心肌肥大时细胞核被膜核苷三磷酸酶活性及mRNA出核转运的变化*
作者：李载权 杨 军 庞永正 周爱儒 唐朝枢 刘乃奎
单位：李载权 杨 军 庞永正 唐朝枢 北京医科大学第一医院心血管研究所 (北京 100034)；周爱儒 北京医科大学生物化学与分子生物学系；刘乃奎 北京医科大学心血管基础研究所
关键词：肥大；大鼠；核苷酶类；RNA；核
心肌肥大时细胞核被膜核苷三磷酸酶活性 及mRNA出核转运的变化 摘 要 目的：探讨心肌肥大时心肌细胞mRNA出核转运率及核被膜核苷三磷酸酶(NTPase)活性的变化。方法：采用腹主动脉缩窄法复制大鼠心肌肥大模型，密度梯度离心法制备心肌细胞核被膜，观察心肌肥大时对心肌NTPase活性和成熟mRNA出核转运速率的影响。结果：早、晚期肥大组心肌细胞核被膜NTPase最大反应速率以ATP为底物时较对照组增加25%～62%(P<0.01)，以GTP为底物时增加8%～44%(P<0.01)，其中晚期肥大组NTPase最大反应速率增加幅度低于早期组。早期肥大组细胞核被膜NTPase Km值不变，晚期组NTPase Km值下降，以ATP和GTP为底物时晚期肥大组Km值分别下降22%和86%。早期肥大组10 min心肌细胞核mRNA出核转运率以ATP或GTP启动反应时分别较对照组增加68%(P<0.01)或78%(P<0.01)，晚期肥大组增加幅度不如早期组大，仅增加27%和21.7%(P<0.01)。 结论：大鼠心肌肥大组细胞核被膜mRNA出核转运率的增加可能是心肌肥大时蛋白质合成增加的一个重要原因，而这种mRNA出核转运率的增加可能与核被膜NTPase活性的增加有关。
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Alteration of cardiomyocyte nuclear enveloped associated NTPase activities
and mRNA transport in rat hypertrophy
LI Zai-Quan, YANG Jun, PANG Yong-Zhen, ZHOU Ai-Ru, TANG Chao-Su, LIU Nai-Kui
Institute of Cardiovascular Research, The First Hospital,Beijing Medical University, Beijing (100034)
Abstract AIM and METHODS: To oberserve the possible alterations of mRNA nucleocytoplasmic transport and nuclear envelope associated NTPase activity during rat heart hypertrophy(Hyper), cardiomyocyte nuclear envelope portions were prepared by density gradient centrifugation methods from heart hypertrophic rat model and were further detected for their mRNA transport rates and NTPase activities. RESULTS: The hypertrophic cardiomyocyte NTPase Vmax values at 1 week group(early hyper) and 4 week group(late hyper) were all increased significantly in both of ATP and GTP as substrates with much higher argumental extent in early hyper group; their Km values were kept constant in early hyper group and were decreased only in late hyper groups. The 10 min mRNA transport amounts in early hyper as well as late hyper groups in both ATP and GTP initial activators was correspondingly enhanced significantly also. CONCLUSION: The increased mRNA transport during rat heart hypertrophy might be one of the important reasons of their increase in protein synthesis, attributing to the nuclear envelope associated NTPase activities contributions.
