磷酸肌酸对大鼠心肌缺氧、复氧心肌线粒体肌酸激酶肌膜型亚基mRNA表达水平的影响
作者：李芳 李辉 朱世军 王孝铭 于康振
单位：李芳 李辉 朱世军 王孝铭(解放军211医院肾内科，黑龙江 哈尔滨 150086)；于康振(兽医生物技术国家重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150001)
关键词：大鼠；心肌；低氧；RNA，信使；磷酸肌酸
中国病理生理杂志000213
[摘 要] 目的和方法：以离体心脏灌流法制备大鼠心肌缺氧、复氧模型，提取大鼠心肌mRNA并标记心肌线粒体肌酸激酶肌膜型亚基(sMiMi-CK)基因探针，进行Northern杂交，观察不同缺氧、复氧时sMiMi-CK mRNA的变化及磷酸肌酸(PCr)的保护作用。结果：随着缺氧时间的延长，sMiMi-CK的mRNA逐渐减少，复氧后sMiMi-CK进一步减少，PCr能显著改善sMiMi-CK的表达量。结论：PCr对缺氧、复氧的心肌具有明显的保护作用。
, 百拇医药
[中图分类号] Q 786 [文献标识码] A
[文章编号] 1000-4718(2000)02-0143-03
The influence of phosphocreatine on expression of mitochondrial sarcomeric creatine kinase mRNA of myocardium ischemia and reperfusion in rats
LI Fang, LI Hui, ZHU Shi-jun, WANG Xiao-ming,(Department of Pathophysiology, Harbin Medical University, Harbin 150086)
YU Kang-zhen
, 百拇医药
(Harbin Veterinary Research Institute, Harbin 150001, China)
[Abstract] AIM and METHODS: Rat myocardial mRNA was extracted and mitochondrial sarcomeric creatine kinase (sMiMi-CK) was used as labled probed in vitro myocardial ischemia/reperfusion rats. Northern blot was performed to determine the changes of sMiMi-CK mRNA in different periods of ischemia/reperfusion and the protective effect of phosphocreatine (PCr).RESULTS:During early ischemial (10 min) mRNA was decreased about 18.24%. After reperfusion mRNA decreased again. PCr effectively prevented the decrease of mRNA expression of sMiMi-CK. CONCLUSION:The results indicated that PCr may possess protective effect on anoxic and reoxygenated myocardium.
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[MeSH] Rats; Myocardium; Anoxia; RNA, messenger; Phosphocreatine
心肌缺血/再灌注损伤的治疗已成为近年来心血管研究领域的热门课题。磷酸肌酸(phosphocreatine, PCr)作为心肌保护的药物已开始在临床上试用，心肌缺血时PCr是一种最主要最直接的供能物质，而内源性PCr是极其有限的。所以，提供外源性PCr参于细胞内的能量供应，可解决心肌保护中最根本的问题——能源，但外源性PCr能否补充恢复耗尽的能量储备，国外学者做了大量研究，并证明PCr是一种极易被心肌细胞使用的能量形式[1，2]，通过碳和磷标记的试验发现，心肌中有放射性分布，这一事实证明外源性PCr可以增加细胞内PCr的总体水平，而且当心肌缺血时，这种穿透力增强[3，4]。到目前为止，对PCr作用机制的基因水平报道甚少，故本文以此为重点，观察PCr对缺氧、复氧损伤心肌线粒体肌酸激酶肌膜型亚基基因(sMiMi-CK)mRNA的影响，期望为临床应用提供理论基础。
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材 料 和 方 法
一、材料
mRNA试剂盒、地高辛试剂盒均购自Promega公司。双波长色谱扫描仪为日本岛津。
二、动物模型的复制
采用Langendorff无作功非循环式离体心脏灌流法制备心肌缺氧、复氧模型，灌流液为Krebs-Henseleit缓冲液[5]，其组成成分为(mmol/L)NaCl 119、 KCl 14.6、 MgSO41.2、 KH2PO4 1.2、 NaHCO3 25.0、 CaCl2 2.5、 Glucose 1.0。 95% O2和5% CO2混合气体由哈尔滨市气体公司提供。取2%戊巴比妥钠和0.25%肝素各按2 mL/kg体重腹腔注射，待动物麻醉后，迅速开胸，暴露心脏。在距主动脉起始部3～4 mm外剪下心脏，立即放入盛有冷灌流液(0～4℃)的平皿内，将心脏迅速移至Langendorff灌流装置上，平衡30 min后采用旷置法模拟全心缺血过程，打开旋塞恢复灌流液即再灌注，各组实验结束后，取下心脏，迅速放入液氮中保存。
