热休克蛋白70与家兔颈总动脉球囊损伤后增殖细胞核抗原表达的关系
作者：郭远林 王瑞英 任江华 曹茂银 宋长杰
单位：湖北医科大学附属第二医院心内科(武汉 430071)
关键词：热休克蛋白质类；抗原；动脉
中国病理生理杂志991006 摘要 目的：研究热休克蛋白70(HSP70)与经皮冠状动脉腔内成形术后再狭窄形成中细胞增生的关系。方法：复制家兔颈总动脉球囊损伤模型，用免疫组化方法检测术后3、9、14、28 d损伤动脉壁中HSP70和增殖细胞核抗原(PCNA)表达水平；用计算机图像分析系统定量，并对两者进行相关分析。结果：损伤动脉壁HSP70及PCNA检测呈阳性，正常动脉呈阴性。9 d时两者表达指数均较各自3 d时显著升高，14 d均达峰值，28 d显著降至3 d时水平。时相相关分析两者显著正相关。结论：细胞增生活性升高伴随HSP70的产生增多；动脉损伤时机体可能通过HSP70合成增多而促进细胞再生，一定程度上促成再狭窄。
, 百拇医药
The relationship between expression of HSP70 and
PCNA in ballooned rabbit carotid
GUO Yuan-Lin, WANG Rui-Ying, REN Jiang-Hua，CAO Mao-Yin, SONG Chang-Jie
Department of Cardiology, The Second Affiliated Hospital, Hubei Medical University, Wuhan (430071)
Abstract AIM:To investigate the expression of heat shock protein 70 (HSP70) involving in the development of restenosis after percutaneous transluminal coronary angioplasty (PTCA).METHOD：The rabbit carotid balloon injury model was used.Six animals were killed at 3 days, six at 9 days, six at 14 days and six at 28 days after injury respectively, and the ballooned carotid segments were removed.Then, immunohistochemistry combined with computer image analysis was used to determine HSP70-expression index (HEI) and proliferating cell nuclear antigen (PCNA)-expression index (PEI) in injured arteries.RESULTS：Both stainnings were negative in normal vessels while positive in injured vessels.HEI and PEI significantly increased at day 9 compared with day 3 and reached their maxiums at day 14, then declined at day 28 significantly.The time course of cell proliferation was significantly positive correlated with that of the HSP70-expression.CONCLUSION：Cell proliferation is accompanied by production of HSP70.It seems that body may induce cell proliferation by increasing the synthesis of HSP70, thus to accelerate the repairment of injured artery.
, http://www.100md.com
MeSH Heat-shock proteins; Antigens; Arteries
经皮冠状动脉腔内成形术(percutaneous transluminal coronary angioplasty, PTCA)后再狭窄率高、顽固、难治，典型病理学特征是中膜平滑肌细胞向内膜迁移、增生。研究表明这一增生过程与多种即刻早期基因、癌基因的异常表达以及多种细胞因子、生长因子有关[1]。热休克蛋白70(heat shock protein 70, HSP70)与细胞增殖的关系已逐渐引起人们重视。细胞在应激状态下，其分化状态会发生改变，而HSP70在调控细胞的分化走向上具有重要作用。细胞学实验证实，HSP70的产生与细胞增殖存在一定关系，特别在DNA合成期更为明显，当细胞从分裂的G0期进入G1期，伴随着HSP70的产生[2]。而增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)是DNA聚合酶S的辅因子，在细胞周期中对细胞分裂和DNA合成起关键作用[3]。本实验旨在通过PCNA来反映细胞增生，探讨HSP70在动脉损伤后内膜增厚中的作用，为防治再狭窄提供实验依据。
