3’-甲基-二甲基偶氮苯喂饲大鼠肝卵圆细胞体外转化过程中胞浆游离钙浓度及cAMP含量的变化
作者：徐勤 文剑明 薛玲 胡瑞德
单位：徐勤：广州中医药大学病理教研室(广州 510407)；文剑明 薛玲 胡瑞德：中山医科大学病理教研室
关键词：钙；肝；腺苷环一磷酸
3 摘要 目的和方法：为了解SD大鼠肝卵圆细胞体外转化过程中胞浆游离钙及cAMP含量的变化。用荧光探针标记法检测胞浆游离钙浓度。以放射免疫法检测cAMP含量。结果：从喂饲3’-甲基-N，N-二甲基-4-氨基偶氮苯(3’-Me-DAB)大鼠分离到的卵圆细胞，体外生长至30代时发生转化，生长速度加快。80%的转化卵圆细胞为异倍体，并能在软琼脂中呈克隆性生长。尽管细胞在转化过程中未见表皮生长因子受体含量改变，但细胞游离钙升高和cAMP水平明显降低，反映细胞传导系统发生了改变。结论：这种细胞第二信使物质的改变使细胞保持恶性转化表型并能不断生长。
The change of cytosolic free calcium and cAMP during in
, http://www.100md.com
vitro transforming process ofliver oval cells isolated from 3'-methyl-diaminoazobenzene fed rats
XU Qin,WEN Jian-Ming,XUE Ling,HU Rei-De
Department of Pathology,Guangzhou University of TCM,Guangzhou (510407)
Abstract AIM and METHOD:To evaluate the changes of cAMP and cytosolic free calcium during in vitro transforming process of liver oval cells isolated from 3'-Me-DAB feedes SD rat.The cytosolic free calcium was examined by fluorescence labeling method.cAMP was examined by radioimmunochemical method.RESULTS：Transformation of oval cell was found at passage 30.The transformed cells grew rapidly,80% of them became aneuploid,and could grow in soft agar as clone.Although there was no change in EGF receptor level,a significant increase of cytosolic free calcium level and decrease of cAMP level were found in transformed cells.CONCLUSION：The change of cytosolic free calcium and cAMP might maintained the maligant phenotype of the cells and made them proliferate continuously.
, 百拇医药
MeSH Calcium; Liver; Adenosine cyclic monophosphate
正常细胞的恶性转化是一个涉及多因素的复杂的病理过程。其中胞浆游离钙浓度的变化往往影响了细胞内多种酶的活力，触发了许多重要的细胞活动[1]，而转化细胞对外源性钙的需求下降[2，3]，细胞cAMP水平也较正常细胞减少[4]。本实验观察3’-Me-DAB接触大鼠肝卵圆细胞在体外转化过程中胞浆游离钙和cAMP水平的变化，并探讨其改变的意义。
材料与方法
(一)SD大鼠肝卵圆细胞的诱导、分离和培养：用0.06% 3’-Me-DAB喂饲雄性SD大鼠(体重约100 g)，四周以后以3%苯巴比妥钠静脉麻醉大鼠，以0.1%胶原酶(Sigma)原位灌注肝脏，细胞分散后用120目尼龙网过滤除去细胞团块，将单细胞悬液置90、 70、 50%的Percoll (Pharmacia)进行梯度密度离心，将分离的卵圆细胞接种在塑料培养瓶(Corning)中，加入20%小牛血清，20 ng/mL表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)的DMEM/F12培养基，在含5%二氧化碳的37℃孵箱培养和传代。参照《组织培养和分子细胞技术》(鄂征主编)，分别对10、 15、 20、 25、 30、 35代细胞进行软琼脂培养和染色体计数。
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(二)细胞EGF受体(EGF-R)测定：用0.25%胰酶消化收集细胞，Hanks洗2次，用70%酒精固定。PBS洗2次，120目尼龙网过滤，调整细胞数为5×106/mL。取100 μL，加入抗EGF-R单抗1 μL，室温30 min，加FITC标记的二抗5 μL，30 min，加PBS至1 mL。在流式细胞仪中测定，激发波长为400 nm，发射波长525 nm。
