热休克反应对缺血-再灌心肌保护作用的机制探讨*
作者：谭红梅 吴伟康 罗汉川 梁天文
单位：中山医科大学病理生理教研室 (广州 510089)
关键词：热；休克；再灌注损伤；能量代谢；自由基
中国病理生理杂志991002
摘要 目的：探讨热休克反应对大鼠缺血-再灌心肌保护作用的可能机制。方法：SD大鼠，随机分为对照组及热休克组，动物经热休克处理恢复2或24 h后复制缺血再灌模型并进行各项检测。结果：①热休克处理后心肌组织内SOD活性显著高于对照组，MDA含量则显著低于对照组。②热休克组心肌组织内乳酸及ATP含量均显著高于对照组，糖原含量则显著低于对照组。③热休克反应能诱导HSP70i的转录。结论：热休克反应对缺血-再灌心肌的保护作用与心肌能量代谢的改善、抗氧化能力的增强以及HSP70i的转录合成增强有关。
, 百拇医药
Mechanisms responsible for the effect of heat-shock response
on ischemia and reperfusion myocardium
TAN Hong-Mei，WU Wei-Kang，LUO Han-Chuan，LIANG Tian-Wen
Department of Pathophysiology,Sun Yat-sen University of Medical Sciences,Guangzhou (510089)
Abstract AIM: To explore mechanism of heat-shock (HS) response could protect ischemia/reperfusion rat heart in vitro and in vivo.METHODS:SD rats,randomly allocated into heat shock group and control group.The following parameters were examined: ① SOD and MDA,② glycogen,lactic acid and ATP,③Northern dot blot of inducible heat shock protein (HSP70i).RESULTS: ①The SOD activity of HS group is significantly higher than that of control group,and the MDA concentration of HS group is significantly lower than that of control group.②The concentration of lactic acid and ATP of HS group are significantly higher than that of control group,and the concentration of glycogen of HS group is significantly lower than that of control group.③The results of HSP70i mRNA Northern dot blot suggested that HSP70i gene of left ventricular of HS group expressed obviously at 2 hours after heat shock.After 24 hours of recovery,no detectable expression could be seen in HS group; while the control group was negative after 2 or 24 hours of recovery.CONCLUSION: The protective mechanism of heat shock response on ischemia and reperfusion injury may be related to the improving of antioxidation and energy metabolism and the increased expression of HSP70i gene.
, 百拇医药
MeSH Heat; Shock; Reperfusion injury; Energy metabolism; Free radicals
关于热休克反应对缺血-再灌心肌的保护作用已得到了一定的承认[1]，但保护作用的机制尚未完全清楚。本实验在离体及在体大鼠心肌缺血-再灌的模型上，从自由基代谢、能量代谢以及70 kD诱导型热休克蛋白(inducible heat shock protein 70 kD,HSP70i)的合成三个方面，对其机制作了进一步的探讨。
材料与方法
一、材料：