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三、实验分组
分正常组、缺氧10 min组、缺氧20 min组、缺氧40 min组、缺氧60 min组、缺氧120 min组，缺氧10 min+复氧20 min组、缺氧20 min+复氧20 min组、缺氧40 min+复氧20 min组、缺氧60 min+复氧20 min组、缺氧120 min+复氧20 min组。每组7只Wistar大鼠。PCr保护组是在缺氧和复氧灌流液中分别加入PCr，使灌流液中PCr浓度维持在10-2mol/L。磷酸肌酸钠盐(C4H8O5N3 PNa2.6H2O)分析纯，购自中国科学院上海生化研究所。实验结束后，按异硫氰酸胍一步法提取总RNA[6]，OD260定RNA量，并用mRNA试剂盒分离纯化mRNA。
, 百拇医药 四、Northern杂交
按地高辛试剂盒说明书进行：(1)sMiMi-CK基因DNA探针标记；(2)点样：制备甲醛变性mRNA液，于58℃水浴15 min后，速置冰浴中冷却5 min，按不同的实验组在硝酸纤维素膜上进行点样；(3)用紫外灯照射20 min；(4)2×SSC浸泡、预杂交、杂交、免疫检测；(5)样品检测：各实验组Northern杂交后，用双波长色谱扫描仪检测，读出相对数。
结 果
由表1可以看出，随着缺氧时间的延长，大鼠心肌sMiMi-CK mRNA逐渐减少，缺氧10 min时其mRNA表达就比正常组下降19.72%，缺氧120 min时，与正常组比较减少55.36%，复氧后mRNA更进一步减少明显于正常组。缺氧40 min+PCr组sMiMi-CK mRNA的表达量显著高于缺氧40 min组，只比正常组mRNA少5.17%，同样，缺氧40 min+复氧20 min+PCr组，sMiMi-CK mRNA的表达量亦显著高于缺氧40 min+复氧20 min组，几乎是它的2倍。
, 百拇医药
表1 离体大鼠心肌缺氧、复氧损伤时
sMiMi-CK的变化及PCr的保护作用
Tab 1 Scan analysis of mRNA dot hybridization of
rat during myocardium ischemia/reperfusion(R)
and protective effect of PCr in vitro (
±s，n=7) Group
Scan value
Comparative
, http://www.100md.com with normal (%)
Normal
678.21±10.23
Ischemia 10 min
544.45±8.64＃
19.72
Ischemia 20 min
501.67±7.48＃
26.03
Ischemia 40 min
394.92±6.34＃△
, 百拇医药
41.77
Ischemia 40 min+PCr
643.13±9.84
5.17
Ischemia 60 min
365.12±6.43＃
46.16
Ischemia 120 min
302.78±4.12＃
55.36
Ischemia 10 min+R 20 min
, 百拇医药
534.31±8.62＃
21.22
Ischemia 20 min+R 20 min
491.92±7.48＃
27.47
Ischemia 40 min+R 20 min
313.14±5.42＃△
53.82
Ischemia 40 min+R 20 min+PCr
598.43±6.52＃
, 百拇医药
11.76
Ischemia 60 min+R 20 min
244.27±4.32＃
63.98
Ischemia 120 min+R 20 min
193.29±7.61＃
71.49
＃P<0.01， vs normol group; △ P<0.01， vs PCr group讨 论
近年来的研究表明，PCr不仅是作为能量底物在心肌缺血/再灌注损伤中发挥作用，而且更重要的是PCr具有细胞膜稳定作用及清除.OH自由基的作用。
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应用PCr改善心肌能量代谢比直接给予ATP要优越的多，它能直接通过细胞膜进入细胞内，满足机体对能量的急需。而临床上经常用输入外源ATP来增加心肌能量，殊不知，ATP分子体积大，并带有静电荷不易进入细胞内，更主要的是由于细胞膜上存在可使ATP分解的酶类，使ATP分解为ADP和AMP，又在5-核苷酸酶作用下，AMP进一步分解成腺苷等产物。同时，这些酶降解产物本身亦可阻碍ATP进入细胞内。尽管部分AMP及腺苷可能进入细胞内，补充细胞内腺核苷酸贮备，且腺苷及其降解产物亦具有明显的扩张局部血管作用，可增加心肌供血，但这种效应毕竟是微乎其微的。PCr则不然，它能迅速到达细胞内，及时满足机体对能量的需求[7]，显著提高sMiMi-CKmRNA的表达，减轻缺血/再灌注损伤，说明PCr能从转录水平上对心肌缺血/再灌注具有明显的保护作用，这方面的研究报道甚少，其具体作用机制不详，有待于进一步探讨。
[基金项目] 黑龙江省自然科学基金资助(D09613)
, 百拇医药
[参 考 文 献]
[1] Ruda M, Samarenko M, Afonskaya N, et al. Reduction of ventricular arrhuthmias by phosphocreatine in patients with acute myocardial infarction [J]. Am Heart J, 1988, 116:393～398.