, 百拇医药
MeSH Hypertrophy； Rat； Nucleosidases； RNA, nuclear
心肌肥大(cardiac hypertrophy)是心肌细胞及其间质细胞受到机械牵张及生长因子刺激后，心肌细胞内一系列与细胞生长、增殖有关的多种基因表达发生变化的一种适应性反应过程。心肌细胞接受刺激后通过增加蛋白质的表达决定着心肌肥大的发生、发展及其预后[1]。蛋白质表达的变化涉及蛋白质基因的转录、mRNA表达、修饰和降解、mRNA出核转运以及mRNA指导下蛋白质翻译等多个环节。位于细胞核被膜的核苷三磷酸酶(nucleoside triphosphatase，NTPase)是细胞核被膜mRNA出核转运的限速酶，它通过水解ATP或GTP中高能磷酸键并释放能量来促进核内成熟mRNA穿过核孔复合体进入胞浆[2]。但心肌肥大时心肌细胞核被膜mRNA转运和NTPase活性是否发生变化尚未见报道，本工作在腹主动脉缩窄引起的大鼠心肌肥大模型上，观察心肌细胞核被膜NTPase活性的动力学变化及细胞核mRNA出核转运速率的变化，以探讨心肌肥大时细胞内蛋白质合成增加的分子机制。
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材料与方法
一、 大鼠心肌肥大模型的复制：
体重270～320克，健康雄性SD大鼠。术前禁食12 h，自由饮水。腹腔注射戊巴比妥钠(40 mg/kg)麻醉下打开腹腔，于左肾动脉上方腹主动脉旁置一0.8 mm号针头，穿线结扎后抽出针头以缩窄腹主动脉[3]，随即缝合切口。术后大鼠分别喂养1周(肥大早期组)和喂养4周(肥大晚期组)，经戊巴比妥钠麻醉后处死，摘取心脏并称重，以心肌湿重与体重之比即心系数衡量心肌肥大程度。假手术对照组大鼠除腹主动脉不作缩窄处理外，其余操作同心肌肥大组。
二、大鼠心肌细胞核被膜的分离纯化[4]：
将大鼠心肌组织加入匀浆缓冲液(mmol/L：250 蔗糖, 10 Tris-HCl pH7.4, 3 MgCl2，0.1 PMSF)用Teflon匀浆器匀浆；1 200×g 10 min离心后取沉淀部分进行蔗糖密度梯度离心(4℃ 120 000×g 60 min)，收集密度为55%～67%蔗糖层的心肌细胞核，加入DNase I和煮沸过的RNase A孵育以除去心肌细胞核内的DNA和RNA，然后调节心肌细胞核溶液中NaCl浓度为1.6 mol/L, 1600×g离心30 min除去心肌细胞核内盐溶物，收获心肌细胞核被膜用Lowry法测定并调整核被膜蛋白浓度为1 mg蛋白/mL，置于-70℃保存备用。按Tiffany等[5]的方法分别测定心肌组织匀浆和细胞核被膜中细胞核标志酶NAD焦磷酸化酶与微粒体标志酶NADPH细胞色素c还原酶活性及心肌组织中ATP含量。
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三、心肌细胞核被膜NTPase活性测定：
取25 μL 细胞核被膜悬浮在200 μL缓冲液(mmol/L：250 蔗糖， 50 Tris-HCl pH 7.4，1 MgCl2，5 EDTA)中30℃预温育10 min，然后分别加入5 μmol/L到1 mmol/L 不同浓度的ATP或GTP启动NTPase酶促反应，温育10 min后加入10%SDS并置冰浴中以终止反应。再按Raess法[6]测定反应所产生的无机磷(Pi)含量，计算相应NTPase的酶活性(单位：nmol Pi.mg-1 pro.min-1)。
预实验结果表明温育时间在30 min内NTPase活性与底物ATP或GTP的温育时间成直线关系。本实验测定心肌组织ATP含量时发现心肌肥大组ATP含量与对照组相近(P>0.05)，因此心肌肥大组核被膜NTPase活性的改变并非是由ATP底物量的变动造成的。
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四、核被膜mRNA转运率的测定[5]：
[3H]-poly(A)+mRNA的制备： 将酵母菌(saccharomyces cerevisiae)接种在含有6.75×106 Bq/L [3H]标记的尿嘧啶酵母培养基中，培养、收获酵母菌并用RNA分离试剂盒(bulletin 1,TEL-TEST“B”)以及7型寡聚(dT)-纤维素层析柱分离纯化[3H]-poly(A) +mRNA，置-70℃保存。[3H]-poly(A)+mRNA的比放性为101.7×103 counts.min-1.μg-1 RNA。
核被膜mRNA转运率的测定：冰浴中于5 μg [3H]-poly(A)+ mRNA上依次铺加10 μL 60%的HClO4，40 μL的硅酮油和150 μL经封闭液(mmol/L：10 Tris-HCl pH8.0, 30 KCl, 100 NaCl, 3 MgCl2, 0.5 CaCl2) 处理后的核被膜悬液，在30℃条件下分别加入2 mmol/L的ATP或GTP以启动 mRNA出核转运的反应。经不同转运反应时间后离心终止反应，取上清液层测定放射活性，代表核被膜所转运的mRNA，以同样操作但不加ATP或GTP的平行管为空白对照。核被膜mRNA转运率单位为ng mRNA/mg核被膜蛋白。
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五、统计分析：
