单侧输尿管梗阻后小鼠肾脏环氧化酶-2的表达及其意义*
作者：林洪丽 陈香美 程庆砾 张颖 叶一舟
单位：解放军肾脏病重点实验室，解放军总医院肾科(北京 100853)
关键词：前列腺素内过氧化物合酶；输尿管梗阻；肾疾病
中国病理生理杂志991025 摘要 目的：观察环氧化酶-2(COX-2)在单侧输尿管梗阻小鼠梗阻肾脏内的表达情况，探讨COX-2在炎性肾脏疾病中病理生理作用。方法：利用RT-PCR检测了COX-2在小鼠单侧输尿管梗阻后4 h、24 h、72 h、 5 d和7 d的表达变化并采用PAS染色观察上述各时间点的肾组织病理改变。结果：单侧输尿管梗阻术后4 h肾皮质中的COX-2的表达开始增高，72 h达到高峰。术后第一天肾间质中可见少量炎细胞浸润，第3 d明显增多，第7 d达到高峰。结论：本研究提示COX-2的过度表达很可能是单侧输尿管梗阻后肾内炎细胞浸润和积聚的起始或促进因素之一。
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Expression of cyclooxygenase-2 in kidneys of mice with unilateral ureteral obstruction
LIN Hong-Li,CHEN Xiang-Mei,CHENG Qing-Li,ZHANG Ying;YE Yi-Zhou
Dept. of Nephrology,General Hospital of Chinese PLA,Beijing (100853)
Abstract AIM:Cyclooxygenase-2(COX-2) is an inducible cyclooxygenase which may play an important role in inflammatory diseases.METHODS：To examine the involvement of COX-2 in the inflammatory renal diseases in vivo,the expression of this gene was detected in kidneys of mice that receiving unilateral ureteral obstruction(UUO) at 4-hours,24-hours,72-hours,5-days,7-days by RT-PCR method. The morphological changes of the obstructed kidneys were observed at the same time point.RESULTS：The results demonstrated that the expression of COX-2 mRNA were beginning to increase at 4-hours,were up to peak at 72-hours after UUO operation . A few numbers of infiltrating inflammatory cells were found at 24-hours,a large humbers of infiltrating inflammatory cells were found 72-hours,and the peak of the numbers of those cells was at 7-days after UUO operation.CONCLUSION：COX-2 expression is upregulated in the obstracted kidneys of UUO mice. The overexpression of COX-2 may be an inducing or promoting factor in inflammatory cells infiltration in the kidney of UUO mice.
, 百拇医药
MeSH Prostaglandin-endoperoxide synthase;Ureteral obstruction;Kidney disease
环氧化酶(cyclooxygenase,COX)是前列腺素的生物合成酶。COX-2是1992年新发现与炎症相关的COX的同工酶[1]，其在炎症病变中起着重要的作用。最近，国外学者报道了在体外培养的肾脏系膜细胞上COX-2可以被IL-1和TNF诱导表达增强[2]。单侧输尿管梗阻(unilateral ureteral obstruction,UUO)后的肾脏病变特征是肾间质的炎症性改变，我们利用这一模型观察了小鼠输尿管梗阻后肾组织内COX-2表达的变化及其肾脏炎细胞浸润的关系，旨在探讨COX-2在炎性肾脏疾病中的作用。
材料与方法
一、实验设计及动物分组：
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NIH雌性小鼠：6～8周龄，体重20～22 g，由中国人民解放军总医院实验动物中心提供。35只雌性NIH小鼠在行单侧输尿管结扎术后随机分为5组，每组7只，分别于术后4 h、24 h、 3 d、 5 d、7 d处死动物，留取梗阻侧肾脏，将其分为两部分，一部分作光镜标本行病理形态分析，另一部分以液氮冷冻后提取RNA。另取7只雌性NIH小鼠同时行假手术作为对照，即除不进行单侧输尿管结扎外，余手术方式和实验方法同前。
二、材料：
TRIzol试剂和热启动PCR试剂盆：GIBCOBRL公司。逆转录试剂盒：Promega公司。COX-2引物：参照文献[7]设计，引物序列为：Sense:5'-ACT CAC TCAGTT TGT TGA GTC ATTC-3' antisense:5'-TTTGAT TAG TAC TGT AGG GTT AATG-3’，由美国Cybersyn公司合成。U-2000 A型紫外分光光度计：日本Hitachi公司。PCR仪：美国MJ Research Inc公司。