[2] Rosenshtrauku L, Sakes V, Anyukhovsky E, et al. The antiarrhythmic action of phosphocreatine in acute myocardial ischemix [J]. Biochem Med, 1985, 34:120～125.
[3] Robinson L, Durham M, Mark N, et al. Cratine phosphate: an additive myocardial protective and antiarrhythmic agent in cardioplegia[J]. J Thorac Cardiovasc Surg,1984,87:190～198.
, http://www.100md.com
[4] Rosenshtraukh L, Richard C, Patrick N, et al. Electrophysiologic effects of exogenous phosphocreatine in cardiac tissue: Potential antiarrhythmic actions [J]. Am Heart J, 1990, 120:1111～1114.
[5] 李哲泓，徐长庆，吴惠民.锌对豚鼠心室乳头肌动作电位平台期的影响[J].中国病理生理杂志，1994，10(增刊)：710～712.
[6] 王中五. 真核细胞mRNA的提取，纯化[M]. 见：基因诊断技术.第1版.北医协和联合出版社，1993.192～196.
[7] Theo W, Markus W, Dieter B, et al. Intracellular compartmentation, structure and function of creatine kinase isoenzymes in tissues with high and fluctuating energy demands: the phosphocreatie circuit for cellular energy homeostasis [J]. Biochem J, 1992, 281:21～29.
[收稿日期]1998-09-10 [修回日期]1999-03-29
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单位：李芳 李辉 朱世军 王孝铭(解放军211医院肾内科，黑龙江 哈尔滨 150086)；于康振(兽医生物技术国家重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150001)
关键词：大鼠；心肌；低氧；RNA，信使；磷酸肌酸
中国病理生理杂志000213
[摘 要] 目的和方法：以离体心脏灌流法制备大鼠心肌缺氧、复氧模型，提取大鼠心肌mRNA并标记心肌线粒体肌酸激酶肌膜型亚基(sMiMi-CK)基因探针，进行Northern杂交，观察不同缺氧、复氧时sMiMi-CK mRNA的变化及磷酸肌酸(PCr)的保护作用。结果：随着缺氧时间的延长，sMiMi-CK的mRNA逐渐减少，复氧后sMiMi-CK进一步减少，PCr能显著改善sMiMi-CK的表达量。结论：PCr对缺氧、复氧的心肌具有明显的保护作用。
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[中图分类号] Q 786 [文献标识码] A
[文章编号] 1000-4718(2000)02-0143-03
The influence of phosphocreatine on expression of mitochondrial sarcomeric creatine kinase mRNA of myocardium ischemia and reperfusion in rats
LI Fang, LI Hui, ZHU Shi-jun, WANG Xiao-ming,(Department of Pathophysiology, Harbin Medical University, Harbin 150086)
YU Kang-zhen
, 百拇医药
(Harbin Veterinary Research Institute, Harbin 150001, China)
[Abstract] AIM and METHODS: Rat myocardial mRNA was extracted and mitochondrial sarcomeric creatine kinase (sMiMi-CK) was used as labled probed in vitro myocardial ischemia/reperfusion rats. Northern blot was performed to determine the changes of sMiMi-CK mRNA in different periods of ischemia/reperfusion and the protective effect of phosphocreatine (PCr).RESULTS:During early ischemial (10 min) mRNA was decreased about 18.24%. After reperfusion mRNA decreased again. PCr effectively prevented the decrease of mRNA expression of sMiMi-CK. CONCLUSION:The results indicated that PCr may possess protective effect on anoxic and reoxygenated myocardium.