采用SD大鼠，体重180～250 g，雌雄各半，由本校实验动物中心提供，随机分为热休克组(heat shock group,H-S,n=8)和对照组(control group,C,n=8)。SOD及MDA测定试剂盒，海军421医院抗衰老中心提供；核酸标记检测试剂盒，Boehringer Mannheim公司产品；尼龙膜，Bio-Rad公司产品。
, 百拇医药
二、方法：
1.热休克处理：按Currie等[2]的方法进行，然后于室温恢复2 h或24 h。
2.离体大鼠心脏Langendorff缺血-再灌模型：取恢复24 h的大鼠心脏，采用主动脉插管，置入37 ℃保温室内，进行主动脉灌流。灌流液为用95%的O2和5%的CO2饱和的Krebs-Hensleit液。灌流液的压力和温度严格保持恒定，0.8 kPa,(37±0.5) ℃，灌流量8～10 mL/min。操作完毕后，稳定预灌10 min，然后缺血30 min(灌流量为1 mL/min)，再灌30 min。
3.在体大鼠缺血/再灌模型： 取恢复24 h的大鼠，按宋来凤等[3]的方法进行，结扎冠状动脉左前降支缺血30 min，然后松结再灌30 min。
, 百拇医药
4.ATP的测定采用高效液相色谱法，糖原的测定采用蒽酮比色定糖法，乳酸的测定采用酶偶联四唑盐比色法，SOD(超氧化物歧化酶)活性的测定采用邻苯三酚法，MDA(丙二醛)含量的测定采用TBA法。
5.HSP70i mRNA的检测： 取恢复2 h及24 h的心室肌，提取细胞总RNA，作Northern dot blot。HSP70i cDNA探针采用地高辛标记。
6.统计方法： 采用单因素方差分析法，在SPSS统计学软件中处理，数据均以
±s表示。
结果
一、离体部分：
1.分别取缺血前(Is 0)、缺血30 min(Is 30)、再灌30 min(Rp 30)的各组离体心室肌组织测糖原、乳酸及ATP含量，结果见表1。
, 百拇医药
表1 热休克反应对离体缺血-再灌心肌能量代谢的影响
Tab 1 Effect of H-S on energy metabolism of isolated rat heart(
±s,n=8)
Glycogen(g/100g tissue)
Lactic acid(g/100g tissue)
ATP(μmol/g tissue)
C group
H-S group
C group
, 百拇医药
H-S group
C group
H-S group
Is 0
5.9±1.1
6.4±1.6
22.2±9.3
27.1±7.4
8.05±1.45
8.96±2.09
Is30
3.9±1.0
, 百拇医药
2.9±0.9*
67.4±13.1
85.6±18.9*
1.58±0.26
2.66±0.60*
Rp30
4.4±1.0
3.2±1.3*
26.3±9.0
25.5±10.2
3.46±0.79
, 百拇医药
5.27±1.10*
*P<0.05,vs C group
2.分别取缺血前、缺血30 min、再灌30 min的各组离体心室肌组织测SOD的活性及MDA的含量，结果见表2。
表2 热休克反应对离体缺血-再灌心肌SOD活性及MDA含量的影响
Tab 2 Effect of H-S on SOD and MDA of isolated rat heart(
±s,n=8)
SOD(U/0.1 g tissue)
MDA(nmol/0.1 g tissue)
, 百拇医药
C group
H-S group
C group
H-S group
Is 0
114.6±10.6
117.3±11.1
54.8±6.7
56.8±8.8
Is 30
99.1±9.2
109.6±10.7*
, http://www.100md.com
69.8±11.4
64.2±10.7
Rp 30
69.9±8.7
72.8±9.1
91.2±12.0
78.0±13.2*
*P<0.05,vs C group
二、在体部分：
1.分别取缺血前、再灌30min的各组在体左心室肌组织测糖原、乳酸及ATP的含量，结果见表3。
, 百拇医药 表3 热休克反应对在体缺血-再灌心肌能量代谢的影响
Tab 3 Effect of H-S on energy metabolism in vivo (
±s)
Glycogen(g/100 g tissue)
Lactic acid(g/100 g tissue)
ATP(μmol/g tissue)
C group
H-S group
C group
, http://www.100md.com H-S group
C group
H-S group
Is 0
5.9±1.1
6.1±1.6
22.2±9.3
20.6±6.5
8.05±1.45
8.94±2.15
Rp 30
5.0±1.3
, 百拇医药
4.1±1.1*
28.4±8.1
25.8±5.7
3.63±1.14
6.09±1.93*
*P<0.05,vs C group
2.分别取缺血前、再灌30 min的各组在体心室肌组织测SOD的活性和MDA的含量，结果见表4。
表4 热休克反应对在体缺血-再灌心肌SOD活性及MDA含量的影响