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三、小鼠UUO模型制备：
小鼠以10%水合氯醛按0.4 mL/kg体重的剂量腹腔注射麻醉后，于腹部左侧切口，暴露左侧输尿管后进行双重结扎，中间离断，逐层缝合腹膜、皮肤。假手术组除不结扎离断输尿管外均与手术组相同。
四、肾组织病理改变：
以4%多聚甲醛固定液固定肾组织，常规切片，PAS染色后，光镜下观察肾间质炎细胞的浸润程度。
五、RNA提取：
按TRIzol试剂盒提供的方法提取肾组织总RNA：取以上各组肾脏皮质约100 mg，加2 mL TRIzol匀浆，等体积异丙醇沉淀，70%乙醇洗涤2次，真空干燥10 min，加DEPC水溶解，取1 μL RNA溶液用紫外分光光度计测定光密度，并计算RNA浓度，取1 μg的RNA电泳观察RNA的质量。
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六、RT-PCR：
5 μg的肾组织总RNA，100℃变性后，加入逆转录试剂盒中的oligodT、 dNTPs、DTT、逆转录酶后，混匀于37℃孵育1 h。取1 μL逆转录产物，100℃变性3 min后，75℃热启动3 min，94℃30 s、60℃30 s、72℃60 s，30个循环于PCR仪上进行COX-2扩增。同时扩增β-actin作为内参照。PCR产物在1%琼脂糖凝胶中电泳(电压100 V，时间30 min)，于紫外线下观察，利用图像分析系统分别测定扩增条带的光密度值。比较各组COX-2与β-actin光密度比值。
七、统计学方法：
研究组间计量资料的统计学处理用t检验法。
结果
一、小鼠单侧输尿管梗阻后肾脏的病理改变：
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与假手术组小鼠相比，UUO术后4 h肾内未见明确的病理变化，1 d后见小血管周围有少量的炎细胞浸润，第3 d时炎细胞浸润增多，在血管及部分肾小管周围均可见较多的炎细胞浸润。第5 d及第7 d时炎细胞浸润明显增多并达到高峰。
二、小鼠单侧输尿管梗阻肾皮质COX-2表达的变化：
RT-PCR的结果显示：与假手术组小鼠比较，单侧输尿管梗阻后仅4 h小鼠梗阻侧肾皮质中即可见COX-2的表达轻度增强，于第24 h明显增强，第72 h达到高峰，以后小鼠梗阻侧肾皮质中COX-2的表达逐渐减弱，于第7 d时最低(图1A)。分析各组COX-2与β-actin光密度比值发现，UUO术后4 h、24 h、3 d、5 d各组小鼠的光密度比值明显高于假手术组(P<0.01)，梗阻第7 d小鼠肾皮质COX-2的表达与假手术组小鼠肾脏比较，其差异无明显(图1B)。
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Fig 1A： RT-PCR result of COX-2 expression in kidneys of UUO mice
1:Marker,2: sham-operated,3: 4 hours after UUO,4: 24 hours after UUO,5: 72 hours after UUO,6:5 days after UUO,7:7 days after UUO
图1A： 单侧输尿管梗阻肾组织COX-2表达RT-PCR结果
Fig 1B Density scanning of COX-2 expression in renal tissues of UUO mice
P<0.01 vs control,n=7
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图1B COX-2在单侧输尿管梗阻肾组织中的表达的图像密度扫描
讨论
COX-2是前列腺素合成起始步骤的关键酶，除大脑以外，体内其他器官中COX-2的生理表达都较低[3]，在内皮细胞、巨噬细胞和成纤维细胞中COX-2可以被炎症因子所诱导产生[4]。最近的研究表明COX-2在人的风湿性关节炎、大鼠的炎性关节炎的关节滑膜中及大鼠的炎性结肠炎时的表达明显增高[5，6]。COX-2与肾脏炎症及免疫反应的研究进展迅速，但多为体外细胞培养的研究[7]。
小鼠单侧输尿管梗阻可引起肾小管内压增高而导致小管上皮及肾间质血管的损伤，分泌和释放大量炎症因子，如IL-1，TNFα等，这些细胞因子在体外实验中已被证实可诱导肾脏细胞COX-2的表达上调，同时肾间质中浸润的单核巨噬细胞也是COX-2的重要来源。本文的研究结果表明：输尿管梗阻4 h后小鼠肾内COX-2的表达即开始增高，这与Chida等[8]报告的低氧3 h后肺组织的COX-2的表达即增高的结果是相似的。另外研究证实，炎症部位的前列腺素的合成增多是COX-2过度表达的结果，前列腺素是重要的炎症介质，增多的前列腺素本身又可激起更多的炎细胞积聚，加重局部的炎症反应，形成恶性循环。本研究及我们以前的研究结果[9]均发现小鼠肾脏在单侧输尿管梗阻术后第1 d出现少量的炎细胞浸润，第3 d增多，第5～7 d达到高峰。由于梗阻肾脏间质的炎性病变出现及达到峰值的时间略晚于COX-2的变化，因此我们认为在这一肾组织的病理改变中，COX-2的过度表达很可能是其起始或/和促进因素之一，抑制其表达对于治疗肾脏的炎性病变可能具有一定意义。
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参考文献
1 Feng L,Sun W,Xia Y,et al. Cloning two isoforms of rat cyclooxygenase and differential regulation of the expression. Arch Biochem Biophys,1993,307:361.