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[MeSH] Rats; Myocardium; Anoxia; RNA, messenger; Phosphocreatine
心肌缺血/再灌注损伤的治疗已成为近年来心血管研究领域的热门课题。磷酸肌酸(phosphocreatine, PCr)作为心肌保护的药物已开始在临床上试用，心肌缺血时PCr是一种最主要最直接的供能物质，而内源性PCr是极其有限的。所以，提供外源性PCr参于细胞内的能量供应，可解决心肌保护中最根本的问题——能源，但外源性PCr能否补充恢复耗尽的能量储备，国外学者做了大量研究，并证明PCr是一种极易被心肌细胞使用的能量形式[1，2]，通过碳和磷标记的试验发现，心肌中有放射性分布，这一事实证明外源性PCr可以增加细胞内PCr的总体水平，而且当心肌缺血时，这种穿透力增强[3，4]。到目前为止，对PCr作用机制的基因水平报道甚少，故本文以此为重点，观察PCr对缺氧、复氧损伤心肌线粒体肌酸激酶肌膜型亚基基因(sMiMi-CK)mRNA的影响，期望为临床应用提供理论基础。
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材 料 和 方 法
一、材料
mRNA试剂盒、地高辛试剂盒均购自Promega公司。双波长色谱扫描仪为日本岛津。
二、动物模型的复制
采用Langendorff无作功非循环式离体心脏灌流法制备心肌缺氧、复氧模型，灌流液为Krebs-Henseleit缓冲液[5]，其组成成分为(mmol/L)NaCl 119、 KCl 14.6、 MgSO41.2、 KH2PO4 1.2、 NaHCO3 25.0、 CaCl2 2.5、 Glucose 1.0。 95% O2和5% CO2混合气体由哈尔滨市气体公司提供。取2%戊巴比妥钠和0.25%肝素各按2 mL/kg体重腹腔注射，待动物麻醉后，迅速开胸，暴露心脏。在距主动脉起始部3～4 mm外剪下心脏，立即放入盛有冷灌流液(0～4℃)的平皿内，将心脏迅速移至Langendorff灌流装置上，平衡30 min后采用旷置法模拟全心缺血过程，打开旋塞恢复灌流液即再灌注，各组实验结束后，取下心脏，迅速放入液氮中保存。
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三、实验分组
分正常组、缺氧10 min组、缺氧20 min组、缺氧40 min组、缺氧60 min组、缺氧120 min组，缺氧10 min+复氧20 min组、缺氧20 min+复氧20 min组、缺氧40 min+复氧20 min组、缺氧60 min+复氧20 min组、缺氧120 min+复氧20 min组。每组7只Wistar大鼠。PCr保护组是在缺氧和复氧灌流液中分别加入PCr，使灌流液中PCr浓度维持在10-2mol/L。磷酸肌酸钠盐(C4H8O5N3 PNa2.6H2O)分析纯，购自中国科学院上海生化研究所。实验结束后，按异硫氰酸胍一步法提取总RNA[6]，OD260定RNA量，并用mRNA试剂盒分离纯化mRNA。
, 百拇医药 四、Northern杂交
按地高辛试剂盒说明书进行：(1)sMiMi-CK基因DNA探针标记；(2)点样：制备甲醛变性mRNA液，于58℃水浴15 min后，速置冰浴中冷却5 min，按不同的实验组在硝酸纤维素膜上进行点样；(3)用紫外灯照射20 min；(4)2×SSC浸泡、预杂交、杂交、免疫检测；(5)样品检测：各实验组Northern杂交后，用双波长色谱扫描仪检测，读出相对数。
结 果
由表1可以看出，随着缺氧时间的延长，大鼠心肌sMiMi-CK mRNA逐渐减少，缺氧10 min时其mRNA表达就比正常组下降19.72%，缺氧120 min时，与正常组比较减少55.36%，复氧后mRNA更进一步减少明显于正常组。缺氧40 min+PCr组sMiMi-CK mRNA的表达量显著高于缺氧40 min组，只比正常组mRNA少5.17%，同样，缺氧40 min+复氧20 min+PCr组，sMiMi-CK mRNA的表达量亦显著高于缺氧40 min+复氧20 min组，几乎是它的2倍。
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表1 离体大鼠心肌缺氧、复氧损伤时
sMiMi-CK的变化及PCr的保护作用
Tab 1 Scan analysis of mRNA dot hybridization of
rat during myocardium ischemia/reperfusion(R)
and protective effect of PCr in vitro (
±s，n=7) GroupScan value
Comparative
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Normal
678.21±10.23
Ischemia 10 min
544.45±8.64＃
19.72
Ischemia 20 min
501.67±7.48＃
26.03
Ischemia 40 min
394.92±6.34＃△
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41.77
Ischemia 40 min+PCr
643.13±9.84
5.17
Ischemia 60 min