酶动力学以最大反应速率(Vmax)反映酶活性和米氏常数(Km)反映酶亲和力，按Eadie-Hofstee方程作图法计算Vmax和Km值。实验结果以均数±标准差(
±s)表示，采用Student-Newman-Keuls检验的方差分析。
结 果
一、大鼠心系数的变化：
心肌肥大组心系数与对照组比较，一周后(肥大早期)较对照组增加16%(2.37±0.26 vs 2.04±0.18 mg/g，P<0.01)，而4周后(肥大晚期)则增加42%(3.12±0.44 vs 2.04±0.18 mg/g，P<0.01),说明腹主动脉狭窄大鼠心肌肥大呈进行性加重。
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二、心肌细胞核被膜质量的鉴定：
在制备的心肌细胞核被膜中细胞核标志酶NAD焦磷酸化酶活性是细胞匀浆的24～27倍，微粒体标志酶NADPH细胞色素c还原酶活性则仅为细胞匀浆的8%～10%，提示制备的核被膜受亚细胞器成分的污染较少(表1)。
表1 各组心肌组织ATP含量及心肌细胞核被膜标志酶活性
Tab 1 Changes of tissue ATP and homogenate and marker enzymes activities in rat hypertrophic cardiomyocytes(±s,n=8)
, 百拇医药 Group
ATP content
(μmol/g tissue)
NAD pyrophosphrase (nmol/mg protein)
NADPH cyto-c-reductase(nmol/mg protein)
Homogenate
NE
Homogenate
NE
Control
5.23±0.24
, 百拇医药
3.68±0.27
88.46±6.44
10.27±0.87
0.97±0.12
Hyper
5.06±0.27
3.28±0.22
90.07±5.55
9.92±0.74
1.02±0.11
Hyper=hypertrophic group; NE=nuclear envelope
, 百拇医药
三、细胞核被膜NTPase动力学的变化：
本实验各组心肌细胞核被膜NTPase活性随底物ATP或GTP浓度增加而升高，NTPase活性动力学饱和曲线为典型的米一曼氏型动力学曲线(图1)。
Fig 1 The staturation curves of nuclear envelope associated NTPase activities 1A:ATP, 1B:GTP
Ctr1=control; Hyper=hypertrophy (*P<0.01, vs Ctrl early) (±s,n=6)
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图1 心肌细胞核被膜NTPase活性饱和曲线
早、晚期对照组之间核被膜NTPase酶最大反应速率Vmax值和Km值相近，差异无显著(P>0.05)；肥大早期组心肌细胞核被膜NTPase活性以ATP或GTP为底物时Vmax值分别较对照组增加62%(P<0.01)和44%(P<0.01)，而亲和力无明显改变(P>0.05)；肥大晚期组心肌细胞核被膜NTPase活性以ATP或GTP为底物时分别较对照组增加25%(P<0.01)和8%(P<0.01)，而亲和力分别较对照组下降22%(P<0.01)和86%(P<0.01)；但与肥大早期组相比，肥大晚期组心肌细胞NTPase活性分别低22%(ATP，P<0.01)和21%(GTP，P<0.01)，而亲和力分别低19%(ATP，P<0.01)和30%(GTP，P<0.01)(表2)。
表2 心肌肥大时大鼠心肌细胞核被膜NTPase动力学变化
, 百拇医药 Tab 2 Dynamics alterations of nuclear envelope associated NTPase activities in rat hypertrophic cardiomyocyte(±s,n=8)
Group
[ATP]
[GTP]
Vmax
Km
Vmax
Km
, 百拇医药
Ctrl early
475±23
38.91±4.01
659±31
37.57±3.88
Hyper early
772±36**
40.54±4.71
945±44**
34.95±3.77
Ctrl late
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485±27
40.30±5.71
694±42
45.55±4.71
Hyper late
606±32**
32.96±3.71**
747±47**
24.44±3.17**
Ctrl early, Hyper early means control and hypertrophic (early) groups respectively; Ctrl late, Hyper late means control and hypertrophic late groups respectively. ** P<0.01， vs control group. The unites are Vmax (nmol Pi.mg-1 protein.min-1) and Km μmol/L respectively
