脂多糖对人脐静脉内皮细胞凋亡的影响及意义
作者：宋勇 毛宝龄 王建春
单位：宋勇(南京军区南京总医院呼吸内科，江苏 南京 210002)；毛宝龄 王建春(第三军医大学 新桥医院全军呼吸病研究所，重庆 400037)
关键词：脂多糖类；内皮，血管；细胞；肺
中国病理生理杂志000209
[摘 要] 目的：探讨脂多糖(LPS)对血管内皮细胞(VEC)损伤的机制以及在急性肺损伤(ALI)发病中的作用。方法：通过建立人脐静脉内皮细胞体外培养，采用流式细胞技术观察LPS对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)凋亡的影响。结果：LPS加入细胞培养中，可明显诱导HUVEC凋亡，并随着作用时间的延长和LPS浓度增加，细胞凋亡率也相应增加，一定范围内呈时间、剂量、效应关系。结论：细胞凋亡是血管内皮细胞受损的主要方式之一。
, http://www.100md.com [中图分类号] R329.2+4 [文献标识码] A
[文章编号] 1000-4718(2000)02-0128-03
Effect of lipopolysaccharide on apoptosis of human umbilical vein endothelial cells
SONG Yong
(Department of Respiratory Medicine, Nanjing General Hospital of Nanjing Command, Nanjing 210002)
MAO Bao-ling, WANG Jian-chun
(Institute of Respiratory Disease, Xinqiao Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400037,China)
, 百拇医药
[Abstract] AIM: To explore the mechanism of lipopolysaccharide (LPS) on vascular endothelial cell(VEC) damage. METHODS: By using cytometry techniques, we studied the effects of LPS on apoptosis of human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) in vitro. RESULTS: LPS was able to induce apoptosis of HUVECs in a time-dose-dependent fashion.CONCLUSION:Apoptosis might play a role in LPS-induced damage of vascular endothelial cells.
[MeSH] Lipopolysaccharides; Endothelium, vascular; Cells; Lung
, http://www.100md.com
血管内皮细胞(vascular endothelial cell, VEC)是机体一类重要的细胞群体，在血管通透性屏障、免疫防御及炎症反应中起着极其重要的作用[1，2]。研究表明，VEC结构和功能破坏，是ARDS的重要发病机制之一[3]。本实验通过建立人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVEC)体外培养，观察脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)对HUVEC凋亡的影响；探讨致病因素对VEC损伤的机制以及在急性肺损伤(acute lung injury, ALI)发病中的作用。
材 料 和 方 法
一、实验材料
细胞来源 人新鲜脐带由新桥医院妇产科提供，大肠杆菌(O111：B4)脂多糖(LPS)，美国Sigma公司。兔抗人Ⅷ因子相关抗原抗体(CH18-0018)，美国Zymed公司。
, 百拇医药
二、人脐静脉内皮细胞体外培养的建立参照文献进行[4]；人脐静脉内皮细胞的鉴定，采用免疫组织化学SP法。
三、HUVEC凋亡的DNA琼脂糖凝胶电泳
按B.M公司试剂盒(Apoptotic DNA Ladder Kit)提供方法进行。
四、HUVEC凋亡流式细胞检测[5]
将胃蛋白酶液1 mL加入有被消化细胞的塑料试管中，室温，消化2～3 min，消化期间轻轻吹打细胞使其进一步离散、然后终止消化，收集细胞悬液，以铜网(200目)过滤，除去细胞团块，以低速离心除去细胞碎片。细胞用PBS洗1～2次，按1×106细胞/mL加入溴化乙锭(EB)染液，4℃，30min。上机(FACS 420型 美国)检测，每个样品计数10 000个细胞，采用计算机系统进行分析。
, 百拇医药
五、实验设计分组
(一)实验时使用的细胞为培养的原代细胞。每个样品的细胞数为1×106 。(二)待培养皿细胞80%融合，实验时培养液改为无血清培养液，同时加入LPS刺激，LPS作用时间为24 h。(三)LPS处理组：分为：1 μg/mL、10 μg/mL、100 μg/mL 3组。对照组：采用等量无菌生理盐水加入培养基中作为对照。