(三)胞浆游离钙测定：用0.25%胰酶消化收集细胞，以含0.5%小牛血清的DMEM/F12培养液悬浮细胞，调整细胞数至106/mL，加Fura-2/AM(Sigma)至终浓度5 μmol/L，置37℃、 5%CO2水浴40 min，Hanks液洗×2次。再次悬浮细胞并调整细胞数至1.0×106/mL。光谱特征检验合格后即在Shimaduzu RF5000型荧光分光光度计上进行检测。激发光波长λex 为340 nm和380 nm，发射光波长λem为500 nm。激发光栅和发射光栅均为5 nm。
, 百拇医药
(四)细胞cAMP水平测定：参照上海中医学院生产的cAMP检测试剂盒说明，以放射免疫法进行测定。
(五)数据以均数±标准差(
±s)表示，统计用t检验。胞浆游离钙浓度变化和cAMP含量变化之间的关系以直线相关回归进行检验。
结果
(一)卵圆细胞体外培养及转化：培养的卵圆细胞较小，多角形，胞浆丰富，有颗粒。核卵圆型，呈上皮细胞形态。第10、 15、 20、 25、 35代细胞倍增时间分别为40.9、 33.4、 18.9、 19.0、 17.9 h。相应代数细胞染色体计数，超二倍体细胞占0、 0、 24、 26和80%。第35代细胞在软琼脂中生长4周后，5个平皿(105细胞/平皿)生长的克隆数为2、2、5、2、7，平均为3.6克隆/105细胞。可以认为在35代左右细胞出现恶性转化。
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(二)肝卵圆细胞体外转化过程中EGF-R表达量的变化：
从表1可以看出，不同代数而卵圆细胞EGF-R表达量差异不明显，P>0.05。
表1 不同代数的卵圆细胞EGF-R表达、胞浆游离钙及cAMP含量变化
Tab 1 The changes of EGF-R expression,cytosolic free calcium and
cAMP in different passages of oval cell (
±s，n=4)
Passage
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(n)
EGF-R fluorescence
(intensity/cell)
[Ca2+]i(nmol/L)
cAMP
(pmol/106 cells)
15
0.135±0.025
22.347±5.324
52.0±1.8
20
, 百拇医药
0.180±0.045
22.333±8.427
42.0±1.5
25
0.227±0.090
28.454±7.365
40.0±1.6
30
0.193±0.0352
18.641±20.25
39.0±0.4
35
, http://www.100md.com
0.241±0.0282
28.381±18.76
56.0±0.2
(三)肝卵圆细胞体外转化过程中胞浆游离钙浓度的变化：卵圆细胞胞浆游离钙浓度随细胞的代数增加而增高，但在25代前差异不大，在30和35代则大幅度增高，此时恰好处于细胞转化时期。(P<0.05)。
(四)SD大鼠体外转化过程中cAMP含量的变化：表1显示卵圆细胞第15、 20、 30和35代细胞cAMP含量。在第25代前cAMP含量差别不大，但在30和35代则明显降低，恰好处于细胞转化时期(P<0.05)。
(五)卵圆细胞体外转化过程中胞浆游离钙浓度和cAMP含量变化之间的关系：以胞浆游离钙浓度为X轴，cAMP含量为Y轴，得回归方程Y＝49.37-0.19X,回归系数b的假设检验P<0.005，显示cAMP含量和胞浆游离钙浓度呈负相关关系。
, 百拇医药
讨论
卵圆细胞一直以来被认为是肝脏的干细胞。卵圆细胞的转化最后可演变成肝细胞癌或胆管上皮癌[5]。
多种肿瘤存在EGF-R的过量表达。用EGF作用于胃癌细胞，在引起癌基因表达的同时，EGF-R的表达也升高[6]。但我们在卵圆细胞转化的过程中，未见细胞EGF-R含量发生变化。可能是在长期相同剂量EGF作用下，EGF-R与EGF结合后内在化速率达到平衡所致。
胞浆游离钙的升高可激活多种依赖钙和钙调素的酶，使细胞处于一种活跃的代谢状态。Jamse等发现转化细胞钙调素水平升高[7]，本试验却观察到卵圆细胞在发生转化期间，胞浆游离钙明显增高。提示转化的细胞和其它肿瘤细胞相似，其生长代谢活跃。卵圆细胞在30代左右细胞倍增时间大大缩短可以证明这一点(仅需要17.9 h)。
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cAMP作为细胞内重要的第二信使物质并通过cAMP依赖的蛋白激酶A而发生作用，cAMP含量的变化可以影响到细胞的增殖、分化以及肿瘤性转化[8]。转化的纤维母细胞cAMP水平较正常细胞低，但当细胞再次恢复正常时，cAMP水平也随之恢复正常[4]。外源性cAMP可以引起肿瘤细胞形态向正常细胞逆转，使细胞呈分化状态和癌基因表达抑制[9]。本实验观察到卵圆细胞在转化时期cAMP水平明显降低，与上述结果相符。
显然，在致癌剂的作用下，大鼠肝脏受损，肝细胞大量死亡，卵圆细胞增生以修复受损的肝组织。但卵圆细胞同样受到致癌剂的作用，在体外培养中发生转化。转化的细胞不但出现生长速度加快、染色体数目改变、获得在软琼脂中生长的能力，而且在细胞信息传导方面也发生改变，主要表现为胞浆游离钙升高，cAMP水平降低，这种细胞内第二信使物质的改变与细胞生长速度加快相一致，并使细胞保持低分化转化表型。
参考文献
, 百拇医药
1 Nicotera P,Bellomo G,Orrenius,et al.Calcium-mediated mechanisms in chameically induce cell death.Annu Rev Pharmacol Toxical,1992,32:449.