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四、细胞核被膜mRNA转运率的变化：
以2 mmol/L ATP或GTP启动mRNA转运反应时，1 min到10 min内各组心肌细胞核被膜mRNA转运量均呈时间相关性。心肌肥大早期组10 min内细胞核被膜mRNA转运量以ATP或GTP启动反应时较对照组分别增加68%(12.0±1.4 vs 20.2±2.3 ng mRNA /mg核被膜蛋白，P<0.01)与78%(18.1±1.5 vs 32.2±2.8 ng mRNA /mg核被膜蛋白，P<0.01)，而心肌肥大晚期组分别增加27%(12.4±1.4 vs 15.8±1.4 ng mRNA /mg核被膜蛋白，P<0.01)与21%(17.9±1.5 vs 21.7±2.1 ng mRNA/mg核被膜蛋白，P<0.01)；如与早期肥大组相比，肥大晚期组10 min内核被膜mRNA转运量分别低22%(P<0.01，ATP)和33%(P<0.01，GTP)，可见肥大晚期组心肌细胞核被膜mRNA转运量增加程度不如早期组明显(图2)。
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Fig 2 The course of mRNA transport in rat hypertrophic cardiomyocyte (±s) 2A:ATP; 2B:GTP
图2 心肌肥大细胞核被膜mRNA转运的时程变化
讨 论
细胞核内mRNA出核转运是一种耗能的主动转运过程，细胞核被膜核苷三磷酸酶(NTPase)为mRNA的出核转运提供能量。NTPase是一类依赖镁、锰离子水解ATP等多种高能磷酸核苷化合物的水解酶类，该酶对不同高能磷酸化合物的水解作用存在一定的差异性，水解能力依次为UTP>GTP>ITP>CTP[7]。
, 百拇医药
本实验复制了腹主动脉缩窄性大鼠心肌肥大模型，术后1周心系数增加16%，术后4周心系数增加42%，提示大鼠心肌肥厚呈进行性增加。本实验以ATP、GTP为底物分别测定早、晚期心肌细胞核被膜NTPase活性和mRNA转运速率，结果早、晚期NTPase活性均呈持续性增加，并与心肌肥大时细胞核被膜mRNA转运率的增加呈平行关系，但核被膜NTPase活性和mRNA的转运速率增加幅度均低于早期肥大组。结果提示一方面核被膜mRNA转运时对能量的需求与NTPase所提供的能量大小相平行，另一方面也说明心肌肥大时随肥大程度的加重mRNA转运速率也在不断的增加，但增加的幅度已明显低于心肌肥大早期组的幅度。
心肌肥大时肥大性刺激(hypertrophic stimuli)如心脏后负荷的机械力或细胞生长因子的作用可使心肌细胞内蛋白质合成加快，主动脉狭窄后心肌细胞内总RNA量可增加30%～40%。蛋白质合成的增加涉及细胞内基因转录、mRNA表达修饰与出核转运以及mRNA指导下蛋白质翻译等多个环节，显然mRNA出核转运是其中一个不可避免的环节。细胞核被膜NTPasee活性受细胞内外多种因素的影响，如EGF、核被膜的脂肪酸组成与胆固醇含量、细胞内的自由基、细胞核内成熟mRNA的poly(A)结构等[7]。Gupta等发现大鼠心肌核被膜镁离子依赖性NTPas活性可为核内一种分子量为55 000的磷酸化蛋白所调节[8]。结合实验结果我们推测心肌肥大时肥厚性刺激信号经心肌细胞内传递通路作用于细胞内蛋白激酶系统，然后调节核内蛋白磷酸化，进而使核被膜NTPase活性发生改变，促进细胞核mRNA的出核转运，因此mRNA出核转运增加可能是心肌肥厚时蛋白质合成增加的一个重要原因。
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* 国家自然科学基金资助(No.39570300和No.39730220)
参考文献
1 汤 健，周爱儒.心肌肥大的分子生物学基础.北京医科大学学报， 1994，(增刊)：332.
2 Izaurralde E, Mattaj IW.RNA export.Cell, 1995,81:153.
3 Ohkusa T, Hisamatsu Y, Yano M, et al.Altered cardiac hypertrophy in rats.J Mol Cell Cardiol, 1997,29:45.
4 Kaufmann SH, Gibson W, Shaper JH.Characterization of the major polypeptides of the rat liver nuclear envelope.J Biol Chem, 1983,258:2 710.
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5 Tiffany BR, White BC, Krause GS.Nuclear-envelope nucleoside triphosphatase kinetics and mRNA transport following brain ischemia and reperfusion.Ann Emerg Med, 1995, 25: 809.
