左肾静脉不全结扎对大鼠肾水通道蛋白1和水通道蛋白2 mRNA表达的影响
作者：王蔚东 田长生 李杨 李春凌 赵丹 赵雪俭 杨宝学
单位：王蔚东 田长生 李杨 李春凌 赵丹 赵雪俭(白求恩医科大学病理生理教研室，吉林 长春 130021)；杨宝学(美国加利佛尼亚大学)
关键词：肾；静脉压；大鼠
中国病理生理杂志000115
[摘 要] 目的：观察左肾静脉不全结扎大鼠肾AQP1和AQP2 mRNA表达的变化，探讨肾静脉压增高引起肾小管重吸收减少的分子机制。方法：成年雄性Wistar大鼠随机分成左肾静脉不全结扎组(VCG)和假手术组(SOG)，用左肾静脉不全结扎法复制精索静脉曲张，2月后进行Northern blot分析。结果：与SOG相比，VCG大鼠左肾AQP1 mRNA表达强度明显减弱，AQP2 mRNA表达强度则无明显差异，睾丸组织无杂交信号。结论：左肾静脉不全结扎大鼠肾静脉压增高引起肾小管重吸收减少可能与AQP1 mRNA表达减少有关，在集合管可能存在激素逃逸的现象。
, 百拇医药
[中图分类号] Q 522+.2 [文献标识码] A
[文章编号]1000-4718(2000)01-0054-03
Effects of left renal vein partial ligation on rat renal AQP1 and AQP2 mRNA
WANG Wei-dong, TIAN Chang-sheng, LI Yang, LI Chun-ling, ZHAO Dan, ZHAO Xue-jian, YANG Bao-xue
(Department of Pathophysiology, Norman Bethune University of Medical Sciences, Changchun 130021, China)
, 百拇医药
[Abstract] AIM:Changes of rat renal aquaporin (AQP1) and AQP2 mRNA expression after partially ligating left renal vein were observed to explore molecular mechanism of renal tubular reabsorption decrease resulted by increasing renal vein pressure.METHODS：Adult male rats were randomly divided into left renal vein partial ligation group(ie. VCG, varicocele group ) and sham operation group (SOG), left renal mRNA expression was analyed by Northen blot two months later.RESULTS：Intensity of left renal AQP1 mRNA expression in VCG was weaker than that in SOG, there was not any difference in left renal AQP2 mRNA expression between two groups, no hybridization signal was found in testes.CONCLUSION：Decrease of renal tubular reabsorption resulted by partially ligating renal vein might be related to decrease of AQP1 mRNA expression; “hormone escape" might occur in collecting tubules.
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[MeSH] Kidney; Venous pressure; Rats
水通道蛋白(aquaporins, water channels, AQPs)是多种组织细胞膜上存在的转运水的特异性孔道。目前从哺乳动物的细胞中已经鉴定出至少10种水通道蛋白，它们同为选择性水孔道的内在膜蛋白家族成员[1]。AQP1是最早被发现并鉴定的水通道[2]，已经成为该家族的代表，主要表达在肾单位的近端小管和髓袢下降支细段上皮细胞的顶质膜，参与水的重吸收。AQP2仅存在于肾集合管上皮细胞顶质膜，是目前被发现的唯一的受激素调节的水通道[3]。人们对水通道的研究还仅限于其生理作用及调节机制方面，关于水通道在病理生理方面的变化及机制尚无报道。本文利用分子生物学手段研究了左肾静脉不全结扎对大鼠AQP1和AQP2mRNA表达的影响。
材 料 和 方 法
, 百拇医药 一、动物分组与模型复制：