, http://www.100md.com
材料与方法
一、模型复制及实验分组：
选用普食喂养的健康大耳白兔24只，体重2.10～2.75 kg，雌雄不拘，4～6月龄。用戊巴比妥钠(30 mg/kg.iv)麻醉，采用Clowes法[4]行右颈总动脉内皮剥脱术。术后连续3 d肌注青霉素40 万U/d，预防感染。造型兔随机分为术后3、9、14、28 d组(n=6)，左颈总动脉相应部位为正常对照。
二、取材及处理：
各组分别于预定天数静脉麻醉下取右颈总动脉损伤段及左颈总相应部位血管段。每段血管均常规透射电镜制样及光镜制样，蜡块作厚4 μm的连续血管横切片，至少备4张玻片，分别作HE、弹力纤维染色及HSP70、PCNA免疫组化染色(玻片预先涂多聚赖氨酸防脱片)。
三、指标检测：
, 百拇医药
1.免疫组化染色：切片常规脱蜡入水，3% H2O2灭活内源性过氧化物酶；经抗原修复后加二抗同种动物正常血清封闭，然后依次加入一抗(HSP70或PCNA单抗，均为Sigma.Co产品，反应1～2 h)、生物素化二抗及链霉亲和素-生物素-过氧化物酶复合物；DAB显色；苏木素复染。PCNA染色胞核棕色者为表达阳性(增殖期)细胞；HSP70染色胞核或/和胞浆棕色者为表达阳性细胞。均设置替代对照染色(以磷酸盐缓冲液代替一抗)。
2.计算机图像分析(德国Contron.Co.IBAS仪)：于20×物镜下测定各阳性片着色的平均光密度(MOD)和阳性表达面积率(area%，为阳性表达的面积占视野中所有核总面积的百分率)。前者反映阳性表达强度，后者反映阳性表达率，参照罗莉等[5]方法(略作修改)计算表达指数(expression index, EI)：
EI(%)＝MOD×area%×100
, 百拇医药
四、统计分析：
数据均以
±s表示，多组比较采用单因素方差分析，两两比较采用Newman-Keuls法q检验，双侧α＝0.05；采用Pearson's乘积矩相关分析。
结果
一、形态学表现：
HE及弹力纤维染色均示明显的内膜剥脱后增生反应，14 d组最为明显；HE染色显示增厚的内膜中细胞丰富，细胞形态较长梭形平滑肌细胞胖大，呈纺锤形，似成纤维细胞样(图1)，透射电镜(日产H-600型)下于新生内膜层及靠近内弹力膜部位的中膜可见大量“合成型”平滑肌细胞，其胞浆内肌丝成分减少或消失，而粗面内质网、线粒体和游离核糖体等丰富。
, http://www.100md.com
Fig 1 Histologic section with HE stainning of an artery 14 days after injury.(Note the red elastic fibers and the smooth muscle cells with thin blue nuclei.There are lots of fibroblast-like cells in the neointimal within internal elastic laminae.×20)
图1 损伤后14 d HE染色组织片
免疫组化染色示PCNA表达细胞分布于新生内膜及中膜的内膜侧(图2)；HSP70表达细胞分布于新生内膜全层而中膜或外膜少见或无分布(图3)。
Fig 2 Histologic section with positive PCNA stainning of an artery 14 days after injury.(Note brown positive nuclei and the positive cells are mostly in the neointima within internal elastic laminae,there are a few in the media near intima.×40)
, 百拇医药
图2 损伤后14 d PCNA阳性组织片
Fig 3 Histologic section with positive HSP70 stainning of an artery 14 days after injury.(Note lots of HSP70-expressed cells in the neointima, some HSP70 in the nuclei, some in plasma.×40)
图3 损伤后14 d HSP70阳性组织片
二、图像定量分析：
PCNA表达指数(PEI)于术后9 d显著高于3 d，14 d达峰值，28 d降至3 d时水平；HSP70表达指数(HEI)变化情况同PEI(表1)。
, 百拇医药
表1 内皮剥脱后HSP70及PCNA的表达水平
Tab 1 The expression level of PCNA and HSP70
after injury (
±s，n=6) Group
EI(%)
HEI
PEI
3 d
4.51±0.74
