蝎毒抗癌多肽对肝肿瘤的抑制作用研究
作者：董伟华 韩雪飞 魏玲 孔天翰
单位：(河南医科大学生物毒素中心，河南 郑州 450052)
关键词：蝎毒液类；肝肿瘤；抗肿瘤药
中国病理生理杂志000208
[摘 要] 目的：观察蝎毒抗癌多肽(APBMV)对肝肿瘤的抑制作用。方法：噻唑蓝(MTT)法、台盼蓝拒染法、集落形成以及H22荷瘤小鼠模型。结果：APBMV导致SMMC-7721细胞代谢MTT的能力显著低于对照组，APBMV的IC50为11.33 μg/mL；APBMV能显著抑制该细胞的生长，剂量-效应关系明显，其IC50分别为15.87μg/mL、13.05 μg/mL和8.70 μg/mL；当APBMV的浓度>8 μg/mL时，SMMC-7721细胞的集落形成率显著低于对照组。APBMV能明显抑制H22带瘤小鼠肿瘤的生长，生长抑制率达37.31%(P<0.01)，H22带瘤小鼠外周血白细胞计数和脾脏指数无明显变化或略高于对照组，而5-Fu治疗组H22带瘤小鼠白细胞计数和脾脏指数均明显下降(P<0.01)。结论：APBMV是存在于东亚钳蝎蝎毒中的一种有效低毒的抗肿瘤成分，能够抑制SMMC-7721和H22两种肝癌细胞的生长。
, http://www.100md.com
[中图分类号] R735.7 [文献标识码] A
[文章编号] 1000-4718(2000)02-0123-05
Inhibitive effect of antineoplastic polypeptide from Buthus Martensii Venom on liver neoplasms
DONG Wei-hua, HAN Xue-fei, WEI Ling, KONG Tian-han
(Center of Venom and Biological Toxins, Henan Medical University, Zhengzhou 450052, China)
Abstract AIM: To observe the growth inhibiting effect of antineoplastic polypeptide from Buthus Martensii venom(APBMV)on liver neoplasm. METHODS: MTT calorimetric method, trypin blue exclusion,colony formation and H22-bearing mouse model. RESULTS: The ability to metabolize MTT of SMMC-7721 cells was lower than control distinctly after the cells were treated by APBMV. The IC50 of APBMV was 11.3 μg/mL. The growth of SMMC-7721 cells was inhibited obviously by APBMV and the dose-response relationship was clear, the IC50 were 15.87 μg/mL,13.05 μg/mL and 8.70 μg/mL respectively. The colony formation rate of SMMC-7721 cells was also decreased evidently compared with control when treated concentrations of APBMV were higher than 8 μg/mL. Tumor growth of H22-bearing mice was inhibited by APBMV evidently, the growth inhibiting rate was reached 37.31%(P<0.01). After treatment by APBMV, white blood cell(WBC) number and spleen index of H22-bearing mice were not changed markedly or slightly higher than control group. In 5-fluorouracil treated group,WBC number and spleen index of H22 bearing mice were all reduced distinctly(P<0.01). CONCLUSION: APBMV was one kind of effective and low toxicity antineoplastic components in the venom of Buthus martensii scorpion. It possesses growth inhibiting ability on SMMC-7721 and H22 hepatoma cells.
, 百拇医药
MeSH Scorpion venoms; Liver neoplasms; Antineoplastic agents