2 Jones DA,Carlton CP,McIntyre TM,et al. Molecular cloning of human prostaglandin endoperoxidase syntheses type and demonstration of expression in response to cytokines. J Biol Chem,1993,268:9049.
3 Harris PC,Mckanma JA,Akai Y,et al. Cyclooxygenase-2 is associated with the macula dense of rat kidney and increased with salt restriction. J Clin Invest,1994,94:2504.
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4 Cadshman J，Mcanulty G. Nonsteriodal antiinflammatory drugs in perisurgical pain management. Drugs,1995,49:51.
5 Beuter BK,Asfaha S,Buret A,et al. Exacebation of inflammation-associated colonic injury in rat through inhibition of cyclooxygenase-2. J Clin Invest,1996,98:2076.
6 Kang RY,Freire-Moar J,Sigal E,et al. Expression of cyclooxygenase-2 in human and an animal model of rheumatoid arthritis. Br J Rheuma,1996,35: 711.
, 百拇医药
7 Martin M,Neumann D,Hoff T,et al. Interleukin-1-induced cyclooxygenase 2 expression is suppressed by cyclosporin A in rat mesangial cells. Kidney Int,1994,45:150.
8 Chida M,Voelkel N. Effects of acute and chronic hypoxia on rat lung cyclooxygenase. Am J Physiol,1996,270(ptl):L872.
9 程庆砾，李文歌，师锁柱，等，小鼠输尿管梗阻后肾脏间质病变及抗细胞间粘附分子-1单克隆抗体的治疗作用.中华肾脏病杂志，1996，12：3.
(1998年3月5日收稿，1998年9月5日修回), 百拇医药
单位：解放军肾脏病重点实验室，解放军总医院肾科(北京 100853)
关键词：前列腺素内过氧化物合酶；输尿管梗阻；肾疾病
中国病理生理杂志991025 摘要 目的：观察环氧化酶-2(COX-2)在单侧输尿管梗阻小鼠梗阻肾脏内的表达情况，探讨COX-2在炎性肾脏疾病中病理生理作用。方法：利用RT-PCR检测了COX-2在小鼠单侧输尿管梗阻后4 h、24 h、72 h、 5 d和7 d的表达变化并采用PAS染色观察上述各时间点的肾组织病理改变。结果：单侧输尿管梗阻术后4 h肾皮质中的COX-2的表达开始增高，72 h达到高峰。术后第一天肾间质中可见少量炎细胞浸润，第3 d明显增多，第7 d达到高峰。结论：本研究提示COX-2的过度表达很可能是单侧输尿管梗阻后肾内炎细胞浸润和积聚的起始或促进因素之一。
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Expression of cyclooxygenase-2 in kidneys of mice with unilateral ureteral obstruction
LIN Hong-Li,CHEN Xiang-Mei,CHENG Qing-Li,ZHANG Ying;YE Yi-Zhou
Dept. of Nephrology,General Hospital of Chinese PLA,Beijing (100853)
Abstract AIM:Cyclooxygenase-2(COX-2) is an inducible cyclooxygenase which may play an important role in inflammatory diseases.METHODS：To examine the involvement of COX-2 in the inflammatory renal diseases in vivo,the expression of this gene was detected in kidneys of mice that receiving unilateral ureteral obstruction(UUO) at 4-hours,24-hours,72-hours,5-days,7-days by RT-PCR method. The morphological changes of the obstructed kidneys were observed at the same time point.RESULTS：The results demonstrated that the expression of COX-2 mRNA were beginning to increase at 4-hours,were up to peak at 72-hours after UUO operation . A few numbers of infiltrating inflammatory cells were found at 24-hours,a large humbers of infiltrating inflammatory cells were found 72-hours,and the peak of the numbers of those cells was at 7-days after UUO operation.CONCLUSION：COX-2 expression is upregulated in the obstracted kidneys of UUO mice. The overexpression of COX-2 may be an inducing or promoting factor in inflammatory cells infiltration in the kidney of UUO mice.