1.68±0.50
9 d
, 百拇医药
6.71±0.88
3.64±0.43**
14 d
11.36±0.92△△
9.71±0.86△△
28 d
3.28±0.86△△
0.98±0.19△△
**P<0.01, vs 3 d; △△P<0.01, vs any other group
EI＝expression index; HEI＝HSP70 expression index;PEI＝PCNA expression index
, 百拇医药
三、相关分析：
PEI与HEI在时相上的相关系数r=0.9577，P<0.05，呈显著正相关。
讨论
HSP是氨基酸序列具有高度同源性的一组应激蛋白，HSP70是其中最丰富的一种，具有转运细胞内新合成的蛋白质及清除变性蛋白质的功能[6]，机械刺激是诱导HSP70基因表达的主要原因之一。PCNA为细胞进入细胞周期和分裂增生及DNA复制所必需，反义PCNA寡核苷酸能有效抑制细胞增生和PCNA表达；免疫细胞化学证实，静止细胞PCNA染色阴性，而血清刺激后呈阳性，位于S期细胞有大量PCNA表达，而未在S期者仅少量或无表达[3，7]。可见，PCNA为增殖期细胞特异表达的核蛋白，是细胞DNA合成不可缺少的因子，其表达情况是评价增生活性的重要生物学指标。
本实验发现HSP70有的定位于核内，有的分布于胞浆，这可能是因为HSP70具有胞内移位现象[8]：损伤首先主要发生于胞核，当细胞脱离应激状态时，HSP70又可转移至胞浆。结果显示，在阳性细胞的分布上，表达HSP70的细胞与PCNA阳性细胞及电镜所观察的合成型细胞的分布一致，这表明与损伤有关的增殖同时伴有HSP70的产生。
, 百拇医药
本实验将反映阳性细胞量的阳性表达面积率和反映阳性表达强度的阳性颗粒平均光密度相结合计算表达指数，优化了过去仅采用阳性细胞计数定量免疫组化阳性反应的方法。结果表明，HSP70表达增多的同时细胞增生程度加重，提示HSP70可能参与细胞周期的调节，诱导细胞进入DNA合成期而发生增殖。HSP70防止细胞损伤、加速损伤后修复而使细胞存活增多的原因可能正在此。这也进一步支持了万蜡香等[9]对细胞增殖与c-myc、HSP70基因表达的研究结果。HSP70表达增多的原因可能为内皮剥脱过程中自由基产生增多，使动脉壁中有关细胞的蛋白质变性，激活了热休克因子，从而启动了HSP70基因转录；而HSP70基因转录又促进了PCNA表达，故而促进了细胞增殖。
可见，HSP70可促进PTCA后动脉壁的细胞再生以加快损伤修复，但可能由于矫枉过正而致修复过度，反而促成再狭窄。HSP70基因为一后期基因，其转录和表达可能作为多种因素促进细胞增生的共同终末通路。故适当控制HSP70的量可能会更有效地控制细胞增殖，这对于防治再狭窄意义重大。
, 百拇医药
参考文献
1 Seymour Glagov.Intimal hyperplasia, Vascular modeling, and the restenosis problem.Circulation, 1994, 89:2888.
2 Sorger PK.Heat shock factor and the heat shock response.Cell, 1991, 65:363.
3 Prelich G, Stillman B.Coordinated leading and lagging strand synthesis during SV40 DNA replication in vitro requires PCNA.Cell, 1988, 53: 117.
4 Clowes AW, Reidy MA, Clowes MM.Kinetics of cellular proliferation after arterial injury.I.Smooth muscle cell growth in the absence of endothelium.Lab Invest, 1983, 49:327.
, http://www.100md.com
5 罗 莉，马述仕，王美娥，等.星形细胞瘤中P53蛋白和PCNA免疫组化的定量研究.中国体现学与图像分析，1996，1：91.
6 孙经建.热休克蛋白70的分布、调节及功能.国外医学生理、病理与临床分册，1997，17：7.
7 Speir E, Epstein SE.Inhibitin of smooth muscle cell proliferation by an antisense oligodeoxynucleotide targeting the mRNA encoding PCNA.Circulation, 1992, 86:538.
8 Weimin Zhu.Oxidized-LDL induce the expression of heat shock protein 70 in human endothelial cells.Biochem Biophysi Res Commun, 1994, 200:389.
9 万蜡香，杨和平，杨永宗，等.动脉粥样硬化形成中平滑肌细胞增殖与c-myc、HSP70基因表达的研究.中国动脉硬化杂志，1995，3：95.