6 Raess GU, Vincenzi FFD. A semi automated method for the determination of multiple membrane ATPase activities.J Pharmacol Methods, 1980, 4:273.
7 Agutter PS， Prochnow D.Nucleocytoplasmic transport.Biochem J, 1994,300:609.
8 Gupta RC, Yong EF, Ferguxon DG, et al. Regulation of rat cardiac nuclei-associated Mg2+ NTPase by phosphation.Mol Cell Biochem, 1991, 102: 165.
(1998年11月13日收稿， 1999年3月1日修回), 百拇医药
单位：李载权 杨 军 庞永正 唐朝枢 北京医科大学第一医院心血管研究所 (北京 100034)；周爱儒 北京医科大学生物化学与分子生物学系；刘乃奎 北京医科大学心血管基础研究所
关键词：肥大；大鼠；核苷酶类；RNA；核
心肌肥大时细胞核被膜核苷三磷酸酶活性 及mRNA出核转运的变化 摘 要 目的：探讨心肌肥大时心肌细胞mRNA出核转运率及核被膜核苷三磷酸酶(NTPase)活性的变化。方法：采用腹主动脉缩窄法复制大鼠心肌肥大模型，密度梯度离心法制备心肌细胞核被膜，观察心肌肥大时对心肌NTPase活性和成熟mRNA出核转运速率的影响。结果：早、晚期肥大组心肌细胞核被膜NTPase最大反应速率以ATP为底物时较对照组增加25%～62%(P<0.01)，以GTP为底物时增加8%～44%(P<0.01)，其中晚期肥大组NTPase最大反应速率增加幅度低于早期组。早期肥大组细胞核被膜NTPase Km值不变，晚期组NTPase Km值下降，以ATP和GTP为底物时晚期肥大组Km值分别下降22%和86%。早期肥大组10 min心肌细胞核mRNA出核转运率以ATP或GTP启动反应时分别较对照组增加68%(P<0.01)或78%(P<0.01)，晚期肥大组增加幅度不如早期组大，仅增加27%和21.7%(P<0.01)。 结论：大鼠心肌肥大组细胞核被膜mRNA出核转运率的增加可能是心肌肥大时蛋白质合成增加的一个重要原因，而这种mRNA出核转运率的增加可能与核被膜NTPase活性的增加有关。
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Alteration of cardiomyocyte nuclear enveloped associated NTPase activities
and mRNA transport in rat hypertrophy
LI Zai-Quan, YANG Jun, PANG Yong-Zhen, ZHOU Ai-Ru, TANG Chao-Su, LIU Nai-Kui
Institute of Cardiovascular Research, The First Hospital,Beijing Medical University, Beijing (100034)
Abstract AIM and METHODS: To oberserve the possible alterations of mRNA nucleocytoplasmic transport and nuclear envelope associated NTPase activity during rat heart hypertrophy(Hyper), cardiomyocyte nuclear envelope portions were prepared by density gradient centrifugation methods from heart hypertrophic rat model and were further detected for their mRNA transport rates and NTPase activities. RESULTS: The hypertrophic cardiomyocyte NTPase Vmax values at 1 week group(early hyper) and 4 week group(late hyper) were all increased significantly in both of ATP and GTP as substrates with much higher argumental extent in early hyper group; their Km values were kept constant in early hyper group and were decreased only in late hyper groups. The 10 min mRNA transport amounts in early hyper as well as late hyper groups in both ATP and GTP initial activators was correspondingly enhanced significantly also. CONCLUSION: The increased mRNA transport during rat heart hypertrophy might be one of the important reasons of their increase in protein synthesis, attributing to the nuclear envelope associated NTPase activities contributions.