成年雄性Wistar大鼠30只(本校实验动物部提供)，体重220～290 g，随机分成左肾静脉不全结扎组(varicocele group，VCG)和假手术组(sham operation group, SOG)。左肾静脉不全结扎组大鼠全麻后，仰卧固定于鼠板上，无菌条件下打开腹腔暴露并分离左肾静脉，置一直径1 mm的光滑探针于肾静脉上，将其与肾静脉一并结扎，小心拔出探针，使肾静脉复通，造成肾静脉的部分狭窄。SOG动物处理基本同上，区别在于只分离左肾静脉而不实施结扎。术后2个月，取肾脏，切成1 cm×0.5 cm小块，液氮保存。
二、水通道mRNA表达的检测：
1.AQP1和AQP2探针的制备：大鼠AQP1和AQP2重组质粒由美国加利佛尼亚大学杨宝学博士提供，该片段包含AQP1，AQP2的表达载体。
, 百拇医药 应用常规方法制备感受态菌，扩增重组质粒，进行酶切和回收等。
AQP1，AQP2探针标记应用随机引物法，[32P]-dCTP购自北京亚辉公司。
2.应用异硫氰酸胍一步法提取肾脏和睾丸的总RNA[4]。
3.Northern印迹杂交：大鼠肾总RNA经甲醛凝胶电泳后转移至尼龙膜并固定，将杂交膜以6×SSC浸润并浸泡2 min，后与预杂交液一道置杂交袋内，42℃振荡水浴，预杂交2 h；弃去杂交液，将标记的变性DNA探针与杂交液置杂交袋内，42℃振荡水浴18 h；洗膜后，将尼龙膜置增感屏下-70℃曝光72 h，经显影定影后观察结果(以上所用试剂均购于华美公司)。
结 果
一、AQP1和AQP2cDNA片段的制备：
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图1为重组质粒转化入已制备成感受态的JM109菌中，经筛选后的一个菌落，接种于LB液体培养基中，经小量扩增后获得的粗提质粒以及用Xbal/EcoRI酶切后所得AQP1片段的电泳图。所需AQP1和AQP2 cDNA片段均为800 bp(AQP2的电泳图略)。
二、肾和睾丸AQP1和AQP2的Northern印迹：
图2为两组大鼠左肾和睾丸总RNA电泳结果，清晰可见18S和28S。图3为两组大鼠左肾和睾丸AQP1和AQP2的Northern印迹结果，如图所示，与SOG相比，VCG左肾AQP1 mRNA表达强度明显减弱，AQP2 mRNA表达强度则无明显差异，睾丸组织无杂交信号。
Fig 1 AQP1 recombinant plasmid and cDNA fragment
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Lang 1：λ DNA markers；Lang 2：λ AQP1 recombinant plasmid； Lang 3：λ AQP1 plasmid cut by Xba Ⅰ；Lang 4：λ AQP1 plasmid cut by Xba Ⅰ/EcoR Ⅰ and fragment
图1 AQP1重组质粒及cDNA片段
Fig 2 Electrophoresis of renal and testicular total RNA of rat
Lang 1-2：SOG renal；Lang 3-4：VCG renal；
Lang 5-6：SOG testes；Lang 7-8：VCG testes
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图2 肾和睾丸总RNA电泳图
Fig 3 Northern blot analysis of renal and testicular AQP1,AQP2 mRNA
Lane 1-2：SOG renal；Lane 3-4：VCG renal；
Lane 5-6：SOG testes；Lane 7-8：VCG testes
图3 肾和睾丸AQP1，AQP2 mRNA的Northern blot分析
讨 论
90年代初对第一个水通道蛋白分子结构和功能的鉴定标志着对液体跨膜和跨细胞转运机制的重新认识。大量实验证明，水通道在维持机体的水平衡中起着重要的作用，且与水平衡紊乱所造成的某些疾病有密切的关系。水通道被发现，深化了对水肿，肾功能衰竭等的病理生理学机制的认识，并且为人们对类似疾病的治疗提供了新的思路。已发现的至少10种哺乳动物的水通道存在于多种组织和细胞，特别是那些参与液体代谢和调节的细胞，如在肾脏至少就有AQP1-4 4种水通道的表达[5，6]。
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AQP1分布在大鼠肾脏的近端小管和髓袢处上皮细胞膜上，这种分布与肾脏重吸收功能相适应。AQP2仅存在于集合管主细胞顶质膜上，它在调节水的排泄中起重要作用。约有10%的肾小球滤过液流经集合管时是在AQP2的参与下被重吸收的，加压素可使AQP2蛋白在集合管细胞顶质膜表达增加[7]。在睾丸中未见这两型水通道的表达，这与前人的报道一致[8]。本研究组应用免疫组化方法也证明了上述发现(另文发表)。