Tab 4 Effect of H-S on SOD and MDA in vivo(
±s)
, 百拇医药
SOD(U/0.1g tissue)
MDA(nmol/0.1g tissue)
C group
H-S group
C group
H-S group
Is 0
114.6±10.6
117.3±11.1
58.7±10.2
56.0±9.8
, http://www.100md.com
Rp 30
86.4±8.8
94.6±9.3
79.7±13.4
65.2±10.5*
*P<0.05,vs C group
三、杂交结果：
Northern dot blot结果显示，热休克处理后2 h，热休克组HSP70i基因有明显转录表达，恢复24 h后未见转录表达，而对照组均呈阴性，未见转录表达(图1)。
Fig 1 The result of Northern dot blot
, 百拇医药
(up: after 2 hours,down: after 24 hours.1: Positive control,2: negative control.A,B,C: H-S group; D,E: C group)
图1 Northern dot blot 结果
讨论
根据上述的实验结果，我们认为热休克反应的保护作用可能与以下几个方面有关：
(一) 与心肌抗氧化能力的增强有关：再灌注损伤中，氧自由基的爆发生成是其主要机制之一。MDA的浓度为膜脂质过氧化损害程度的标志。本次实验离、在体结果均提示热休克反应能减轻膜脂质过氧化损伤；且离体结果还说明热休克处理能提高缺血心肌细胞内SOD的活性；从而增强对氧自由基的清除能力，减轻自由基所致的细胞损伤。
, http://www.100md.com (二) 与能量供应的改善有关：根据文献报道，细胞膜破裂是细胞死亡的重要因素[4]，而缺血时保持细胞膜的完整所需的ATP主要来自无氧酵解。 本实验结果提示在缺血的30 min内热休克组心肌内糖酵解显著强于对照组，从而能增加缺血心肌能量的供应。从ATP的水平来看，热休克组心肌ATP的水平显著高于对照组，这表明热休克反应能改善能量的供应。较高的ATP&127;水平有利于维持细胞膜内外的离子梯度，减轻钙超载，减少细胞水肿，减少线粒体的肿胀、破裂，一旦恢复血氧的供应，能迅速恢复氧化磷酸化功能，因而再灌30 min时心肌ATP的水平仍显著高于对照组，最终可以减少细胞的破坏、死亡，起到保护心肌的作用。
(三) 与HSP70i的合成增强有关：本实验Northern dot blot结果显示，经过热休克处理恢复2 h的大鼠心肌HSP70i mRNA表达呈阳性，而对照组呈阴性，由此可见，热休克反应能激活心肌HSP70i基因，使之进行转录、表达。热休克处理恢复24 h后，心肌HSP70i mRNA表达呈阴性，这可能是因为当HSP70i堆积到一定量以后，就会发挥一种负反馈调节作用，这主要受游离的HSP70i的量的控制。有资料报道，当游离HSP70i的量达到正常情况下的10倍时，就会反馈抑制HSP70i基因的转录、表达[5]，此时尽管HSP70i mRNA的转录停止，但HSP70i已大量堆积，因而仍具有保护作用，而此时对照组仍为阴性。目前认为，HSP70i的保护作用主要是通过促进变性蛋白质的复性/水解，维持蛋白质的结构，促进新合成的蛋白质取代老化蛋白质来实现的[6]。此外，热休克蛋白还能改变肌动蛋白等的物理性质，防止细胞骨架破裂及减轻钙超载损伤[7]。
, 百拇医药
*国家卫生部科研课题 (No.94-2-055)
参考文献
1 谭红梅,吴伟康,罗汉川.热休克反应对缺血-再灌心肌的保护作用探讨.中山医科大学学报，1998，19:277.
2 Currie RW,Karmazyn M,Kloc M,et al.Heat-shock response is associated with enhanced postischemic ventricular recovery.Circulation，1988，63:543.
3 宋来凤,章志前.离体大鼠心脏冠状动脉结扎缺氧的超微结构变化.中华心血管病杂志，1982，10:292.
4 Jennings RB,Reimer KA.The cell biology of acute myocardial ischemia.Annu Rev Med， 1991，42:225.
, 百拇医药
5 Knowlton AA.The role of heat shock proteins in the heart.J Mol Cell Cardiol， 1995，27:121.
6 Baler R,Dahl G,Voellmy R.Activation of human heat shock genes is accompanied by oligomerization,modification,and rapid translocation of heat shock transcription factor HSF1.Mol Cell Biol， 1993，13:2486.