(1998年5月18日收稿，1999年3月1日修回), http://www.100md.com
单位：湖北医科大学附属第二医院心内科(武汉 430071)
关键词：热休克蛋白质类；抗原；动脉
中国病理生理杂志991006 摘要 目的：研究热休克蛋白70(HSP70)与经皮冠状动脉腔内成形术后再狭窄形成中细胞增生的关系。方法：复制家兔颈总动脉球囊损伤模型，用免疫组化方法检测术后3、9、14、28 d损伤动脉壁中HSP70和增殖细胞核抗原(PCNA)表达水平；用计算机图像分析系统定量，并对两者进行相关分析。结果：损伤动脉壁HSP70及PCNA检测呈阳性，正常动脉呈阴性。9 d时两者表达指数均较各自3 d时显著升高，14 d均达峰值，28 d显著降至3 d时水平。时相相关分析两者显著正相关。结论：细胞增生活性升高伴随HSP70的产生增多；动脉损伤时机体可能通过HSP70合成增多而促进细胞再生，一定程度上促成再狭窄。
, 百拇医药
The relationship between expression of HSP70 and
PCNA in ballooned rabbit carotid
GUO Yuan-Lin, WANG Rui-Ying, REN Jiang-Hua，CAO Mao-Yin, SONG Chang-Jie
Department of Cardiology, The Second Affiliated Hospital, Hubei Medical University, Wuhan (430071)
Abstract AIM:To investigate the expression of heat shock protein 70 (HSP70) involving in the development of restenosis after percutaneous transluminal coronary angioplasty (PTCA).METHOD：The rabbit carotid balloon injury model was used.Six animals were killed at 3 days, six at 9 days, six at 14 days and six at 28 days after injury respectively, and the ballooned carotid segments were removed.Then, immunohistochemistry combined with computer image analysis was used to determine HSP70-expression index (HEI) and proliferating cell nuclear antigen (PCNA)-expression index (PEI) in injured arteries.RESULTS：Both stainnings were negative in normal vessels while positive in injured vessels.HEI and PEI significantly increased at day 9 compared with day 3 and reached their maxiums at day 14, then declined at day 28 significantly.The time course of cell proliferation was significantly positive correlated with that of the HSP70-expression.CONCLUSION：Cell proliferation is accompanied by production of HSP70.It seems that body may induce cell proliferation by increasing the synthesis of HSP70, thus to accelerate the repairment of injured artery.
, http://www.100md.com
MeSH Heat-shock proteins; Antigens; Arteries
经皮冠状动脉腔内成形术(percutaneous transluminal coronary angioplasty, PTCA)后再狭窄率高、顽固、难治，典型病理学特征是中膜平滑肌细胞向内膜迁移、增生。研究表明这一增生过程与多种即刻早期基因、癌基因的异常表达以及多种细胞因子、生长因子有关[1]。热休克蛋白70(heat shock protein 70, HSP70)与细胞增殖的关系已逐渐引起人们重视。细胞在应激状态下，其分化状态会发生改变，而HSP70在调控细胞的分化走向上具有重要作用。细胞学实验证实，HSP70的产生与细胞增殖存在一定关系，特别在DNA合成期更为明显，当细胞从分裂的G0期进入G1期，伴随着HSP70的产生[2]。而增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)是DNA聚合酶S的辅因子，在细胞周期中对细胞分裂和DNA合成起关键作用[3]。本实验旨在通过PCNA来反映细胞增生，探讨HSP70在动脉损伤后内膜增厚中的作用，为防治再狭窄提供实验依据。