本文利用Northern杂交技术证明在肾脏确有AQP1和AQP2mRNA表达，而睾丸则为阴性。同时发现VCG大鼠和SOG相比，左肾AQP1 mRNA表达明显降低，这与免疫组化证实的AQP1蛋白表达减弱相符合。
肾静脉不全结扎后，血管压力上升，由于管周小血管静水压与肾静脉压差值很小，肾静脉压即便轻度增加也会波及到小血管，从而引起毛细血管和小静脉的扩张，继之使肾小管腔压力上升，肾小球囊内压增高，肾小球滤过率下降。由于球-管因素的的存在，肾小球滤过率的下降，会伴随肾小管的重吸收下降。
, 百拇医药
作者认为，肾静脉不全阻断所引起的肾小管重吸收下降的分子基础可能是AQP1的表达减弱。由于肾血液动力学的改变，肾小球滤过率下降，或许通过某种途径(如某种因子)，引发肾小管上皮细胞AQP1合成的减少以适应这种改变。当然，由于静脉血流不畅，导致上皮细胞功能受损而引起水通道的表达减少也是一种可能，但似乎不能解释同样条件下集合管AQP2正常表达的现象。
AQP2 mRNA在两组的表达强度没有差异，提示大鼠集合管对水的重吸收未受影响。Seldin和Giebisch等认为肾静水压升高，会导致近端小管对钠重吸收的下降，在集合管，则出现盐皮质激素逃逸的现象，而使尿量增加，可能是此时该处细胞对激素敏感性减弱的缘故[9]。这或许能解释为什么AQP2未发生变化，但更确切的机制以及究竟是什么影响着肾水通道的表达仍需进一步探讨。
[参 考 文 献]
[1] Umenishi-F, Verkman-AS. Isolation and functional analysis of alternative promoters in the human aquaporin-4 water channel gene[J]. Genomic, 1998, 50(3):373～377.
, 百拇医药
[2] Preston GM, Agre P. Isolation of the cDNA for erythrocyte integral membrane protein of 28 kilodaltons: Member of an ancient channel family[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1991, 88:11110～11114.
[3] Nielson S, Chou CL, Lewes S A, et al. Vasopressin increases water permeability of kidney collecting duct by inducing translocation of aquaporin CD water channels to plasma membrane[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1995, 92:1013～1017.
[4] 赵 丹，李 杨，赵雪俭，等.异硫氰酸胍法提取大鼠总RNA及质量鉴定，白求恩医科大学学报，1995， 21(3)：245.
, 百拇医药
[5] Nielsen S, Agre P. The aquaporin family of water channels in kidney[J]. Kidney Int, 1995, 48:1057～1068.
[6] Mark A Knepper. The aquaporin family of molecular water channels[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1994, 91:6255～6258.
[7] Landon SK, Agre P. Pathophysiology of the aquaporin water channels[J]. Annv Rev Physiol, 1996, 58:619～648.
[8] Ishibashi K, Kuwahara M, Gu Y, et al. Cloning and functional expression of a new water channel abundently expressed in the testis permeable to water, glycerol and urea[J]. J Biol Chem, 1997, 272:20782～20786.
[9] Ecelkarger C A, Nielsen S, Olson B R, et al. Role of renal aquaporins in escape from vasopressin-induced antidiuresis in rat[J]. J Clin Invest, 1997, 99:1852～1863.