7 Mestril R,Dillmann WH.Heat shock proteins and protection against myocardial ischemia.J Mol Cell Cardiol，1995，27:45.
(1998年8月5月收稿，1999年1月29日修回), 百拇医药
单位：中山医科大学病理生理教研室 (广州 510089)
关键词：热；休克；再灌注损伤；能量代谢；自由基
中国病理生理杂志991002
摘要 目的：探讨热休克反应对大鼠缺血-再灌心肌保护作用的可能机制。方法：SD大鼠，随机分为对照组及热休克组，动物经热休克处理恢复2或24 h后复制缺血再灌模型并进行各项检测。结果：①热休克处理后心肌组织内SOD活性显著高于对照组，MDA含量则显著低于对照组。②热休克组心肌组织内乳酸及ATP含量均显著高于对照组，糖原含量则显著低于对照组。③热休克反应能诱导HSP70i的转录。结论：热休克反应对缺血-再灌心肌的保护作用与心肌能量代谢的改善、抗氧化能力的增强以及HSP70i的转录合成增强有关。
, 百拇医药
Mechanisms responsible for the effect of heat-shock response
on ischemia and reperfusion myocardium
TAN Hong-Mei，WU Wei-Kang，LUO Han-Chuan，LIANG Tian-Wen
Department of Pathophysiology,Sun Yat-sen University of Medical Sciences,Guangzhou (510089)
Abstract AIM: To explore mechanism of heat-shock (HS) response could protect ischemia/reperfusion rat heart in vitro and in vivo.METHODS:SD rats,randomly allocated into heat shock group and control group.The following parameters were examined: ① SOD and MDA,② glycogen,lactic acid and ATP,③Northern dot blot of inducible heat shock protein (HSP70i).RESULTS: ①The SOD activity of HS group is significantly higher than that of control group,and the MDA concentration of HS group is significantly lower than that of control group.②The concentration of lactic acid and ATP of HS group are significantly higher than that of control group,and the concentration of glycogen of HS group is significantly lower than that of control group.③The results of HSP70i mRNA Northern dot blot suggested that HSP70i gene of left ventricular of HS group expressed obviously at 2 hours after heat shock.After 24 hours of recovery,no detectable expression could be seen in HS group; while the control group was negative after 2 or 24 hours of recovery.CONCLUSION: The protective mechanism of heat shock response on ischemia and reperfusion injury may be related to the improving of antioxidation and energy metabolism and the increased expression of HSP70i gene.
, 百拇医药
MeSH Heat; Shock; Reperfusion injury; Energy metabolism; Free radicals
关于热休克反应对缺血-再灌心肌的保护作用已得到了一定的承认[1]，但保护作用的机制尚未完全清楚。本实验在离体及在体大鼠心肌缺血-再灌的模型上，从自由基代谢、能量代谢以及70 kD诱导型热休克蛋白(inducible heat shock protein 70 kD,HSP70i)的合成三个方面，对其机制作了进一步的探讨。
材料与方法
一、材料：