六、统计分析
全部数据都以均数±标准差(
±s)表示，采用直线相关分析和t检验。
结 果
一、人脐静脉内皮细胞体外培养的建立
采用胰蛋白酶消化法建立HUVEC体外培养，细胞于塑料培养皿中生长较快，一般过夜后大部分细胞即贴壁并生长，开始细胞呈梭形，连接呈片后显现内皮细胞形状，呈铺路石样，台盼蓝染色细胞活性在95%以上，经Ⅷ因子相关抗原免疫组化鉴定阳性；细胞纯度在90%以上，符合本实验要求。
, http://www.100md.com
二、培养时间对脂多糖诱导的HUVEC凋亡的影响
由表1可以看出，LPS 10 μg/mL作用HUVEC，随着培养时间的延长，细胞凋亡率不断升高，细胞凋亡率与培养时间呈正相关(r=0.938，P<0.01)。
三、LPS和TNFα诱导HUVEC凋亡的DNA琼脂糖凝胶电泳
LPS 10 μg/mL加入HUVEC培养24 h，DNA电泳均可见典型的“梯状”带，而对照组无上述类似变化(图1)。
四、LPS诱导HUVEC凋亡
结果表明，随LPS浓度的增加，HUVEC的凋亡率也明显增加，与对照组相比差异非常显著(P<0.01)。
表1 培养时间对HUVEC凋亡的影响
, http://www.100md.com
Tab 1 Effect of culture time on LPS-induced HUVEC
apoptosis in vitro (±s, n=4) Culture time(h)
Ratio of apoptosis(%)
4
3.3±0.3
8
6.7±0.6
12
13.8±1.1
, http://www.100md.com
24
24.8±2.5
36
26.5±2.7
Fig 1 Electrophoresis of DNA in HUVEC by LPS
A:LPS 10 μg/mL；B：λDNA/EcoR Ⅰ+Hind Ⅲ Marker
图1 HUVEC凋亡的DNA电泳
A：LPS 10μg/mL； B：λDNA/EcoR Ⅰ+Hind Ⅲ 分子量标准
表2 LPS对HUVEC凋亡的影响
, http://www.100md.com
Tab 2 Effect of LPS on HUVEC apoptosis in vitro (±s，n=4) Group
LPS(μg/mL)
Ratio of apoptosis(%)
LPS
1
6.4±1.1△
10
24.8±2.5△
100
, http://www.100md.com
36.7±3.9△
Control
2.1±0.4
△P<0.01, vs control group讨 论
血管内皮细胞衬覆于血管内壁，构成血管通透性的主要屏障。能合成和分泌调节凝血-纤溶系统的物质、调节血管张力的因子以及细胞因子等在血管形成、创伤愈合及炎症反应中起重要作用[6]。目前，VEC受损已被视为创伤、休克、感染、心血管疾病、肿瘤和急性肺损伤等多种疾病和综合征发生、发展的病理基础[7]。本研究通过建立HUVEC体外培养模型，以LPS刺激，观察其致损伤效应。结果发现，LPS加入细胞培养中，可明显诱导HUVEC凋亡，并随着作用时间的延长和LPS浓度增加，细胞凋亡率也相应增加，一定范围内呈时间、剂量、效应关系。结果提示，在ALI病程中，肺血管内皮细胞的受损，可能部分是以细胞凋亡的方式进行的。由于血管内皮细胞不属于快速自我更新的细胞群体，因此，VEC凋亡后降低了内皮细胞储备[8]，致使血管内皮裂隙增大，通透性增加，导致通透性肺水肿、发生急性呼吸窘迫综合征(ARDS)。
, 百拇医药
LPS诱导VEC凋亡的确切机制至今仍不清楚，分析LPS致VEC凋亡的机制可能与其激活特定的细胞凋亡信号通路有关。研究表明，LPS可激活ICE样蛋白酶-caspase-3，而致VEC凋亡，而caspase-3的特异性抑制剂：Ac-DEVD-CHO可阻断由LPS介导的VEC凋亡。一些研究还表明，LPS诱导VEC凋亡，氧自由基起重要作用[9]。Tseng等[10]构建了含人iNOS cDNA的腺病毒载体，转染动物血管内皮细胞后，结果表明，基因转染后可明显增加VEC的一氧化氮(NO)的合成，并抑制LPS介导的VEC凋亡，说明NO也具有保护血管内皮细胞的功能，提示吸入NO治疗ARDS的疗效可能部分与这种功能的发挥有关。尽管单一细胞类型体外培养不能反应ALI时体内微血管损伤的复杂过程，但可以从一个侧面来认识VEC受损的细胞机制和基因调控；在一定程度上可模仿ALI的临床状态。明确ALI时肺微血管内皮细胞损伤的分子机制，阻断某些基因表达和信号传导可能有效的预防、治疗ALI，降低其病死率。
, 百拇医药 [基金项目] 国家自然科学基金资助(39700056)
[参 考 文 献]
[1] Buchman TG, Abello PA, Smith EH, et al. Induction of heat shock response leads to apoptosis in endothelial cells previously exposed to endotoxin [J]. Am J Physiol,1993,265:H165～H170.
