低氧肺微血管内皮细胞培养液对肺动脉平滑肌细胞的作用
作者：王关嵩 钱桂生 杨晓静 陈维中 谢崧
单位：第三军医大学新桥医院呼吸内科研究所(重庆 400037)
关键词：
中国病理生理杂志991030
慢性阻塞性肺病作为临床上的常见病，严重危害人们健康，对其病理进程已有多年研究，认识到低氧可以导致肺血管平滑肌细胞增生，肺腺泡及微血管的构型改建。既往人们注意到肺内皮细胞可以分泌一些物质调节平滑肌细胞增生。关于肺微血管内皮细胞(pulmonary microvascular endothelial cell,PMEC)低氧状态下与平滑肌细胞的关系研究甚少，然而，肺微血管内皮细胞却是最早感受低氧的细胞之一。本研究通过离体培养的大鼠PMEC和大鼠肺动脉平滑肌细胞(pulmonary arterial smooth muscle cell,PASMC)，从细胞相互作用的角度研究低氧对PASMC的作用。
, 百拇医药
材料与方法
一、 大鼠PMEC和PASMC的培养与鉴定：
取健康成年Wistar大鼠，依本研究所已经建立的方法培养PMEC和PASMC。
二、 PMEC缺氧处理及培养液的制备：
用低氧舱对PMEC处理24 h后，另备常氧组。收集PMEC的常氧培养液(normoxia conditioned medium,NM)；和低氧培养液(hypoxia conditioned medium,HM)；-20℃冻存备用。
三、 PASMC的处理：
将培养至第4代的PASMC用1%小牛血清培养24 h后，分组：常氧组(normoxia group,N)，低氧组(1%O2;hypoxia group,H)，NM组和HM组。每组24孔样本，观察各组PASMC的生长状况。
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四、细胞周期的检测：
将PASMC悬液以2×104/mL细胞密度接种培养瓶(25 mL)内培养24 h后，分组再处理24 h，收集细胞，冰浴，70%酒精固定后碘化丙锭染定，用流式细胞仪(FACStar,Becton Dickinson)检测各周期的细胞数及占总细胞数的百分比。用FITC染色后用绿色荧光测蛋白质含量。
五、[3H]-TdR摄取量的测定：
取PASMC悬液，以5×104/mL放入24孔培养板培养24 h，N组和H组换无血清M199培养液，NM组和HM组换成NM组和HM组培养，除H组缺氧外，其余各组均为常氧培养。18 h时各孔加4.625×107 Bq的[3H]-TdR，24 h时收取样本，用β-液体闪烁计数(Backman β LKB-1217)测每钟衰变数(dpm)。
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六、 统计处理：
所得数据采用单因素方差分析，结果数据以x±±s表示。细胞周期数采用总体率假设检验，[3H]-TdR量采用t检验。
结果
一、 显微镜和电镜观察PASMC：
HM组的PASMC在光镜下可见细胞呈棱形，胞体增大，细胞聚集，排列有明显向极性。电镜下可见胞核较大，胞浆内含丰富的粗面内质网，线粒体等细胞器。H组的细胞也呈棱形增生，细胞均匀分布，无向极性。H组和NM组细胞形态相似，均呈现扁平形，有多个胞浆突起，细胞稀疏分散。
二、 HM对PASMC[3H]-TdR摄取量的影响：
HM组PASMC的[3H]-TdR摄取量明显高于其它3组(P<0.01)。N组与H组相比也有显著差异(P<0.05)。见表1。
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表1 低氧肺微血管内皮细胞培养液对肺动脉平滑肌细胞[3H]-TdR的作用
Tab 1 The effect of hypoxia conditioned medium on [3H]-TdR in PASMC(dpm/104 cells) Group
1
2
3
4
5
x±±s
Hypoxia
4237
, 百拇医药
4052
4787
4239
4979
4458.80±400.41△
Normal
3298
3312
3007
3295
3318
3246.00±133.94
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Hypoxia conditioned medium
6032
6505
6807
6425
6348
6423.40±279.59**
Normoxia conditioned medium
4227
4197
3752
, http://www.100md.com
4283
4135
4109.80±203.98△
△P<0.05,vs normal group; **P<0.01,vs normoxia conditioned group,normal group and hypoxia group
三、 HM对细胞周期和蛋白质含量的影响：
HM组的PASMC的S期细胞数最多，与其它3组相比有非常显著差异(P<0.01)。N组和NM组的S期细胞数均和H组有显著差异(P<0.01)。NM组的蛋白质含量较高。HM组蛋白质含量最低。见表2。
表2 低氧肺微血管内皮细胞培养液对PASMC的细胞周期和蛋白含量的影响
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Tab 2 The effect of hypoxia conditioned medium on cell phase and proterin contents of PASMC(%) Group