[收稿日期] 1998-10-22 [修回日期] 1999-03-16, 百拇医药
单位：王蔚东 田长生 李杨 李春凌 赵丹 赵雪俭(白求恩医科大学病理生理教研室，吉林 长春 130021)；杨宝学(美国加利佛尼亚大学)
关键词：肾；静脉压；大鼠
中国病理生理杂志000115
[摘 要] 目的：观察左肾静脉不全结扎大鼠肾AQP1和AQP2 mRNA表达的变化，探讨肾静脉压增高引起肾小管重吸收减少的分子机制。方法：成年雄性Wistar大鼠随机分成左肾静脉不全结扎组(VCG)和假手术组(SOG)，用左肾静脉不全结扎法复制精索静脉曲张，2月后进行Northern blot分析。结果：与SOG相比，VCG大鼠左肾AQP1 mRNA表达强度明显减弱，AQP2 mRNA表达强度则无明显差异，睾丸组织无杂交信号。结论：左肾静脉不全结扎大鼠肾静脉压增高引起肾小管重吸收减少可能与AQP1 mRNA表达减少有关，在集合管可能存在激素逃逸的现象。
, 百拇医药
[中图分类号] Q 522+.2 [文献标识码] A
[文章编号]1000-4718(2000)01-0054-03
Effects of left renal vein partial ligation on rat renal AQP1 and AQP2 mRNA
WANG Wei-dong, TIAN Chang-sheng, LI Yang, LI Chun-ling, ZHAO Dan, ZHAO Xue-jian, YANG Bao-xue
(Department of Pathophysiology, Norman Bethune University of Medical Sciences, Changchun 130021, China)
, 百拇医药
[Abstract] AIM:Changes of rat renal aquaporin (AQP1) and AQP2 mRNA expression after partially ligating left renal vein were observed to explore molecular mechanism of renal tubular reabsorption decrease resulted by increasing renal vein pressure.METHODS：Adult male rats were randomly divided into left renal vein partial ligation group(ie. VCG, varicocele group ) and sham operation group (SOG), left renal mRNA expression was analyed by Northen blot two months later.RESULTS：Intensity of left renal AQP1 mRNA expression in VCG was weaker than that in SOG, there was not any difference in left renal AQP2 mRNA expression between two groups, no hybridization signal was found in testes.CONCLUSION：Decrease of renal tubular reabsorption resulted by partially ligating renal vein might be related to decrease of AQP1 mRNA expression; “hormone escape" might occur in collecting tubules.
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[MeSH] Kidney; Venous pressure; Rats
水通道蛋白(aquaporins, water channels, AQPs)是多种组织细胞膜上存在的转运水的特异性孔道。目前从哺乳动物的细胞中已经鉴定出至少10种水通道蛋白，它们同为选择性水孔道的内在膜蛋白家族成员[1]。AQP1是最早被发现并鉴定的水通道[2]，已经成为该家族的代表，主要表达在肾单位的近端小管和髓袢下降支细段上皮细胞的顶质膜，参与水的重吸收。AQP2仅存在于肾集合管上皮细胞顶质膜，是目前被发现的唯一的受激素调节的水通道[3]。人们对水通道的研究还仅限于其生理作用及调节机制方面，关于水通道在病理生理方面的变化及机制尚无报道。本文利用分子生物学手段研究了左肾静脉不全结扎对大鼠AQP1和AQP2mRNA表达的影响。
材 料 和 方 法
, 百拇医药 一、动物分组与模型复制：