, http://www.100md.com
材料与方法
一、模型复制及实验分组：
选用普食喂养的健康大耳白兔24只，体重2.10～2.75 kg，雌雄不拘，4～6月龄。用戊巴比妥钠(30 mg/kg.iv)麻醉，采用Clowes法[4]行右颈总动脉内皮剥脱术。术后连续3 d肌注青霉素40 万U/d，预防感染。造型兔随机分为术后3、9、14、28 d组(n=6)，左颈总动脉相应部位为正常对照。
二、取材及处理：
各组分别于预定天数静脉麻醉下取右颈总动脉损伤段及左颈总相应部位血管段。每段血管均常规透射电镜制样及光镜制样，蜡块作厚4 μm的连续血管横切片，至少备4张玻片，分别作HE、弹力纤维染色及HSP70、PCNA免疫组化染色(玻片预先涂多聚赖氨酸防脱片)。
三、指标检测：
, 百拇医药
1.免疫组化染色：切片常规脱蜡入水，3% H2O2灭活内源性过氧化物酶；经抗原修复后加二抗同种动物正常血清封闭，然后依次加入一抗(HSP70或PCNA单抗，均为Sigma.Co产品，反应1～2 h)、生物素化二抗及链霉亲和素-生物素-过氧化物酶复合物；DAB显色；苏木素复染。PCNA染色胞核棕色者为表达阳性(增殖期)细胞；HSP70染色胞核或/和胞浆棕色者为表达阳性细胞。均设置替代对照染色(以磷酸盐缓冲液代替一抗)。
2.计算机图像分析(德国Contron.Co.IBAS仪)：于20×物镜下测定各阳性片着色的平均光密度(MOD)和阳性表达面积率(area%，为阳性表达的面积占视野中所有核总面积的百分率)。前者反映阳性表达强度，后者反映阳性表达率，参照罗莉等[5]方法(略作修改)计算表达指数(expression index, EI)：
EI(%)＝MOD×area%×100
, 百拇医药
四、统计分析：
数据均以
±s表示，多组比较采用单因素方差分析，两两比较采用Newman-Keuls法q检验，双侧α＝0.05；采用Pearson's乘积矩相关分析。结果
一、形态学表现：
HE及弹力纤维染色均示明显的内膜剥脱后增生反应，14 d组最为明显；HE染色显示增厚的内膜中细胞丰富，细胞形态较长梭形平滑肌细胞胖大，呈纺锤形，似成纤维细胞样(图1)，透射电镜(日产H-600型)下于新生内膜层及靠近内弹力膜部位的中膜可见大量“合成型”平滑肌细胞，其胞浆内肌丝成分减少或消失，而粗面内质网、线粒体和游离核糖体等丰富。
, http://www.100md.com
Fig 1 Histologic section with HE stainning of an artery 14 days after injury.(Note the red elastic fibers and the smooth muscle cells with thin blue nuclei.There are lots of fibroblast-like cells in the neointimal within internal elastic laminae.×20)
图1 损伤后14 d HE染色组织片
免疫组化染色示PCNA表达细胞分布于新生内膜及中膜的内膜侧(图2)；HSP70表达细胞分布于新生内膜全层而中膜或外膜少见或无分布(图3)。
Fig 2 Histologic section with positive PCNA stainning of an artery 14 days after injury.(Note brown positive nuclei and the positive cells are mostly in the neointima within internal elastic laminae,there are a few in the media near intima.×40)
, 百拇医药
图2 损伤后14 d PCNA阳性组织片
Fig 3 Histologic section with positive HSP70 stainning of an artery 14 days after injury.(Note lots of HSP70-expressed cells in the neointima, some HSP70 in the nuclei, some in plasma.×40)
图3 损伤后14 d HSP70阳性组织片
二、图像定量分析：
PCNA表达指数(PEI)于术后9 d显著高于3 d，14 d达峰值，28 d降至3 d时水平；HSP70表达指数(HEI)变化情况同PEI(表1)。
, 百拇医药
表1 内皮剥脱后HSP70及PCNA的表达水平
Tab 1 The expression level of PCNA and HSP70
after injury (
±s，n=6) GroupEI(%)
HEI
PEI
3 d
4.51±0.74
1.68±0.50
9 d
, 百拇医药
6.71±0.88