2 Balk SD,Whttifiled JE,Youdale T,et al.Roles of calcium,serum ,plasma,and folicacid in the control of proliferation of normal and Rous sarcoma virus-infected chicken fibroblasts.Proc Natl Acad Sci USA,1993,70:675.
3 Whitfied JF,Boynton AL,Healy GM,et al.Oncogenic transformation and the reduction of insulin secrection and proliferative calcium dependence during repeated passage of pancreatic islet in vitro.Cancer Res,1990,50:3811.
, 百拇医药
4 Sheppard JR.Difference in the cyclic adenosine 3',5'-monophosphate levels in normal and transformed cell.Nature New Biol,1972,236:14.
5 Sell S.Is there a liver stem cell? Cancer Res,1990,50:3811.
6 Yoshida K,Tsujino T,Yasui W,et al.Induction of growth factor receptor and metalloproteinase gene by epidermal growth and/or transforming growth factor alpha in human gastric carcinoma cell line MKN-28.Jpn J Cancer Res,1990,81:793.
, 百拇医药
7 张 云.细胞生物学进展.高等教育出版社，1991.160.
8 Cho-Chung YS,Clair T,Tortora G.Role of site-selective cAMP analogs in the control and reversal of malignancy.Pharmacol Ther,1991,50:1.
9 Tortora G,Ciardiello F,Ally S,et al.Site-selective 8 chloroadenosine 3',5'-cyclic monophosphate inhibits transformation in Ki-ras-transformed rat fibroblast.FEBS Lett,1989,242:363.
(1998年5月6日收稿，1998年11月6日修回), 百拇医药
单位：徐勤：广州中医药大学病理教研室(广州 510407)；文剑明 薛玲 胡瑞德：中山医科大学病理教研室
关键词：钙；肝；腺苷环一磷酸
3 摘要 目的和方法：为了解SD大鼠肝卵圆细胞体外转化过程中胞浆游离钙及cAMP含量的变化。用荧光探针标记法检测胞浆游离钙浓度。以放射免疫法检测cAMP含量。结果：从喂饲3’-甲基-N，N-二甲基-4-氨基偶氮苯(3’-Me-DAB)大鼠分离到的卵圆细胞，体外生长至30代时发生转化，生长速度加快。80%的转化卵圆细胞为异倍体，并能在软琼脂中呈克隆性生长。尽管细胞在转化过程中未见表皮生长因子受体含量改变，但细胞游离钙升高和cAMP水平明显降低，反映细胞传导系统发生了改变。结论：这种细胞第二信使物质的改变使细胞保持恶性转化表型并能不断生长。
The change of cytosolic free calcium and cAMP during in
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vitro transforming process ofliver oval cells isolated from 3'-methyl-diaminoazobenzene fed rats
XU Qin,WEN Jian-Ming,XUE Ling,HU Rei-De
Department of Pathology,Guangzhou University of TCM,Guangzhou (510407)
Abstract AIM and METHOD:To evaluate the changes of cAMP and cytosolic free calcium during in vitro transforming process of liver oval cells isolated from 3'-Me-DAB feedes SD rat.The cytosolic free calcium was examined by fluorescence labeling method.cAMP was examined by radioimmunochemical method.RESULTS：Transformation of oval cell was found at passage 30.The transformed cells grew rapidly,80% of them became aneuploid,and could grow in soft agar as clone.Although there was no change in EGF receptor level,a significant increase of cytosolic free calcium level and decrease of cAMP level were found in transformed cells.CONCLUSION：The change of cytosolic free calcium and cAMP might maintained the maligant phenotype of the cells and made them proliferate continuously.