成年雄性Wistar大鼠30只(本校实验动物部提供)，体重220～290 g，随机分成左肾静脉不全结扎组(varicocele group，VCG)和假手术组(sham operation group, SOG)。左肾静脉不全结扎组大鼠全麻后，仰卧固定于鼠板上，无菌条件下打开腹腔暴露并分离左肾静脉，置一直径1 mm的光滑探针于肾静脉上，将其与肾静脉一并结扎，小心拔出探针，使肾静脉复通，造成肾静脉的部分狭窄。SOG动物处理基本同上，区别在于只分离左肾静脉而不实施结扎。术后2个月，取肾脏，切成1 cm×0.5 cm小块，液氮保存。
二、水通道mRNA表达的检测：
1.AQP1和AQP2探针的制备：大鼠AQP1和AQP2重组质粒由美国加利佛尼亚大学杨宝学博士提供，该片段包含AQP1，AQP2的表达载体。
, 百拇医药 应用常规方法制备感受态菌，扩增重组质粒，进行酶切和回收等。
AQP1，AQP2探针标记应用随机引物法，[32P]-dCTP购自北京亚辉公司。
2.应用异硫氰酸胍一步法提取肾脏和睾丸的总RNA[4]。
3.Northern印迹杂交：大鼠肾总RNA经甲醛凝胶电泳后转移至尼龙膜并固定，将杂交膜以6×SSC浸润并浸泡2 min，后与预杂交液一道置杂交袋内，42℃振荡水浴，预杂交2 h；弃去杂交液，将标记的变性DNA探针与杂交液置杂交袋内，42℃振荡水浴18 h；洗膜后，将尼龙膜置增感屏下-70℃曝光72 h，经显影定影后观察结果(以上所用试剂均购于华美公司)。
结 果
一、AQP1和AQP2cDNA片段的制备：
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图1为重组质粒转化入已制备成感受态的JM109菌中，经筛选后的一个菌落，接种于LB液体培养基中，经小量扩增后获得的粗提质粒以及用Xbal/EcoRI酶切后所得AQP1片段的电泳图。所需AQP1和AQP2 cDNA片段均为800 bp(AQP2的电泳图略)。
二、肾和睾丸AQP1和AQP2的Northern印迹：
图2为两组大鼠左肾和睾丸总RNA电泳结果，清晰可见18S和28S。图3为两组大鼠左肾和睾丸AQP1和AQP2的Northern印迹结果，如图所示，与SOG相比，VCG左肾AQP1 mRNA表达强度明显减弱，AQP2 mRNA表达强度则无明显差异，睾丸组织无杂交信号。
Fig 1 AQP1 recombinant plasmid and cDNA fragment
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Lang 1：λ DNA markers；Lang 2：λ AQP1 recombinant plasmid； Lang 3：λ AQP1 plasmid cut by Xba Ⅰ；Lang 4：λ AQP1 plasmid cut by Xba Ⅰ/EcoR Ⅰ and fragment
图1 AQP1重组质粒及cDNA片段
Fig 2 Electrophoresis of renal and testicular total RNA of rat
Lang 1-2：SOG renal；Lang 3-4：VCG renal；
Lang 5-6：SOG testes；Lang 7-8：VCG testes
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图2 肾和睾丸总RNA电泳图
Fig 3 Northern blot analysis of renal and testicular AQP1,AQP2 mRNA
Lane 1-2：SOG renal；Lane 3-4：VCG renal；
Lane 5-6：SOG testes；Lane 7-8：VCG testes
图3 肾和睾丸AQP1，AQP2 mRNA的Northern blot分析
讨 论
90年代初对第一个水通道蛋白分子结构和功能的鉴定标志着对液体跨膜和跨细胞转运机制的重新认识。大量实验证明，水通道在维持机体的水平衡中起着重要的作用，且与水平衡紊乱所造成的某些疾病有密切的关系。水通道被发现，深化了对水肿，肾功能衰竭等的病理生理学机制的认识，并且为人们对类似疾病的治疗提供了新的思路。已发现的至少10种哺乳动物的水通道存在于多种组织和细胞，特别是那些参与液体代谢和调节的细胞，如在肾脏至少就有AQP1-4 4种水通道的表达[5，6]。
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AQP1分布在大鼠肾脏的近端小管和髓袢处上皮细胞膜上，这种分布与肾脏重吸收功能相适应。AQP2仅存在于集合管主细胞顶质膜上，它在调节水的排泄中起重要作用。约有10%的肾小球滤过液流经集合管时是在AQP2的参与下被重吸收的，加压素可使AQP2蛋白在集合管细胞顶质膜表达增加[7]。在睾丸中未见这两型水通道的表达，这与前人的报道一致[8]。本研究组应用免疫组化方法也证明了上述发现(另文发表)。
本文利用Northern杂交技术证明在肾脏确有AQP1和AQP2mRNA表达，而睾丸则为阴性。同时发现VCG大鼠和SOG相比，左肾AQP1 mRNA表达明显降低，这与免疫组化证实的AQP1蛋白表达减弱相符合。