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MeSH Prostaglandin-endoperoxide synthase;Ureteral obstruction;Kidney disease
环氧化酶(cyclooxygenase,COX)是前列腺素的生物合成酶。COX-2是1992年新发现与炎症相关的COX的同工酶[1]，其在炎症病变中起着重要的作用。最近，国外学者报道了在体外培养的肾脏系膜细胞上COX-2可以被IL-1和TNF诱导表达增强[2]。单侧输尿管梗阻(unilateral ureteral obstruction,UUO)后的肾脏病变特征是肾间质的炎症性改变，我们利用这一模型观察了小鼠输尿管梗阻后肾组织内COX-2表达的变化及其肾脏炎细胞浸润的关系，旨在探讨COX-2在炎性肾脏疾病中的作用。
材料与方法
一、实验设计及动物分组：
, 百拇医药
NIH雌性小鼠：6～8周龄，体重20～22 g，由中国人民解放军总医院实验动物中心提供。35只雌性NIH小鼠在行单侧输尿管结扎术后随机分为5组，每组7只，分别于术后4 h、24 h、 3 d、 5 d、7 d处死动物，留取梗阻侧肾脏，将其分为两部分，一部分作光镜标本行病理形态分析，另一部分以液氮冷冻后提取RNA。另取7只雌性NIH小鼠同时行假手术作为对照，即除不进行单侧输尿管结扎外，余手术方式和实验方法同前。
二、材料：
TRIzol试剂和热启动PCR试剂盆：GIBCOBRL公司。逆转录试剂盒：Promega公司。COX-2引物：参照文献[7]设计，引物序列为：Sense:5'-ACT CAC TCAGTT TGT TGA GTC ATTC-3' antisense:5'-TTTGAT TAG TAC TGT AGG GTT AATG-3’，由美国Cybersyn公司合成。U-2000 A型紫外分光光度计：日本Hitachi公司。PCR仪：美国MJ Research Inc公司。
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三、小鼠UUO模型制备：
小鼠以10%水合氯醛按0.4 mL/kg体重的剂量腹腔注射麻醉后，于腹部左侧切口，暴露左侧输尿管后进行双重结扎，中间离断，逐层缝合腹膜、皮肤。假手术组除不结扎离断输尿管外均与手术组相同。
四、肾组织病理改变：
以4%多聚甲醛固定液固定肾组织，常规切片，PAS染色后，光镜下观察肾间质炎细胞的浸润程度。
五、RNA提取：
按TRIzol试剂盒提供的方法提取肾组织总RNA：取以上各组肾脏皮质约100 mg，加2 mL TRIzol匀浆，等体积异丙醇沉淀，70%乙醇洗涤2次，真空干燥10 min，加DEPC水溶解，取1 μL RNA溶液用紫外分光光度计测定光密度，并计算RNA浓度，取1 μg的RNA电泳观察RNA的质量。
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六、RT-PCR：
5 μg的肾组织总RNA，100℃变性后，加入逆转录试剂盒中的oligodT、 dNTPs、DTT、逆转录酶后，混匀于37℃孵育1 h。取1 μL逆转录产物，100℃变性3 min后，75℃热启动3 min，94℃30 s、60℃30 s、72℃60 s，30个循环于PCR仪上进行COX-2扩增。同时扩增β-actin作为内参照。PCR产物在1%琼脂糖凝胶中电泳(电压100 V，时间30 min)，于紫外线下观察，利用图像分析系统分别测定扩增条带的光密度值。比较各组COX-2与β-actin光密度比值。
七、统计学方法：
研究组间计量资料的统计学处理用t检验法。
结果
一、小鼠单侧输尿管梗阻后肾脏的病理改变：
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与假手术组小鼠相比，UUO术后4 h肾内未见明确的病理变化，1 d后见小血管周围有少量的炎细胞浸润，第3 d时炎细胞浸润增多，在血管及部分肾小管周围均可见较多的炎细胞浸润。第5 d及第7 d时炎细胞浸润明显增多并达到高峰。
二、小鼠单侧输尿管梗阻肾皮质COX-2表达的变化：
RT-PCR的结果显示：与假手术组小鼠比较，单侧输尿管梗阻后仅4 h小鼠梗阻侧肾皮质中即可见COX-2的表达轻度增强，于第24 h明显增强，第72 h达到高峰，以后小鼠梗阻侧肾皮质中COX-2的表达逐渐减弱，于第7 d时最低(图1A)。分析各组COX-2与β-actin光密度比值发现，UUO术后4 h、24 h、3 d、5 d各组小鼠的光密度比值明显高于假手术组(P<0.01)，梗阻第7 d小鼠肾皮质COX-2的表达与假手术组小鼠肾脏比较，其差异无明显(图1B)。
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Fig 1A： RT-PCR result of COX-2 expression in kidneys of UUO mice
1:Marker,2: sham-operated,3: 4 hours after UUO,4: 24 hours after UUO,5: 72 hours after UUO,6:5 days after UUO,7:7 days after UUO