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MeSH Hypertrophy； Rat； Nucleosidases； RNA, nuclear
心肌肥大(cardiac hypertrophy)是心肌细胞及其间质细胞受到机械牵张及生长因子刺激后，心肌细胞内一系列与细胞生长、增殖有关的多种基因表达发生变化的一种适应性反应过程。心肌细胞接受刺激后通过增加蛋白质的表达决定着心肌肥大的发生、发展及其预后[1]。蛋白质表达的变化涉及蛋白质基因的转录、mRNA表达、修饰和降解、mRNA出核转运以及mRNA指导下蛋白质翻译等多个环节。位于细胞核被膜的核苷三磷酸酶(nucleoside triphosphatase，NTPase)是细胞核被膜mRNA出核转运的限速酶，它通过水解ATP或GTP中高能磷酸键并释放能量来促进核内成熟mRNA穿过核孔复合体进入胞浆[2]。但心肌肥大时心肌细胞核被膜mRNA转运和NTPase活性是否发生变化尚未见报道，本工作在腹主动脉缩窄引起的大鼠心肌肥大模型上，观察心肌细胞核被膜NTPase活性的动力学变化及细胞核mRNA出核转运速率的变化，以探讨心肌肥大时细胞内蛋白质合成增加的分子机制。
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材料与方法
一、 大鼠心肌肥大模型的复制：
体重270～320克，健康雄性SD大鼠。术前禁食12 h，自由饮水。腹腔注射戊巴比妥钠(40 mg/kg)麻醉下打开腹腔，于左肾动脉上方腹主动脉旁置一0.8 mm号针头，穿线结扎后抽出针头以缩窄腹主动脉[3]，随即缝合切口。术后大鼠分别喂养1周(肥大早期组)和喂养4周(肥大晚期组)，经戊巴比妥钠麻醉后处死，摘取心脏并称重，以心肌湿重与体重之比即心系数衡量心肌肥大程度。假手术对照组大鼠除腹主动脉不作缩窄处理外，其余操作同心肌肥大组。
二、大鼠心肌细胞核被膜的分离纯化[4]：
将大鼠心肌组织加入匀浆缓冲液(mmol/L：250 蔗糖, 10 Tris-HCl pH7.4, 3 MgCl2，0.1 PMSF)用Teflon匀浆器匀浆；1 200×g 10 min离心后取沉淀部分进行蔗糖密度梯度离心(4℃ 120 000×g 60 min)，收集密度为55%～67%蔗糖层的心肌细胞核，加入DNase I和煮沸过的RNase A孵育以除去心肌细胞核内的DNA和RNA，然后调节心肌细胞核溶液中NaCl浓度为1.6 mol/L, 1600×g离心30 min除去心肌细胞核内盐溶物，收获心肌细胞核被膜用Lowry法测定并调整核被膜蛋白浓度为1 mg蛋白/mL，置于-70℃保存备用。按Tiffany等[5]的方法分别测定心肌组织匀浆和细胞核被膜中细胞核标志酶NAD焦磷酸化酶与微粒体标志酶NADPH细胞色素c还原酶活性及心肌组织中ATP含量。
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三、心肌细胞核被膜NTPase活性测定：
取25 μL 细胞核被膜悬浮在200 μL缓冲液(mmol/L：250 蔗糖， 50 Tris-HCl pH 7.4，1 MgCl2，5 EDTA)中30℃预温育10 min，然后分别加入5 μmol/L到1 mmol/L 不同浓度的ATP或GTP启动NTPase酶促反应，温育10 min后加入10%SDS并置冰浴中以终止反应。再按Raess法[6]测定反应所产生的无机磷(Pi)含量，计算相应NTPase的酶活性(单位：nmol Pi.mg-1 pro.min-1)。
预实验结果表明温育时间在30 min内NTPase活性与底物ATP或GTP的温育时间成直线关系。本实验测定心肌组织ATP含量时发现心肌肥大组ATP含量与对照组相近(P>0.05)，因此心肌肥大组核被膜NTPase活性的改变并非是由ATP底物量的变动造成的。
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四、核被膜mRNA转运率的测定[5]：
[3H]-poly(A)+mRNA的制备： 将酵母菌(saccharomyces cerevisiae)接种在含有6.75×106 Bq/L [3H]标记的尿嘧啶酵母培养基中，培养、收获酵母菌并用RNA分离试剂盒(bulletin 1,TEL-TEST“B”)以及7型寡聚(dT)-纤维素层析柱分离纯化[3H]-poly(A) +mRNA，置-70℃保存。[3H]-poly(A)+mRNA的比放性为101.7×103 counts.min-1.μg-1 RNA。
核被膜mRNA转运率的测定：冰浴中于5 μg [3H]-poly(A)+ mRNA上依次铺加10 μL 60%的HClO4，40 μL的硅酮油和150 μL经封闭液(mmol/L：10 Tris-HCl pH8.0, 30 KCl, 100 NaCl, 3 MgCl2, 0.5 CaCl2) 处理后的核被膜悬液，在30℃条件下分别加入2 mmol/L的ATP或GTP以启动 mRNA出核转运的反应。经不同转运反应时间后离心终止反应，取上清液层测定放射活性，代表核被膜所转运的mRNA，以同样操作但不加ATP或GTP的平行管为空白对照。核被膜mRNA转运率单位为ng mRNA/mg核被膜蛋白。