肾静脉不全结扎后，血管压力上升，由于管周小血管静水压与肾静脉压差值很小，肾静脉压即便轻度增加也会波及到小血管，从而引起毛细血管和小静脉的扩张，继之使肾小管腔压力上升，肾小球囊内压增高，肾小球滤过率下降。由于球-管因素的的存在，肾小球滤过率的下降，会伴随肾小管的重吸收下降。
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作者认为，肾静脉不全阻断所引起的肾小管重吸收下降的分子基础可能是AQP1的表达减弱。由于肾血液动力学的改变，肾小球滤过率下降，或许通过某种途径(如某种因子)，引发肾小管上皮细胞AQP1合成的减少以适应这种改变。当然，由于静脉血流不畅，导致上皮细胞功能受损而引起水通道的表达减少也是一种可能，但似乎不能解释同样条件下集合管AQP2正常表达的现象。
AQP2 mRNA在两组的表达强度没有差异，提示大鼠集合管对水的重吸收未受影响。Seldin和Giebisch等认为肾静水压升高，会导致近端小管对钠重吸收的下降，在集合管，则出现盐皮质激素逃逸的现象，而使尿量增加，可能是此时该处细胞对激素敏感性减弱的缘故[9]。这或许能解释为什么AQP2未发生变化，但更确切的机制以及究竟是什么影响着肾水通道的表达仍需进一步探讨。
[参 考 文 献]
[1] Umenishi-F, Verkman-AS. Isolation and functional analysis of alternative promoters in the human aquaporin-4 water channel gene[J]. Genomic, 1998, 50(3):373～377.
, 百拇医药
[2] Preston GM, Agre P. Isolation of the cDNA for erythrocyte integral membrane protein of 28 kilodaltons: Member of an ancient channel family[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1991, 88:11110～11114.
[3] Nielson S, Chou CL, Lewes S A, et al. Vasopressin increases water permeability of kidney collecting duct by inducing translocation of aquaporin CD water channels to plasma membrane[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1995, 92:1013～1017.
[4] 赵 丹，李 杨，赵雪俭，等.异硫氰酸胍法提取大鼠总RNA及质量鉴定，白求恩医科大学学报，1995， 21(3)：245.
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[5] Nielsen S, Agre P. The aquaporin family of water channels in kidney[J]. Kidney Int, 1995, 48:1057～1068.
[6] Mark A Knepper. The aquaporin family of molecular water channels[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1994, 91:6255～6258.
[7] Landon SK, Agre P. Pathophysiology of the aquaporin water channels[J]. Annv Rev Physiol, 1996, 58:619～648.
[8] Ishibashi K, Kuwahara M, Gu Y, et al. Cloning and functional expression of a new water channel abundently expressed in the testis permeable to water, glycerol and urea[J]. J Biol Chem, 1997, 272:20782～20786.
[9] Ecelkarger C A, Nielsen S, Olson B R, et al. Role of renal aquaporins in escape from vasopressin-induced antidiuresis in rat[J]. J Clin Invest, 1997, 99:1852～1863.
[收稿日期] 1998-10-22 [修回日期] 1999-03-16, 百拇医药