采用SD大鼠，体重180～250 g，雌雄各半，由本校实验动物中心提供，随机分为热休克组(heat shock group,H-S,n=8)和对照组(control group,C,n=8)。SOD及MDA测定试剂盒，海军421医院抗衰老中心提供；核酸标记检测试剂盒，Boehringer Mannheim公司产品；尼龙膜，Bio-Rad公司产品。
, 百拇医药
二、方法：
1.热休克处理：按Currie等[2]的方法进行，然后于室温恢复2 h或24 h。
2.离体大鼠心脏Langendorff缺血-再灌模型：取恢复24 h的大鼠心脏，采用主动脉插管，置入37 ℃保温室内，进行主动脉灌流。灌流液为用95%的O2和5%的CO2饱和的Krebs-Hensleit液。灌流液的压力和温度严格保持恒定，0.8 kPa,(37±0.5) ℃，灌流量8～10 mL/min。操作完毕后，稳定预灌10 min，然后缺血30 min(灌流量为1 mL/min)，再灌30 min。
3.在体大鼠缺血/再灌模型： 取恢复24 h的大鼠，按宋来凤等[3]的方法进行，结扎冠状动脉左前降支缺血30 min，然后松结再灌30 min。
, 百拇医药
4.ATP的测定采用高效液相色谱法，糖原的测定采用蒽酮比色定糖法，乳酸的测定采用酶偶联四唑盐比色法，SOD(超氧化物歧化酶)活性的测定采用邻苯三酚法，MDA(丙二醛)含量的测定采用TBA法。
5.HSP70i mRNA的检测： 取恢复2 h及24 h的心室肌，提取细胞总RNA，作Northern dot blot。HSP70i cDNA探针采用地高辛标记。
6.统计方法： 采用单因素方差分析法，在SPSS统计学软件中处理，数据均以
±s表示。结果
一、离体部分：
1.分别取缺血前(Is 0)、缺血30 min(Is 30)、再灌30 min(Rp 30)的各组离体心室肌组织测糖原、乳酸及ATP含量，结果见表1。
, 百拇医药
表1 热休克反应对离体缺血-再灌心肌能量代谢的影响
Tab 1 Effect of H-S on energy metabolism of isolated rat heart(
±s,n=8)Glycogen(g/100g tissue)
Lactic acid(g/100g tissue)
ATP(μmol/g tissue)
C group
H-S group
C group
, 百拇医药
H-S group
C group
H-S group
Is 0
5.9±1.1
6.4±1.6
22.2±9.3
27.1±7.4
8.05±1.45
8.96±2.09
Is30
3.9±1.0
, 百拇医药
2.9±0.9*
67.4±13.1
85.6±18.9*
1.58±0.26
2.66±0.60*
Rp30
4.4±1.0
3.2±1.3*
26.3±9.0
25.5±10.2
3.46±0.79
, 百拇医药
5.27±1.10*
*P<0.05,vs C group
2.分别取缺血前、缺血30 min、再灌30 min的各组离体心室肌组织测SOD的活性及MDA的含量，结果见表2。
表2 热休克反应对离体缺血-再灌心肌SOD活性及MDA含量的影响
Tab 2 Effect of H-S on SOD and MDA of isolated rat heart(
±s,n=8)SOD(U/0.1 g tissue)
MDA(nmol/0.1 g tissue)
, 百拇医药
C group
H-S group
C group
H-S group
Is 0
114.6±10.6
117.3±11.1
54.8±6.7
56.8±8.8
Is 30
99.1±9.2
109.6±10.7*
, http://www.100md.com
69.8±11.4
64.2±10.7
Rp 30
69.9±8.7
72.8±9.1
91.2±12.0
78.0±13.2*
*P<0.05,vs C group
二、在体部分：
1.分别取缺血前、再灌30min的各组在体左心室肌组织测糖原、乳酸及ATP的含量，结果见表3。
, 百拇医药 表3 热休克反应对在体缺血-再灌心肌能量代谢的影响
Tab 3 Effect of H-S on energy metabolism in vivo (
±s)Glycogen(g/100 g tissue)
Lactic acid(g/100 g tissue)
ATP(μmol/g tissue)
C group
H-S group
C group
, http://www.100md.com H-S group
C group
H-S group
Is 0
5.9±1.1
6.1±1.6
22.2±9.3
20.6±6.5
8.05±1.45
8.94±2.15
Rp 30
5.0±1.3
, 百拇医药
4.1±1.1*
28.4±8.1
25.8±5.7
3.63±1.14
6.09±1.93*
*P<0.05,vs C group
2.分别取缺血前、再灌30 min的各组在体心室肌组织测SOD的活性和MDA的含量，结果见表4。
表4 热休克反应对在体缺血-再灌心肌SOD活性及MDA含量的影响
Tab 4 Effect of H-S on SOD and MDA in vivo(
±s), 百拇医药
SOD(U/0.1g tissue)