近年来，生物毒素对肿瘤细胞作用的研究日益增多。笔者于近10余年对东亚钳蝎蝎毒[1]以及其初分组份[2]进行了研究，结果表明东亚钳蝎蝎毒和其分离组分对数种人肿瘤细胞(Eca109、Hep-2、C 1184、CNE-2Z等)有抑制作用；最近，其它研究者对蝎毒的研究结果[3]亦一致。笔者将从蝎毒中分离出的抗肿瘤有效成分命名为蝎毒抗癌多肽(antineoplastic polypeptide from Buthus Martensii Veonm, APBMV)。本研究主要观察APBMV对肝肿瘤的抑制作用。
材 料 和 方 法
一、材料
, 百拇医药 (一)细胞株 人肝癌细胞株SMMC-7721和小鼠肝癌细胞株H22。
(二)动物 昆明种小鼠，雄性，6～8周龄，(20±2)g，河南省实验动物中心提供。
(三)APBMV和对照药品 APBMV系从河南东亚钳蝎蝎毒中分离。采用本实验室的常规方法进行分离，HPLC法分析监测分离效果,经冷冻干燥后-20℃保存，临用前用生理盐水配制成所需浓度。对照药品选择常用的化疗药物丝裂霉素(mitomycin C, MMC)和5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-Fu)。
二、方法
(一)细胞培养和传代 SMMC-7721细胞培养于RPMI 1640完全培养体系中，按本实验室的常规方法[2]传代培养。无菌条件下，抽取第6～7 d生长良好的H22荷瘤小鼠腹水，D-Hanks液洗3次，台盼兰染色镜检活细胞数>98%，用RPMI 1640完全培养液调细胞浓度至1×105/mL，接种于无菌96孔板，每孔100 μL。
, 百拇医药
(二)H22带瘤动物的移植和接种[4] 取传代6～7 d的H22带瘤小鼠，无菌抽取乳白色腹水，0.2%台盼蓝染色镜检活细胞>98%，无菌生理盐水稀释成1.5×107细胞/mL的悬液，每只小鼠右侧腋部皮下接种0.2 mL。
(三)实验分组 实验分为APBMV处理组、阳性对照组和空白对照组(control)。APBMV处理SMMC-7721细胞时选用4个浓度(4.0 μg/mL，8.0 μg/mL,12 μg/mL,16 μg/mL)，MMC(0.25 μg/mL)为阳性对照；处理H22细胞时，APBMV选用3个浓度(0.03 μg/mL，0.06 μg/mL和0.09 μg/mL)，阳性对照选用5-Fu(10 μg/mL)。小鼠接种H22细胞24 h后，随机分为APBMV处理组、阳性对照组和空白对照组；阳性对照组选用5-Fu(20 mg/kg)[4]；APBMV的给药剂量参照LD50并经预实验确定为0.03 mg/kg，0.04 mg/kg和0.06 mg/kg；空白对照组给予等体积生理盐水。
, http://www.100md.com
(四)实验方法
1.细胞毒性实验 采用噻唑蓝法[1]。APBMV和阳性对照药物分别处理2种肝癌细胞48 h。
2.细胞生长抑制实验 采用台盼蓝拒染法[1]。观察APBMV处理SMMC-7721细胞24 h、48 h和96 h后活细胞数变化，计算生长抑制率(growth inhibiting rate, GIR%)和半数抑制浓度(IC50)。
3.克隆形成实验 按本实验室的常规方法[5]。
4.H22带瘤小鼠的抑瘤实验[4] 接种H2224 h后的带瘤小鼠按以上分组分别给予相应的药物和剂量腹腔注射，每 d 1次，连续给药10 d。末次给药后次日处死小鼠，剥离瘤块，称瘤重，计算肿瘤生长抑制率(%)(=对照组平均瘤重-治疗组平均瘤重/对照组平均瘤重×100)，实验重复3次。进行第三批实验时, 测定带瘤小鼠外周血白细胞数及脾重指数(spleen index, SI)：SI=脾脏重量(mg)/体重(g)(结果以mg/10 g体重表示)。
, http://www.100md.com
三、统计学处理
细胞学实验采用F,q和χ2检验，并做剂量效应和时间效应的直线回归和相关分析(相关系数用t检验)；对数机率单位法求IC50；动物实验采用两均数比较的t检验。
结 果
一、APBMV对肝癌细胞的毒性作用
APBMV处理SMMC-7721和H22细胞48 h后，细胞代谢MTT能力下降，细胞毒性明显(见表1和表2)。处理SMMC-7721时剂量效应关系显著，相关系数r=0.9863(P<0.02)，APBMV的IC50为11.33 μg/mL；APBMV处理H22细胞以0.06 μg/mL时细胞毒性最强，剂量效应关系不明显(P>0.05)。
, 百拇医药
二、APBMV对SMMC-7721细胞的生长抑制作用
经APBMV处理24 h、48 h和96 h后，SMMC-7721的生长明显抑制(表3)，其抑制效应与APBMV剂量有良好的相关关系，剂量与效应的相关系数在24 h、48 h和96 h时分别为r=0.9899、r=0.9808和r=0.9997(P<0.02、P<0.01)，其IC50分别为15.87 μg/mL、13.05 μg/mL和8.70 μg/mL；SMMC-7721细胞的生长抑制效应亦随APBMV作用时间的延长而增强。
三、APBMV对SMMC-7721细胞集落形成的抑制作用
APBMV浓度8 μg/mL时，SMMC-7721细胞的集落形成能力、集落形成率(colony formation rate, CFR)均明显低于对照组，GIR随APBMV的剂量增大而升高(表4)，有明显的剂量效应关系(r=0.9905，P<0.01)，IC50为10.83 μg/mL。
