研究室、病生教研室(成都 610041)
关键词：
人α 已有报道将HNP1 cDNA重组到pBabe/neo质粒载体中，并转染体外培养的无内源防御素的小鼠巨噬细胞系，结果检测到HNP1 mRNA的表达，同时发现这些巨噬细胞的抗菌活性得到了增强。本实验用脂质体转染法首次将HNP1 cDNA重组真核表达质粒pBabe-Neo-HNP1导入体外培养的人和兔气管上皮细胞，用RT-PCR和免疫组化方法检测其mRNA和蛋白的表达。表达质粒pBabe-Neo-HNP1转化宿主菌XL 1-Blue MRF'进行扩增，按Qiagen公司质粒提取试剂盒说明书提取和纯化其质粒。应用DOSPER脂质体按转染试剂盒说明，将HNP1基因真核表达质粒转染原代培养的人和兔气管上皮细胞。为检测HNP-1 mRNA在气管上皮细胞的表达，根据HNP1的cDNA序列，设计一对引物：5′端引物为TAGAGTCGACGTGACCCCAG；3′端引物为TTTGGATCCAAGCTCAGCAG。引物由Gibco公司合成。用TRIZOL试剂并按其说明从气管上皮细胞提取总RNA。依据一管法RT-PCR试剂盒说明进行RT-PCR操作。其反应程序为50℃保温30 min，使mRNA逆转录为cDNA；94℃预变性2 min；然后进入35个PCR循环：94℃变性30 s，60℃退火30 s，68℃延伸45 s；最后在68℃继续延伸7 min。RT-PCR产物在1.2%的琼脂糖凝胶上电泳，其结果可见在经pBabe-Neo-HNP1转染的人和兔气管粘膜上皮细胞的总RNA中扩增出一条DNA片段，该片段大小与HNP1 cDNA表达质粒pBabe-Neo-HNP1的PCR扩增产物一致。阴性对照人气管粘膜上皮细胞(未进行HNP1 cDNA重组质粒的转染)的总RNA提取产物经RT-PCR及PCR后，虽能扩增出β-肌动蛋白DNA，但检测不出任何HNP1 DNA信号，从而证实HNP1只在转染细胞中表达。经HNP-1免疫组化分析亦证明只有转染了HNP-1基因的气管上皮细胞才呈阳性反应，表面表达了HNP-1肽分子。, http://www.100md.com