365.12±6.43＃
46.16
Ischemia 120 min
302.78±4.12＃
55.36
Ischemia 10 min+R 20 min
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534.31±8.62＃
21.22
Ischemia 20 min+R 20 min
491.92±7.48＃
27.47
Ischemia 40 min+R 20 min
313.14±5.42＃△
53.82
Ischemia 40 min+R 20 min+PCr
598.43±6.52＃
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11.76
Ischemia 60 min+R 20 min
244.27±4.32＃
63.98
Ischemia 120 min+R 20 min
193.29±7.61＃
71.49
＃P<0.01， vs normol group; △ P<0.01， vs PCr group讨 论
近年来的研究表明，PCr不仅是作为能量底物在心肌缺血/再灌注损伤中发挥作用，而且更重要的是PCr具有细胞膜稳定作用及清除.OH自由基的作用。
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应用PCr改善心肌能量代谢比直接给予ATP要优越的多，它能直接通过细胞膜进入细胞内，满足机体对能量的急需。而临床上经常用输入外源ATP来增加心肌能量，殊不知，ATP分子体积大，并带有静电荷不易进入细胞内，更主要的是由于细胞膜上存在可使ATP分解的酶类，使ATP分解为ADP和AMP，又在5-核苷酸酶作用下，AMP进一步分解成腺苷等产物。同时，这些酶降解产物本身亦可阻碍ATP进入细胞内。尽管部分AMP及腺苷可能进入细胞内，补充细胞内腺核苷酸贮备，且腺苷及其降解产物亦具有明显的扩张局部血管作用，可增加心肌供血，但这种效应毕竟是微乎其微的。PCr则不然，它能迅速到达细胞内，及时满足机体对能量的需求[7]，显著提高sMiMi-CKmRNA的表达，减轻缺血/再灌注损伤，说明PCr能从转录水平上对心肌缺血/再灌注具有明显的保护作用，这方面的研究报道甚少，其具体作用机制不详，有待于进一步探讨。
[基金项目] 黑龙江省自然科学基金资助(D09613)
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[参 考 文 献]
[1] Ruda M, Samarenko M, Afonskaya N, et al. Reduction of ventricular arrhuthmias by phosphocreatine in patients with acute myocardial infarction [J]. Am Heart J, 1988, 116:393～398.
[2] Rosenshtrauku L, Sakes V, Anyukhovsky E, et al. The antiarrhythmic action of phosphocreatine in acute myocardial ischemix [J]. Biochem Med, 1985, 34:120～125.
[3] Robinson L, Durham M, Mark N, et al. Cratine phosphate: an additive myocardial protective and antiarrhythmic agent in cardioplegia[J]. J Thorac Cardiovasc Surg,1984,87:190～198.
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[4] Rosenshtraukh L, Richard C, Patrick N, et al. Electrophysiologic effects of exogenous phosphocreatine in cardiac tissue: Potential antiarrhythmic actions [J]. Am Heart J, 1990, 120:1111～1114.
[5] 李哲泓，徐长庆，吴惠民.锌对豚鼠心室乳头肌动作电位平台期的影响[J].中国病理生理杂志，1994，10(增刊)：710～712.
[6] 王中五. 真核细胞mRNA的提取，纯化[M]. 见：基因诊断技术.第1版.北医协和联合出版社，1993.192～196.
[7] Theo W, Markus W, Dieter B, et al. Intracellular compartmentation, structure and function of creatine kinase isoenzymes in tissues with high and fluctuating energy demands: the phosphocreatie circuit for cellular energy homeostasis [J]. Biochem J, 1992, 281:21～29.
[收稿日期]1998-09-10 [修回日期]1999-03-29
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