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MeSH Calcium; Liver; Adenosine cyclic monophosphate
正常细胞的恶性转化是一个涉及多因素的复杂的病理过程。其中胞浆游离钙浓度的变化往往影响了细胞内多种酶的活力，触发了许多重要的细胞活动[1]，而转化细胞对外源性钙的需求下降[2，3]，细胞cAMP水平也较正常细胞减少[4]。本实验观察3’-Me-DAB接触大鼠肝卵圆细胞在体外转化过程中胞浆游离钙和cAMP水平的变化，并探讨其改变的意义。
材料与方法
(一)SD大鼠肝卵圆细胞的诱导、分离和培养：用0.06% 3’-Me-DAB喂饲雄性SD大鼠(体重约100 g)，四周以后以3%苯巴比妥钠静脉麻醉大鼠，以0.1%胶原酶(Sigma)原位灌注肝脏，细胞分散后用120目尼龙网过滤除去细胞团块，将单细胞悬液置90、 70、 50%的Percoll (Pharmacia)进行梯度密度离心，将分离的卵圆细胞接种在塑料培养瓶(Corning)中，加入20%小牛血清，20 ng/mL表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)的DMEM/F12培养基，在含5%二氧化碳的37℃孵箱培养和传代。参照《组织培养和分子细胞技术》(鄂征主编)，分别对10、 15、 20、 25、 30、 35代细胞进行软琼脂培养和染色体计数。
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(二)细胞EGF受体(EGF-R)测定：用0.25%胰酶消化收集细胞，Hanks洗2次，用70%酒精固定。PBS洗2次，120目尼龙网过滤，调整细胞数为5×106/mL。取100 μL，加入抗EGF-R单抗1 μL，室温30 min，加FITC标记的二抗5 μL，30 min，加PBS至1 mL。在流式细胞仪中测定，激发波长为400 nm，发射波长525 nm。
(三)胞浆游离钙测定：用0.25%胰酶消化收集细胞，以含0.5%小牛血清的DMEM/F12培养液悬浮细胞，调整细胞数至106/mL，加Fura-2/AM(Sigma)至终浓度5 μmol/L，置37℃、 5%CO2水浴40 min，Hanks液洗×2次。再次悬浮细胞并调整细胞数至1.0×106/mL。光谱特征检验合格后即在Shimaduzu RF5000型荧光分光光度计上进行检测。激发光波长λex 为340 nm和380 nm，发射光波长λem为500 nm。激发光栅和发射光栅均为5 nm。
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(四)细胞cAMP水平测定：参照上海中医学院生产的cAMP检测试剂盒说明，以放射免疫法进行测定。
(五)数据以均数±标准差(
±s)表示，统计用t检验。胞浆游离钙浓度变化和cAMP含量变化之间的关系以直线相关回归进行检验。结果
(一)卵圆细胞体外培养及转化：培养的卵圆细胞较小，多角形，胞浆丰富，有颗粒。核卵圆型，呈上皮细胞形态。第10、 15、 20、 25、 35代细胞倍增时间分别为40.9、 33.4、 18.9、 19.0、 17.9 h。相应代数细胞染色体计数，超二倍体细胞占0、 0、 24、 26和80%。第35代细胞在软琼脂中生长4周后，5个平皿(105细胞/平皿)生长的克隆数为2、2、5、2、7，平均为3.6克隆/105细胞。可以认为在35代左右细胞出现恶性转化。
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(二)肝卵圆细胞体外转化过程中EGF-R表达量的变化：
从表1可以看出，不同代数而卵圆细胞EGF-R表达量差异不明显，P>0.05。
表1 不同代数的卵圆细胞EGF-R表达、胞浆游离钙及cAMP含量变化
Tab 1 The changes of EGF-R expression,cytosolic free calcium and
cAMP in different passages of oval cell (
±s，n=4)Passage
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(n)
EGF-R fluorescence
(intensity/cell)
[Ca2+]i(nmol/L)
cAMP
(pmol/106 cells)
15
0.135±0.025
22.347±5.324
52.0±1.8
20
, 百拇医药
0.180±0.045
22.333±8.427
42.0±1.5
25
0.227±0.090
28.454±7.365
40.0±1.6
30
0.193±0.0352
18.641±20.25
39.0±0.4
35
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0.241±0.0282
28.381±18.76
56.0±0.2
(三)肝卵圆细胞体外转化过程中胞浆游离钙浓度的变化：卵圆细胞胞浆游离钙浓度随细胞的代数增加而增高，但在25代前差异不大，在30和35代则大幅度增高，此时恰好处于细胞转化时期。(P<0.05)。
(四)SD大鼠体外转化过程中cAMP含量的变化：表1显示卵圆细胞第15、 20、 30和35代细胞cAMP含量。在第25代前cAMP含量差别不大，但在30和35代则明显降低，恰好处于细胞转化时期(P<0.05)。