[2] Jaffe EA. Physiologic function of the normal endothelial cell. In:Loscalzo J, Creagher M, Dzau VJ. eds. Vascular Medicine [M]. 1st ed. Boston:Little Brown,1992,3～46.
, http://www.100md.com
[3] Martin MA, Silverman HJ. Gram-negative sepsis and the adult respiratory distress syndrome [J]. Clin Infect Dis,1992,14:1313～1328.
[4] 安 静，黎 鳌，杨宗城，等.胎儿脐静脉内皮细胞的培养 [J].第三军医大学学报，1990，12：222～224.
[5] 左连富，主编.流式细胞术与生物医学.第1版.辽宁科学技术出版社,1996.371～374.
[6] Vane JR, Anggard EE, Botting RM. Regulatory functions of the vascular endothelium [J]. N Engl J Med,1990,323:27～36.
, 百拇医药
[7] Sessler CN, Bloomfield GL, Fowler Ⅲ AA. Current concepts of sepsis and acute lung injury [J]. Clin Chest Med,1996,17:213～235.
[8] Eissner G, Kohlhuber F, Grell M, et al. Critical involvement of transmembrane tumor necrosis factor-α in endothelial programmed cell death mediated by ionizing radiation and bacterial endotoxin [J]. Blood,1995,85:4184～4193.
[9] Nicholson DW, Ali A, Thoronberry NA, et al. Identification and inhibition of the ICE/CED-3 protease necessary for mammalian apoptosis [J]. Nature,1995,376:37～43.
[10] Tzeng E, Kim YM, Pitt BR, et al. Adenviral transfer of the inducible nitric oxide synthase gene blocks endothelial cell apoptosis [J]. Surgery,1997,122:255～263.
[收稿日期] 1998-11-17 [修回日期] 1999-04-26
, 百拇医药
单位：宋勇(南京军区南京总医院呼吸内科，江苏 南京 210002)；毛宝龄 王建春(第三军医大学 新桥医院全军呼吸病研究所，重庆 400037)
关键词：脂多糖类；内皮，血管；细胞；肺
中国病理生理杂志000209
[摘 要] 目的：探讨脂多糖(LPS)对血管内皮细胞(VEC)损伤的机制以及在急性肺损伤(ALI)发病中的作用。方法：通过建立人脐静脉内皮细胞体外培养，采用流式细胞技术观察LPS对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)凋亡的影响。结果：LPS加入细胞培养中，可明显诱导HUVEC凋亡，并随着作用时间的延长和LPS浓度增加，细胞凋亡率也相应增加，一定范围内呈时间、剂量、效应关系。结论：细胞凋亡是血管内皮细胞受损的主要方式之一。
, http://www.100md.com [中图分类号] R329.2+4 [文献标识码] A
[文章编号] 1000-4718(2000)02-0128-03
Effect of lipopolysaccharide on apoptosis of human umbilical vein endothelial cells
SONG Yong
(Department of Respiratory Medicine, Nanjing General Hospital of Nanjing Command, Nanjing 210002)
MAO Bao-ling, WANG Jian-chun
(Institute of Respiratory Disease, Xinqiao Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400037,China)
, 百拇医药
[Abstract] AIM: To explore the mechanism of lipopolysaccharide (LPS) on vascular endothelial cell(VEC) damage. METHODS: By using cytometry techniques, we studied the effects of LPS on apoptosis of human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) in vitro. RESULTS: LPS was able to induce apoptosis of HUVECs in a time-dose-dependent fashion.CONCLUSION:Apoptosis might play a role in LPS-induced damage of vascular endothelial cells.