G0/G1
S
G2/M
Total protein
Hypoxia
2925(86.28)
437(12.89)
28(0.83)
, 百拇医药
61.58△
Normal
3824(49.38)
3652(47.13)
268(3.46)
88.37
Hypoxia conditioned medium
3885(55.55)
2437(38.84)△**
672(9.61)
41.26**
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Normoxia conditioned medium
1668(25.91)
4439(68.51)
372(5.74)
79.83
△P<0.05,vs normal group; **P<0.01,vs normoxia conditioned group,normal group and hypoxia group
讨论
肺循环在循环系统中具有重要的调节作用，它具有低阻力和低压力的特点。通过肺微循环可以进行物质与气体交换，是保证肺及其相关组织的血管完成正常生理功能的前提。本实验的结果表明，低氧的肺微血管内皮细胞的培养液可以促进PASMC的增生，使其[3H]-TdR摄取量明显升高，S期细胞核增多。同时低氧条件的PASMC也呈增生状态，而且常氧条件下培养的微血管内皮细胞的培养液对PASMC也有轻微的促增殖效应。说明在慢性低氧的过程中，PASMC的增殖所受影响的原因很复杂。本实验提示低氧对PASMC的增生，除了有它自身所受的直接效应外，微血管内皮细胞的旁分泌作用可能处于重要地位。
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已有研究指出微血管内皮细胞能够合成和分泌多种生长因子和活性物质，参与免疫反应和物质代谢并调节心血管功能，其中许多物质调节平滑肌细胞增殖，包括内皮素，血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial cell growth factor,VEGF)，一氧化氮等。而内皮素和VEGF是强烈促平滑肌细胞增殖的物质。此外低氧还可以使PMEC形成新的毛细胞血管网络。故推测，生理状态下，抑制和促进平滑肌细胞生长的物质处于一种动态平衡状态。低氧等病理状态下，可能促进生长的物质或因子处于优势，从而使平滑肌细胞出现异常增生。
*国家自然科学基金资助(No.3970057)
(1999年2月10日收稿，1999年6月17日修回), 百拇医药
单位：第三军医大学新桥医院呼吸内科研究所(重庆 400037)
关键词：
中国病理生理杂志991030
慢性阻塞性肺病作为临床上的常见病，严重危害人们健康，对其病理进程已有多年研究，认识到低氧可以导致肺血管平滑肌细胞增生，肺腺泡及微血管的构型改建。既往人们注意到肺内皮细胞可以分泌一些物质调节平滑肌细胞增生。关于肺微血管内皮细胞(pulmonary microvascular endothelial cell,PMEC)低氧状态下与平滑肌细胞的关系研究甚少，然而，肺微血管内皮细胞却是最早感受低氧的细胞之一。本研究通过离体培养的大鼠PMEC和大鼠肺动脉平滑肌细胞(pulmonary arterial smooth muscle cell,PASMC)，从细胞相互作用的角度研究低氧对PASMC的作用。
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材料与方法
一、 大鼠PMEC和PASMC的培养与鉴定：
取健康成年Wistar大鼠，依本研究所已经建立的方法培养PMEC和PASMC。
二、 PMEC缺氧处理及培养液的制备：
用低氧舱对PMEC处理24 h后，另备常氧组。收集PMEC的常氧培养液(normoxia conditioned medium,NM)；和低氧培养液(hypoxia conditioned medium,HM)；-20℃冻存备用。
三、 PASMC的处理：
将培养至第4代的PASMC用1%小牛血清培养24 h后，分组：常氧组(normoxia group,N)，低氧组(1%O2;hypoxia group,H)，NM组和HM组。每组24孔样本，观察各组PASMC的生长状况。
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四、细胞周期的检测：
将PASMC悬液以2×104/mL细胞密度接种培养瓶(25 mL)内培养24 h后，分组再处理24 h，收集细胞，冰浴，70%酒精固定后碘化丙锭染定，用流式细胞仪(FACStar,Becton Dickinson)检测各周期的细胞数及占总细胞数的百分比。用FITC染色后用绿色荧光测蛋白质含量。
五、[3H]-TdR摄取量的测定：
取PASMC悬液，以5×104/mL放入24孔培养板培养24 h，N组和H组换无血清M199培养液，NM组和HM组换成NM组和HM组培养，除H组缺氧外，其余各组均为常氧培养。18 h时各孔加4.625×107 Bq的[3H]-TdR，24 h时收取样本，用β-液体闪烁计数(Backman β LKB-1217)测每钟衰变数(dpm)。
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六、 统计处理：