, http://www.100md.com
表1 APBMV对SMMC-7721细胞毒性作用(处理细胞48 h)
Tab 1 The cytotoxic effect of APBMV on SMMC-7721 cells
treated by 48 h (
±s) Group
Dose(μg/mL)
OD
IR(%)
Control
0
0.658±0.013
, http://www.100md.com
0
MMC
0.25
0.208±0.017
68.39*
APBMV
4
0.583±0.010
11.40
8
0.498±0.021
24.32*
, 百拇医药
12
0.298±0.017
54.71*
16
0.205±0.022
68.84*
*P<0.01,vs control；IR＝inhibiting rate表2 APBMV对H22细胞的毒性作用(处理细胞48 h)
Tab 2 The cytotoxic effect of APBMV on H22 cells
treated by 48 h (±s) Group
, 百拇医药
Dose(μg/mL)
OD
IR(%)
Control
0
0.970±0.018
5-Fu
10
0.435±0.033
55.15*
APBMV
0.03
, 百拇医药
0.783±0.025
19.28*
0.06
0.680±0.018
29.90*
0.09
0.775±0.006
20.10*
*P<0.01， vs control表3 APBMV对SMMC-7721细胞的生长抑制作用
Tab 3 The growth inhibiting effect of APBMV on SMMC-7721 cells (±s) Group
, http://www.100md.com
Dose
(μg/mL)
Cell number×104/mL
GIR(%)
24 h
48 h
96 h
24 h
48 h
96 h
Control
0
, 百拇医药
4.88±0.52
6.70±0.79
17.10±1.92
0
0
0
MMC
0.25
2.43±0.43
2.40±0.60
1.67±0.64
50.20**
, 百拇医药
64.18**
90.23**
APBMV
4
4.51±0.66
6.09±0.77
14.79±1.26
7.58
9.10
13.51*
8
3.79±0.40
, 百拇医药
5.57±0.47
10.68±1.32
22.34**
16.87**
37.54**
12
3.28±0.56
3.74±0.39
6.46±0.97
32.79**
44.18**
, 百拇医药
62.22**
16
2.23±0.41
2.40±0.69
1.87±0.77
54.30**
64.18**
89.06**
*P<0.05, **P<0.01, vs control表4 APBMV对SMMC-7721细胞集落形成的抑制作用
Tab 4 The colony-formation inhibiting effect of
, http://www.100md.com
APBMV on SMMC-7721 cells Group
Dose
(μg/mL)
Colony number
/600 cells
GFR(%)
Control
0
123.80
0
MMC
0.25
, http://www.100md.com
25.50
79.40*
APBMV
4
101.00
18.42
8
87.75
29.12*
12
61.50
50.32*
, 百拇医药
16
36.00
70.92*
*P<0.01,vs control
四、APBMV对H22实体瘤的疗效
实验结果见表5。第一次实验中APBMV三个剂量组的瘤重均比对照组降低，但以APBMV 0.06 mg/kg组瘤重降低最明显，与对照组比较差异非常明显(P<0.01)，随APBMV的剂量增高，对H22的疗效未见增高，这与体外实验结果一致。调整APBMV浓度为0.03 mg/kg、0.04 mg/kg和0.06 mg/kg,重复实验2次的结果均表明，APBMV在该剂量范围内，对H22有明显疗效(P<0.01)。
, 百拇医药 五、APBMV对H22带瘤小鼠白细胞计数和脾脏指数的影响
经APBMV治疗后，带瘤小鼠外周血白细胞数与对照组相比无明显变化，5-Fu治疗组带瘤小鼠的外周血白细胞数显著下降，与对照组及APBMV各剂量组比较均有显著差异(P<0.01)(见表6)；脾脏指数亦以5-Fu治疗组为最低，APBMV治疗组脾脏指数比对照组略有升高，但无明显差异(P>0.05),但与5-Fu组相比差异非常明显(P<0.01)(见表6)。
表5 APBMV对小鼠肝癌H22实体瘤的生长抑制作用
Tab 5 The growth-inhibiting effect of APBMV on hepatoma of H22 bearing mice (±s)
, 百拇医药
Group
Dose(mg/kg*d-1)
Body weight changes(g)
Tumor weight (g)
IR(%)
1
Control
0