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五、统计分析：
酶动力学以最大反应速率(Vmax)反映酶活性和米氏常数(Km)反映酶亲和力，按Eadie-Hofstee方程作图法计算Vmax和Km值。实验结果以均数±标准差(
±s)表示，采用Student-Newman-Keuls检验的方差分析。结 果
一、大鼠心系数的变化：
心肌肥大组心系数与对照组比较，一周后(肥大早期)较对照组增加16%(2.37±0.26 vs 2.04±0.18 mg/g，P<0.01)，而4周后(肥大晚期)则增加42%(3.12±0.44 vs 2.04±0.18 mg/g，P<0.01),说明腹主动脉狭窄大鼠心肌肥大呈进行性加重。
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二、心肌细胞核被膜质量的鉴定：
在制备的心肌细胞核被膜中细胞核标志酶NAD焦磷酸化酶活性是细胞匀浆的24～27倍，微粒体标志酶NADPH细胞色素c还原酶活性则仅为细胞匀浆的8%～10%，提示制备的核被膜受亚细胞器成分的污染较少(表1)。
表1 各组心肌组织ATP含量及心肌细胞核被膜标志酶活性
Tab 1 Changes of tissue ATP and homogenate and marker enzymes activities in rat hypertrophic cardiomyocytes(
±s,n=8), 百拇医药 Group
ATP content
(μmol/g tissue)
NAD pyrophosphrase (nmol/mg protein)
NADPH cyto-c-reductase(nmol/mg protein)
Homogenate
NE
Homogenate
NE
Control
5.23±0.24
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3.68±0.27
88.46±6.44
10.27±0.87
0.97±0.12
Hyper
5.06±0.27
3.28±0.22
90.07±5.55
9.92±0.74
1.02±0.11
Hyper=hypertrophic group; NE=nuclear envelope
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三、细胞核被膜NTPase动力学的变化：
本实验各组心肌细胞核被膜NTPase活性随底物ATP或GTP浓度增加而升高，NTPase活性动力学饱和曲线为典型的米一曼氏型动力学曲线(图1)。
Fig 1 The staturation curves of nuclear envelope associated NTPase activities 1A:ATP, 1B:GTP
Ctr1=control; Hyper=hypertrophy (*P<0.01, vs Ctrl early) (
±s,n=6), 百拇医药
图1 心肌细胞核被膜NTPase活性饱和曲线
早、晚期对照组之间核被膜NTPase酶最大反应速率Vmax值和Km值相近，差异无显著(P>0.05)；肥大早期组心肌细胞核被膜NTPase活性以ATP或GTP为底物时Vmax值分别较对照组增加62%(P<0.01)和44%(P<0.01)，而亲和力无明显改变(P>0.05)；肥大晚期组心肌细胞核被膜NTPase活性以ATP或GTP为底物时分别较对照组增加25%(P<0.01)和8%(P<0.01)，而亲和力分别较对照组下降22%(P<0.01)和86%(P<0.01)；但与肥大早期组相比，肥大晚期组心肌细胞NTPase活性分别低22%(ATP，P<0.01)和21%(GTP，P<0.01)，而亲和力分别低19%(ATP，P<0.01)和30%(GTP，P<0.01)(表2)。
表2 心肌肥大时大鼠心肌细胞核被膜NTPase动力学变化
, 百拇医药 Tab 2 Dynamics alterations of nuclear envelope associated NTPase activities in rat hypertrophic cardiomyocyte(
±s,n=8)Group
[ATP]
[GTP]
Vmax
Km
Vmax
Km
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Ctrl early
475±23
38.91±4.01
659±31
37.57±3.88
Hyper early
772±36**
40.54±4.71
945±44**
34.95±3.77
Ctrl late
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485±27
40.30±5.71
694±42
45.55±4.71
Hyper late
606±32**
32.96±3.71**