(五)卵圆细胞体外转化过程中胞浆游离钙浓度和cAMP含量变化之间的关系：以胞浆游离钙浓度为X轴，cAMP含量为Y轴，得回归方程Y＝49.37-0.19X,回归系数b的假设检验P<0.005，显示cAMP含量和胞浆游离钙浓度呈负相关关系。
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讨论
卵圆细胞一直以来被认为是肝脏的干细胞。卵圆细胞的转化最后可演变成肝细胞癌或胆管上皮癌[5]。
多种肿瘤存在EGF-R的过量表达。用EGF作用于胃癌细胞，在引起癌基因表达的同时，EGF-R的表达也升高[6]。但我们在卵圆细胞转化的过程中，未见细胞EGF-R含量发生变化。可能是在长期相同剂量EGF作用下，EGF-R与EGF结合后内在化速率达到平衡所致。
胞浆游离钙的升高可激活多种依赖钙和钙调素的酶，使细胞处于一种活跃的代谢状态。Jamse等发现转化细胞钙调素水平升高[7]，本试验却观察到卵圆细胞在发生转化期间，胞浆游离钙明显增高。提示转化的细胞和其它肿瘤细胞相似，其生长代谢活跃。卵圆细胞在30代左右细胞倍增时间大大缩短可以证明这一点(仅需要17.9 h)。
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cAMP作为细胞内重要的第二信使物质并通过cAMP依赖的蛋白激酶A而发生作用，cAMP含量的变化可以影响到细胞的增殖、分化以及肿瘤性转化[8]。转化的纤维母细胞cAMP水平较正常细胞低，但当细胞再次恢复正常时，cAMP水平也随之恢复正常[4]。外源性cAMP可以引起肿瘤细胞形态向正常细胞逆转，使细胞呈分化状态和癌基因表达抑制[9]。本实验观察到卵圆细胞在转化时期cAMP水平明显降低，与上述结果相符。
显然，在致癌剂的作用下，大鼠肝脏受损，肝细胞大量死亡，卵圆细胞增生以修复受损的肝组织。但卵圆细胞同样受到致癌剂的作用，在体外培养中发生转化。转化的细胞不但出现生长速度加快、染色体数目改变、获得在软琼脂中生长的能力，而且在细胞信息传导方面也发生改变，主要表现为胞浆游离钙升高，cAMP水平降低，这种细胞内第二信使物质的改变与细胞生长速度加快相一致，并使细胞保持低分化转化表型。
参考文献
, 百拇医药
1 Nicotera P,Bellomo G,Orrenius,et al.Calcium-mediated mechanisms in chameically induce cell death.Annu Rev Pharmacol Toxical,1992,32:449.
2 Balk SD,Whttifiled JE,Youdale T,et al.Roles of calcium,serum ,plasma,and folicacid in the control of proliferation of normal and Rous sarcoma virus-infected chicken fibroblasts.Proc Natl Acad Sci USA,1993,70:675.
3 Whitfied JF,Boynton AL,Healy GM,et al.Oncogenic transformation and the reduction of insulin secrection and proliferative calcium dependence during repeated passage of pancreatic islet in vitro.Cancer Res,1990,50:3811.
, 百拇医药
4 Sheppard JR.Difference in the cyclic adenosine 3',5'-monophosphate levels in normal and transformed cell.Nature New Biol,1972,236:14.
5 Sell S.Is there a liver stem cell? Cancer Res,1990,50:3811.
6 Yoshida K,Tsujino T,Yasui W,et al.Induction of growth factor receptor and metalloproteinase gene by epidermal growth and/or transforming growth factor alpha in human gastric carcinoma cell line MKN-28.Jpn J Cancer Res,1990,81:793.
, 百拇医药
7 张 云.细胞生物学进展.高等教育出版社，1991.160.
8 Cho-Chung YS,Clair T,Tortora G.Role of site-selective cAMP analogs in the control and reversal of malignancy.Pharmacol Ther,1991,50:1.
9 Tortora G,Ciardiello F,Ally S,et al.Site-selective 8 chloroadenosine 3',5'-cyclic monophosphate inhibits transformation in Ki-ras-transformed rat fibroblast.FEBS Lett,1989,242:363.
(1998年5月6日收稿，1998年11月6日修回), 百拇医药