MDA(nmol/0.1g tissue)
C group
H-S group
C group
H-S group
Is 0
114.6±10.6
117.3±11.1
58.7±10.2
56.0±9.8
, http://www.100md.com
Rp 30
86.4±8.8
94.6±9.3
79.7±13.4
65.2±10.5*
*P<0.05,vs C group
三、杂交结果：
Northern dot blot结果显示，热休克处理后2 h，热休克组HSP70i基因有明显转录表达，恢复24 h后未见转录表达，而对照组均呈阴性，未见转录表达(图1)。
Fig 1 The result of Northern dot blot
, 百拇医药
(up: after 2 hours,down: after 24 hours.1: Positive control,2: negative control.A,B,C: H-S group; D,E: C group)
图1 Northern dot blot 结果
讨论
根据上述的实验结果，我们认为热休克反应的保护作用可能与以下几个方面有关：
(一) 与心肌抗氧化能力的增强有关：再灌注损伤中，氧自由基的爆发生成是其主要机制之一。MDA的浓度为膜脂质过氧化损害程度的标志。本次实验离、在体结果均提示热休克反应能减轻膜脂质过氧化损伤；且离体结果还说明热休克处理能提高缺血心肌细胞内SOD的活性；从而增强对氧自由基的清除能力，减轻自由基所致的细胞损伤。
, http://www.100md.com (二) 与能量供应的改善有关：根据文献报道，细胞膜破裂是细胞死亡的重要因素[4]，而缺血时保持细胞膜的完整所需的ATP主要来自无氧酵解。 本实验结果提示在缺血的30 min内热休克组心肌内糖酵解显著强于对照组，从而能增加缺血心肌能量的供应。从ATP的水平来看，热休克组心肌ATP的水平显著高于对照组，这表明热休克反应能改善能量的供应。较高的ATP&127;水平有利于维持细胞膜内外的离子梯度，减轻钙超载，减少细胞水肿，减少线粒体的肿胀、破裂，一旦恢复血氧的供应，能迅速恢复氧化磷酸化功能，因而再灌30 min时心肌ATP的水平仍显著高于对照组，最终可以减少细胞的破坏、死亡，起到保护心肌的作用。
(三) 与HSP70i的合成增强有关：本实验Northern dot blot结果显示，经过热休克处理恢复2 h的大鼠心肌HSP70i mRNA表达呈阳性，而对照组呈阴性，由此可见，热休克反应能激活心肌HSP70i基因，使之进行转录、表达。热休克处理恢复24 h后，心肌HSP70i mRNA表达呈阴性，这可能是因为当HSP70i堆积到一定量以后，就会发挥一种负反馈调节作用，这主要受游离的HSP70i的量的控制。有资料报道，当游离HSP70i的量达到正常情况下的10倍时，就会反馈抑制HSP70i基因的转录、表达[5]，此时尽管HSP70i mRNA的转录停止，但HSP70i已大量堆积，因而仍具有保护作用，而此时对照组仍为阴性。目前认为，HSP70i的保护作用主要是通过促进变性蛋白质的复性/水解，维持蛋白质的结构，促进新合成的蛋白质取代老化蛋白质来实现的[6]。此外，热休克蛋白还能改变肌动蛋白等的物理性质，防止细胞骨架破裂及减轻钙超载损伤[7]。
, 百拇医药
*国家卫生部科研课题 (No.94-2-055)
参考文献
1 谭红梅,吴伟康,罗汉川.热休克反应对缺血-再灌心肌的保护作用探讨.中山医科大学学报，1998，19:277.
2 Currie RW,Karmazyn M,Kloc M,et al.Heat-shock response is associated with enhanced postischemic ventricular recovery.Circulation，1988，63:543.
3 宋来凤,章志前.离体大鼠心脏冠状动脉结扎缺氧的超微结构变化.中华心血管病杂志，1982，10:292.
4 Jennings RB,Reimer KA.The cell biology of acute myocardial ischemia.Annu Rev Med， 1991，42:225.
, 百拇医药
5 Knowlton AA.The role of heat shock proteins in the heart.J Mol Cell Cardiol， 1995，27:121.
6 Baler R,Dahl G,Voellmy R.Activation of human heat shock genes is accompanied by oligomerization,modification,and rapid translocation of heat shock transcription factor HSF1.Mol Cell Biol， 1993，13:2486.
7 Mestril R,Dillmann WH.Heat shock proteins and protection against myocardial ischemia.J Mol Cell Cardiol，1995，27:45.
(1998年8月5月收稿，1999年1月29日修回), 百拇医药