[MeSH] Lipopolysaccharides; Endothelium, vascular; Cells; Lung
, http://www.100md.com
血管内皮细胞(vascular endothelial cell, VEC)是机体一类重要的细胞群体，在血管通透性屏障、免疫防御及炎症反应中起着极其重要的作用[1，2]。研究表明，VEC结构和功能破坏，是ARDS的重要发病机制之一[3]。本实验通过建立人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVEC)体外培养，观察脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)对HUVEC凋亡的影响；探讨致病因素对VEC损伤的机制以及在急性肺损伤(acute lung injury, ALI)发病中的作用。
材 料 和 方 法
一、实验材料
细胞来源 人新鲜脐带由新桥医院妇产科提供，大肠杆菌(O111：B4)脂多糖(LPS)，美国Sigma公司。兔抗人Ⅷ因子相关抗原抗体(CH18-0018)，美国Zymed公司。
, 百拇医药
二、人脐静脉内皮细胞体外培养的建立参照文献进行[4]；人脐静脉内皮细胞的鉴定，采用免疫组织化学SP法。
三、HUVEC凋亡的DNA琼脂糖凝胶电泳
按B.M公司试剂盒(Apoptotic DNA Ladder Kit)提供方法进行。
四、HUVEC凋亡流式细胞检测[5]
将胃蛋白酶液1 mL加入有被消化细胞的塑料试管中，室温，消化2～3 min，消化期间轻轻吹打细胞使其进一步离散、然后终止消化，收集细胞悬液，以铜网(200目)过滤，除去细胞团块，以低速离心除去细胞碎片。细胞用PBS洗1～2次，按1×106细胞/mL加入溴化乙锭(EB)染液，4℃，30min。上机(FACS 420型 美国)检测，每个样品计数10 000个细胞，采用计算机系统进行分析。
, 百拇医药
五、实验设计分组
(一)实验时使用的细胞为培养的原代细胞。每个样品的细胞数为1×106 。(二)待培养皿细胞80%融合，实验时培养液改为无血清培养液，同时加入LPS刺激，LPS作用时间为24 h。(三)LPS处理组：分为：1 μg/mL、10 μg/mL、100 μg/mL 3组。对照组：采用等量无菌生理盐水加入培养基中作为对照。
六、统计分析
全部数据都以均数±标准差(
±s)表示，采用直线相关分析和t检验。结 果
一、人脐静脉内皮细胞体外培养的建立
采用胰蛋白酶消化法建立HUVEC体外培养，细胞于塑料培养皿中生长较快，一般过夜后大部分细胞即贴壁并生长，开始细胞呈梭形，连接呈片后显现内皮细胞形状，呈铺路石样，台盼蓝染色细胞活性在95%以上，经Ⅷ因子相关抗原免疫组化鉴定阳性；细胞纯度在90%以上，符合本实验要求。
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二、培养时间对脂多糖诱导的HUVEC凋亡的影响
由表1可以看出，LPS 10 μg/mL作用HUVEC，随着培养时间的延长，细胞凋亡率不断升高，细胞凋亡率与培养时间呈正相关(r=0.938，P<0.01)。
三、LPS和TNFα诱导HUVEC凋亡的DNA琼脂糖凝胶电泳
LPS 10 μg/mL加入HUVEC培养24 h，DNA电泳均可见典型的“梯状”带，而对照组无上述类似变化(图1)。
四、LPS诱导HUVEC凋亡
结果表明，随LPS浓度的增加，HUVEC的凋亡率也明显增加，与对照组相比差异非常显著(P<0.01)。
表1 培养时间对HUVEC凋亡的影响
, http://www.100md.com
Tab 1 Effect of culture time on LPS-induced HUVEC
apoptosis in vitro (
±s, n=4) Culture time(h)Ratio of apoptosis(%)
4
3.3±0.3
8
6.7±0.6
12
13.8±1.1
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24
24.8±2.5
36
26.5±2.7
Fig 1 Electrophoresis of DNA in HUVEC by LPS
A:LPS 10 μg/mL；B：λDNA/EcoR Ⅰ+Hind Ⅲ Marker
图1 HUVEC凋亡的DNA电泳
A：LPS 10μg/mL； B：λDNA/EcoR Ⅰ+Hind Ⅲ 分子量标准
表2 LPS对HUVEC凋亡的影响
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Tab 2 Effect of LPS on HUVEC apoptosis in vitro (
±s，n=4) GroupLPS(μg/mL)
Ratio of apoptosis(%)
LPS
1
6.4±1.1△
10
24.8±2.5△
100
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36.7±3.9△
Control
2.1±0.4
△P<0.01, vs control group讨 论