747±47**
24.44±3.17**
Ctrl early, Hyper early means control and hypertrophic (early) groups respectively; Ctrl late, Hyper late means control and hypertrophic late groups respectively. ** P<0.01， vs control group. The unites are Vmax (nmol Pi.mg-1 protein.min-1) and Km μmol/L respectively
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四、细胞核被膜mRNA转运率的变化：
以2 mmol/L ATP或GTP启动mRNA转运反应时，1 min到10 min内各组心肌细胞核被膜mRNA转运量均呈时间相关性。心肌肥大早期组10 min内细胞核被膜mRNA转运量以ATP或GTP启动反应时较对照组分别增加68%(12.0±1.4 vs 20.2±2.3 ng mRNA /mg核被膜蛋白，P<0.01)与78%(18.1±1.5 vs 32.2±2.8 ng mRNA /mg核被膜蛋白，P<0.01)，而心肌肥大晚期组分别增加27%(12.4±1.4 vs 15.8±1.4 ng mRNA /mg核被膜蛋白，P<0.01)与21%(17.9±1.5 vs 21.7±2.1 ng mRNA/mg核被膜蛋白，P<0.01)；如与早期肥大组相比，肥大晚期组10 min内核被膜mRNA转运量分别低22%(P<0.01，ATP)和33%(P<0.01，GTP)，可见肥大晚期组心肌细胞核被膜mRNA转运量增加程度不如早期组明显(图2)。
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Fig 2 The course of mRNA transport in rat hypertrophic cardiomyocyte (
±s) 2A:ATP; 2B:GTP图2 心肌肥大细胞核被膜mRNA转运的时程变化
讨 论
细胞核内mRNA出核转运是一种耗能的主动转运过程，细胞核被膜核苷三磷酸酶(NTPase)为mRNA的出核转运提供能量。NTPase是一类依赖镁、锰离子水解ATP等多种高能磷酸核苷化合物的水解酶类，该酶对不同高能磷酸化合物的水解作用存在一定的差异性，水解能力依次为UTP>GTP>ITP>CTP[7]。
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本实验复制了腹主动脉缩窄性大鼠心肌肥大模型，术后1周心系数增加16%，术后4周心系数增加42%，提示大鼠心肌肥厚呈进行性增加。本实验以ATP、GTP为底物分别测定早、晚期心肌细胞核被膜NTPase活性和mRNA转运速率，结果早、晚期NTPase活性均呈持续性增加，并与心肌肥大时细胞核被膜mRNA转运率的增加呈平行关系，但核被膜NTPase活性和mRNA的转运速率增加幅度均低于早期肥大组。结果提示一方面核被膜mRNA转运时对能量的需求与NTPase所提供的能量大小相平行，另一方面也说明心肌肥大时随肥大程度的加重mRNA转运速率也在不断的增加，但增加的幅度已明显低于心肌肥大早期组的幅度。
心肌肥大时肥大性刺激(hypertrophic stimuli)如心脏后负荷的机械力或细胞生长因子的作用可使心肌细胞内蛋白质合成加快，主动脉狭窄后心肌细胞内总RNA量可增加30%～40%。蛋白质合成的增加涉及细胞内基因转录、mRNA表达修饰与出核转运以及mRNA指导下蛋白质翻译等多个环节，显然mRNA出核转运是其中一个不可避免的环节。细胞核被膜NTPasee活性受细胞内外多种因素的影响，如EGF、核被膜的脂肪酸组成与胆固醇含量、细胞内的自由基、细胞核内成熟mRNA的poly(A)结构等[7]。Gupta等发现大鼠心肌核被膜镁离子依赖性NTPas活性可为核内一种分子量为55 000的磷酸化蛋白所调节[8]。结合实验结果我们推测心肌肥大时肥厚性刺激信号经心肌细胞内传递通路作用于细胞内蛋白激酶系统，然后调节核内蛋白磷酸化，进而使核被膜NTPase活性发生改变，促进细胞核mRNA的出核转运，因此mRNA出核转运增加可能是心肌肥厚时蛋白质合成增加的一个重要原因。
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* 国家自然科学基金资助(No.39570300和No.39730220)
参考文献
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8 Gupta RC, Yong EF, Ferguxon DG, et al. Regulation of rat cardiac nuclei-associated Mg2+ NTPase by phosphation.Mol Cell Biochem, 1991, 102: 165.
(1998年11月13日收稿， 1999年3月1日修回), 百拇医药