所得数据采用单因素方差分析，结果数据以x±±s表示。细胞周期数采用总体率假设检验，[3H]-TdR量采用t检验。
结果
一、 显微镜和电镜观察PASMC：
HM组的PASMC在光镜下可见细胞呈棱形，胞体增大，细胞聚集，排列有明显向极性。电镜下可见胞核较大，胞浆内含丰富的粗面内质网，线粒体等细胞器。H组的细胞也呈棱形增生，细胞均匀分布，无向极性。H组和NM组细胞形态相似，均呈现扁平形，有多个胞浆突起，细胞稀疏分散。
二、 HM对PASMC[3H]-TdR摄取量的影响：
HM组PASMC的[3H]-TdR摄取量明显高于其它3组(P<0.01)。N组与H组相比也有显著差异(P<0.05)。见表1。
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表1 低氧肺微血管内皮细胞培养液对肺动脉平滑肌细胞[3H]-TdR的作用
Tab 1 The effect of hypoxia conditioned medium on [3H]-TdR in PASMC(dpm/104 cells) Group
1
2
3
4
5
x±±s
Hypoxia
4237
, 百拇医药
4052
4787
4239
4979
4458.80±400.41△
Normal
3298
3312
3007
3295
3318
3246.00±133.94
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Hypoxia conditioned medium
6032
6505
6807
6425
6348
6423.40±279.59**
Normoxia conditioned medium
4227
4197
3752
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4283
4135
4109.80±203.98△
△P<0.05,vs normal group; **P<0.01,vs normoxia conditioned group,normal group and hypoxia group
三、 HM对细胞周期和蛋白质含量的影响：
HM组的PASMC的S期细胞数最多，与其它3组相比有非常显著差异(P<0.01)。N组和NM组的S期细胞数均和H组有显著差异(P<0.01)。NM组的蛋白质含量较高。HM组蛋白质含量最低。见表2。
表2 低氧肺微血管内皮细胞培养液对PASMC的细胞周期和蛋白含量的影响
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Tab 2 The effect of hypoxia conditioned medium on cell phase and proterin contents of PASMC(%) Group
G0/G1
S
G2/M
Total protein
Hypoxia
2925(86.28)
437(12.89)
28(0.83)
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61.58△
Normal
3824(49.38)
3652(47.13)
268(3.46)
88.37
Hypoxia conditioned medium
3885(55.55)
2437(38.84)△**
672(9.61)
41.26**
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Normoxia conditioned medium
1668(25.91)
4439(68.51)
372(5.74)
79.83
△P<0.05,vs normal group; **P<0.01,vs normoxia conditioned group,normal group and hypoxia group
讨论
肺循环在循环系统中具有重要的调节作用，它具有低阻力和低压力的特点。通过肺微循环可以进行物质与气体交换，是保证肺及其相关组织的血管完成正常生理功能的前提。本实验的结果表明，低氧的肺微血管内皮细胞的培养液可以促进PASMC的增生，使其[3H]-TdR摄取量明显升高，S期细胞核增多。同时低氧条件的PASMC也呈增生状态，而且常氧条件下培养的微血管内皮细胞的培养液对PASMC也有轻微的促增殖效应。说明在慢性低氧的过程中，PASMC的增殖所受影响的原因很复杂。本实验提示低氧对PASMC的增生，除了有它自身所受的直接效应外，微血管内皮细胞的旁分泌作用可能处于重要地位。
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已有研究指出微血管内皮细胞能够合成和分泌多种生长因子和活性物质，参与免疫反应和物质代谢并调节心血管功能，其中许多物质调节平滑肌细胞增殖，包括内皮素，血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial cell growth factor,VEGF)，一氧化氮等。而内皮素和VEGF是强烈促平滑肌细胞增殖的物质。此外低氧还可以使PMEC形成新的毛细胞血管网络。故推测，生理状态下，抑制和促进平滑肌细胞生长的物质处于一种动态平衡状态。低氧等病理状态下，可能促进生长的物质或因子处于优势，从而使平滑肌细胞出现异常增生。
*国家自然科学基金资助(No.3970057)
(1999年2月10日收稿，1999年6月17日修回), 百拇医药