血管内皮细胞衬覆于血管内壁，构成血管通透性的主要屏障。能合成和分泌调节凝血-纤溶系统的物质、调节血管张力的因子以及细胞因子等在血管形成、创伤愈合及炎症反应中起重要作用[6]。目前，VEC受损已被视为创伤、休克、感染、心血管疾病、肿瘤和急性肺损伤等多种疾病和综合征发生、发展的病理基础[7]。本研究通过建立HUVEC体外培养模型，以LPS刺激，观察其致损伤效应。结果发现，LPS加入细胞培养中，可明显诱导HUVEC凋亡，并随着作用时间的延长和LPS浓度增加，细胞凋亡率也相应增加，一定范围内呈时间、剂量、效应关系。结果提示，在ALI病程中，肺血管内皮细胞的受损，可能部分是以细胞凋亡的方式进行的。由于血管内皮细胞不属于快速自我更新的细胞群体，因此，VEC凋亡后降低了内皮细胞储备[8]，致使血管内皮裂隙增大，通透性增加，导致通透性肺水肿、发生急性呼吸窘迫综合征(ARDS)。
, 百拇医药
LPS诱导VEC凋亡的确切机制至今仍不清楚，分析LPS致VEC凋亡的机制可能与其激活特定的细胞凋亡信号通路有关。研究表明，LPS可激活ICE样蛋白酶-caspase-3，而致VEC凋亡，而caspase-3的特异性抑制剂：Ac-DEVD-CHO可阻断由LPS介导的VEC凋亡。一些研究还表明，LPS诱导VEC凋亡，氧自由基起重要作用[9]。Tseng等[10]构建了含人iNOS cDNA的腺病毒载体，转染动物血管内皮细胞后，结果表明，基因转染后可明显增加VEC的一氧化氮(NO)的合成，并抑制LPS介导的VEC凋亡，说明NO也具有保护血管内皮细胞的功能，提示吸入NO治疗ARDS的疗效可能部分与这种功能的发挥有关。尽管单一细胞类型体外培养不能反应ALI时体内微血管损伤的复杂过程，但可以从一个侧面来认识VEC受损的细胞机制和基因调控；在一定程度上可模仿ALI的临床状态。明确ALI时肺微血管内皮细胞损伤的分子机制，阻断某些基因表达和信号传导可能有效的预防、治疗ALI，降低其病死率。
, 百拇医药 [基金项目] 国家自然科学基金资助(39700056)
[参 考 文 献]
[1] Buchman TG, Abello PA, Smith EH, et al. Induction of heat shock response leads to apoptosis in endothelial cells previously exposed to endotoxin [J]. Am J Physiol,1993,265:H165～H170.
[2] Jaffe EA. Physiologic function of the normal endothelial cell. In:Loscalzo J, Creagher M, Dzau VJ. eds. Vascular Medicine [M]. 1st ed. Boston:Little Brown,1992,3～46.
, http://www.100md.com
[3] Martin MA, Silverman HJ. Gram-negative sepsis and the adult respiratory distress syndrome [J]. Clin Infect Dis,1992,14:1313～1328.
[4] 安 静，黎 鳌，杨宗城，等.胎儿脐静脉内皮细胞的培养 [J].第三军医大学学报，1990，12：222～224.
[5] 左连富，主编.流式细胞术与生物医学.第1版.辽宁科学技术出版社,1996.371～374.
[6] Vane JR, Anggard EE, Botting RM. Regulatory functions of the vascular endothelium [J]. N Engl J Med,1990,323:27～36.
, 百拇医药
[7] Sessler CN, Bloomfield GL, Fowler Ⅲ AA. Current concepts of sepsis and acute lung injury [J]. Clin Chest Med,1996,17:213～235.
[8] Eissner G, Kohlhuber F, Grell M, et al. Critical involvement of transmembrane tumor necrosis factor-α in endothelial programmed cell death mediated by ionizing radiation and bacterial endotoxin [J]. Blood,1995,85:4184～4193.
[9] Nicholson DW, Ali A, Thoronberry NA, et al. Identification and inhibition of the ICE/CED-3 protease necessary for mammalian apoptosis [J]. Nature,1995,376:37～43.
[10] Tzeng E, Kim YM, Pitt BR, et al. Adenviral transfer of the inducible nitric oxide synthase gene blocks endothelial cell apoptosis [J]. Surgery,1997,122:255～263.
[收稿日期] 1998-11-17 [修回日期] 1999-04-26
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