图1A： 单侧输尿管梗阻肾组织COX-2表达RT-PCR结果
Fig 1B Density scanning of COX-2 expression in renal tissues of UUO mice
P<0.01 vs control,n=7
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图1B COX-2在单侧输尿管梗阻肾组织中的表达的图像密度扫描
讨论
COX-2是前列腺素合成起始步骤的关键酶，除大脑以外，体内其他器官中COX-2的生理表达都较低[3]，在内皮细胞、巨噬细胞和成纤维细胞中COX-2可以被炎症因子所诱导产生[4]。最近的研究表明COX-2在人的风湿性关节炎、大鼠的炎性关节炎的关节滑膜中及大鼠的炎性结肠炎时的表达明显增高[5，6]。COX-2与肾脏炎症及免疫反应的研究进展迅速，但多为体外细胞培养的研究[7]。
小鼠单侧输尿管梗阻可引起肾小管内压增高而导致小管上皮及肾间质血管的损伤，分泌和释放大量炎症因子，如IL-1，TNFα等，这些细胞因子在体外实验中已被证实可诱导肾脏细胞COX-2的表达上调，同时肾间质中浸润的单核巨噬细胞也是COX-2的重要来源。本文的研究结果表明：输尿管梗阻4 h后小鼠肾内COX-2的表达即开始增高，这与Chida等[8]报告的低氧3 h后肺组织的COX-2的表达即增高的结果是相似的。另外研究证实，炎症部位的前列腺素的合成增多是COX-2过度表达的结果，前列腺素是重要的炎症介质，增多的前列腺素本身又可激起更多的炎细胞积聚，加重局部的炎症反应，形成恶性循环。本研究及我们以前的研究结果[9]均发现小鼠肾脏在单侧输尿管梗阻术后第1 d出现少量的炎细胞浸润，第3 d增多，第5～7 d达到高峰。由于梗阻肾脏间质的炎性病变出现及达到峰值的时间略晚于COX-2的变化，因此我们认为在这一肾组织的病理改变中，COX-2的过度表达很可能是其起始或/和促进因素之一，抑制其表达对于治疗肾脏的炎性病变可能具有一定意义。
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参考文献
1 Feng L,Sun W,Xia Y,et al. Cloning two isoforms of rat cyclooxygenase and differential regulation of the expression. Arch Biochem Biophys,1993,307:361.
2 Jones DA,Carlton CP,McIntyre TM,et al. Molecular cloning of human prostaglandin endoperoxidase syntheses type and demonstration of expression in response to cytokines. J Biol Chem,1993,268:9049.
3 Harris PC,Mckanma JA,Akai Y,et al. Cyclooxygenase-2 is associated with the macula dense of rat kidney and increased with salt restriction. J Clin Invest,1994,94:2504.
, http://www.100md.com
4 Cadshman J，Mcanulty G. Nonsteriodal antiinflammatory drugs in perisurgical pain management. Drugs,1995,49:51.
5 Beuter BK,Asfaha S,Buret A,et al. Exacebation of inflammation-associated colonic injury in rat through inhibition of cyclooxygenase-2. J Clin Invest,1996,98:2076.
6 Kang RY,Freire-Moar J,Sigal E,et al. Expression of cyclooxygenase-2 in human and an animal model of rheumatoid arthritis. Br J Rheuma,1996,35: 711.
, 百拇医药
7 Martin M,Neumann D,Hoff T,et al. Interleukin-1-induced cyclooxygenase 2 expression is suppressed by cyclosporin A in rat mesangial cells. Kidney Int,1994,45:150.
8 Chida M,Voelkel N. Effects of acute and chronic hypoxia on rat lung cyclooxygenase. Am J Physiol,1996,270(ptl):L872.
9 程庆砾，李文歌，师锁柱，等，小鼠输尿管梗阻后肾脏间质病变及抗细胞间粘附分子-1单克隆抗体的治疗作用.中华肾脏病杂志，1996，12：3.
(1998年3月5日收稿，1998年9月5日修回), 百拇医药