3.64±0.43**
14 d
11.36±0.92△△
9.71±0.86△△
28 d
3.28±0.86△△
0.98±0.19△△
**P<0.01, vs 3 d; △△P<0.01, vs any other group
EI＝expression index; HEI＝HSP70 expression index;PEI＝PCNA expression index
, 百拇医药
三、相关分析：
PEI与HEI在时相上的相关系数r=0.9577，P<0.05，呈显著正相关。
讨论
HSP是氨基酸序列具有高度同源性的一组应激蛋白，HSP70是其中最丰富的一种，具有转运细胞内新合成的蛋白质及清除变性蛋白质的功能[6]，机械刺激是诱导HSP70基因表达的主要原因之一。PCNA为细胞进入细胞周期和分裂增生及DNA复制所必需，反义PCNA寡核苷酸能有效抑制细胞增生和PCNA表达；免疫细胞化学证实，静止细胞PCNA染色阴性，而血清刺激后呈阳性，位于S期细胞有大量PCNA表达，而未在S期者仅少量或无表达[3，7]。可见，PCNA为增殖期细胞特异表达的核蛋白，是细胞DNA合成不可缺少的因子，其表达情况是评价增生活性的重要生物学指标。
本实验发现HSP70有的定位于核内，有的分布于胞浆，这可能是因为HSP70具有胞内移位现象[8]：损伤首先主要发生于胞核，当细胞脱离应激状态时，HSP70又可转移至胞浆。结果显示，在阳性细胞的分布上，表达HSP70的细胞与PCNA阳性细胞及电镜所观察的合成型细胞的分布一致，这表明与损伤有关的增殖同时伴有HSP70的产生。
, 百拇医药
本实验将反映阳性细胞量的阳性表达面积率和反映阳性表达强度的阳性颗粒平均光密度相结合计算表达指数，优化了过去仅采用阳性细胞计数定量免疫组化阳性反应的方法。结果表明，HSP70表达增多的同时细胞增生程度加重，提示HSP70可能参与细胞周期的调节，诱导细胞进入DNA合成期而发生增殖。HSP70防止细胞损伤、加速损伤后修复而使细胞存活增多的原因可能正在此。这也进一步支持了万蜡香等[9]对细胞增殖与c-myc、HSP70基因表达的研究结果。HSP70表达增多的原因可能为内皮剥脱过程中自由基产生增多，使动脉壁中有关细胞的蛋白质变性，激活了热休克因子，从而启动了HSP70基因转录；而HSP70基因转录又促进了PCNA表达，故而促进了细胞增殖。
可见，HSP70可促进PTCA后动脉壁的细胞再生以加快损伤修复，但可能由于矫枉过正而致修复过度，反而促成再狭窄。HSP70基因为一后期基因，其转录和表达可能作为多种因素促进细胞增生的共同终末通路。故适当控制HSP70的量可能会更有效地控制细胞增殖，这对于防治再狭窄意义重大。
, 百拇医药
参考文献
1 Seymour Glagov.Intimal hyperplasia, Vascular modeling, and the restenosis problem.Circulation, 1994, 89:2888.
2 Sorger PK.Heat shock factor and the heat shock response.Cell, 1991, 65:363.
3 Prelich G, Stillman B.Coordinated leading and lagging strand synthesis during SV40 DNA replication in vitro requires PCNA.Cell, 1988, 53: 117.
4 Clowes AW, Reidy MA, Clowes MM.Kinetics of cellular proliferation after arterial injury.I.Smooth muscle cell growth in the absence of endothelium.Lab Invest, 1983, 49:327.
, http://www.100md.com
5 罗 莉，马述仕，王美娥，等.星形细胞瘤中P53蛋白和PCNA免疫组化的定量研究.中国体现学与图像分析，1996，1：91.
6 孙经建.热休克蛋白70的分布、调节及功能.国外医学生理、病理与临床分册，1997，17：7.
7 Speir E, Epstein SE.Inhibitin of smooth muscle cell proliferation by an antisense oligodeoxynucleotide targeting the mRNA encoding PCNA.Circulation, 1992, 86:538.
8 Weimin Zhu.Oxidized-LDL induce the expression of heat shock protein 70 in human endothelial cells.Biochem Biophysi Res Commun, 1994, 200:389.
9 万蜡香，杨和平，杨永宗，等.动脉粥样硬化形成中平滑肌细胞增殖与c-myc、HSP70基因表达的研究.中国动脉硬化杂志，1995，3：95.
(1998年5月18日收稿，1999年3月1日修回), http://www.100md.com