+7.12
1.27±0.29
0
5-Fu
, 百拇医药
20
-0.30
0.69±0.41
45.67*
APBMV
0.06
+5.90
0.90±0.24
29.13*
0.12
+7.00
1.07±0.53
, http://www.100md.com
15.75
0.24
+6.86
1.24±0.49
2.36
2
Control
0
+8.51
1.21±0.25
0
5-Fu
20
, 百拇医药
+0.11
0.54±0.17
55.37*
APBMV
0.03
+8.31
0.84±0.21
30.58*
0.04
+8.82
0.78±0.20
35.54*
, 百拇医药
0.06
+7.68
0.77±0.22
36.36*
3
Control
0
+7.61
1.34±0.31
0
5-Fu
20
-1.30
, 百拇医药
0.60±0.20
55.22*
APBMV
0.03
+6.50
0.90±0.17
32.84*
0.04
+7.86
0.80±0.20
40.30*
0.06
, 百拇医药
+10.06
0.84±0.12
37.31*
*P<0.01,vs control表6 APBMV对H22带瘤小鼠白细胞计数和脾重指数的影响
Tab 6 Influence of APBMV on WBC counts and spleen index of
H22-carrying mice (±s) Group
Dose
(mg/kg)
, 百拇医药
n
WBC
(×109/L)
Spleen index
(mg/10 g body weight)
Control
0
25
8.40±1.09
63.86±16.19
5-Fu
20
, 百拇医药
10
3.50±1.46*
41.36±8.12*
APBMV
0.03
10
8.63±1.57△
69.03±11.46△
0.04
10
9.12±1.14△
, http://www.100md.com
73.43±26.51△
0.06
10
8.37±1.87△
70.72±16.69△
*P<0.01, vs control; △P<0.01, vs 5-Fu讨 论
本研究组在近十年的时间里对东亚钳蝎粗毒[1]和其分离组分[2、5]分别进行了抗肿瘤作用的实验观察，证实东亚钳蝎粗毒和其分离组分对数种人肿瘤细胞均有抑制作用。本实验选用人和鼠的2种肝癌细胞株(SMMC-7721和H22)，观察APBMV对它们生长的抑制作用以及体内的抑瘤作用。实验结果表明APBMV处理SMMC-7721细胞后，细胞的生存性(viability)和生长(growth)能力均受到影响，表现为活细胞减少，代谢MTT的能力降低，细胞的生长受到抑制，克隆形成能力下降。APBMV的作用与其浓度和作用时间均有明显的依赖关系，这与以前的研究结果[1，2，5]基本一致。进一步说明APBMV是存在于蝎毒中的抗肿瘤有效成分。细胞学和动物实验的结果均表明，APBMV仅在一定的浓度范围内对H22肿瘤细胞和H22带瘤小鼠的肿瘤具有抑制作用和治疗作用。APBMV对SMMC-7721和H22 2种肝癌细胞的作用有所差异。
, 百拇医药
蝎毒可以抑制恶性转化鸡胚成纤维细胞膜K+通道，影响细胞内的游离钙水平[7]；作为细胞分裂信使的钙离子水平下降，可以导致人黑色素瘤细胞增殖受到抑制[8]。APBMV可以引起人鼻咽癌(CNE-2Z)细胞膜钾电位降低，使CNE-2Z细胞周期阻滞于G1期(待发表)。APBMV对不同肿瘤细胞的不同作用方式及其抗肿瘤作用机制正在进一步研究之中。
全蝎是中国传统医学中用于治疗肿瘤的一味重要药物，目前认为蝎毒是全蝎发挥药理作用的重要成分。蝎毒的成分复杂，应用时毒副作用大[9]。5-Fu治疗恶性肿瘤的过程中，最主要的毒性为骨髓抑制作用，表现为白细胞、血小板减少和贫血。我们从蝎毒中分离得到的抗肿瘤有效成分APBMV经实验治疗小鼠肝癌H22后，带瘤小鼠外周血白细胞计数和脾脏指数均比5-Fu治疗组明显升高，APBMV在抑制肝癌H22的同时，没有出现骨髓抑制等毒副作用。APBMV很可能是蝎毒中的一种有效、低毒的抗肿瘤成分。
, 百拇医药
[基金项目] 河南省计委“九五”攻关重点课题
[参 考 文 献]
[1] 董伟华，孔天翰，郑智敏,等.河南马氏钳蝎粗毒对体外培养的食管癌细胞株(Eca109)的毒性[J].中国病理生理杂志，1992,8(1):25～28.
[2] 董伟华，臧梦维，孔天翰,等.河南马氏钳蝎蝎毒对Eca109细胞的杀伤及生长抑制作用[J].中国病理生理杂志，1995,11(3):251～255.
[3] 高春芳，吴保平，李东辉.东亚钳蝎毒对大鼠实验性结肠癌的抑制作用[J].前卫医药杂志,1996,13(3):141～144.
[4] 韩 锐.动物移植性肿瘤的体内实验法[M].见:韩锐主编.抗癌药物研究与实验技术.第1版.北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1997.295～298.
, 百拇医药
[5] 臧梦维，董伟华，孔天翰,等.马氏钳蝎毒分离组分Ⅲ体外抗癌活性的实验研究[J].中国病理生理杂志，1996,12(1):72～77.
[6] 孔天翰，董伟华，田中岭.全蝎及蝎毒抗肿瘤研究进展[J].河南肿瘤学杂志,1994,(3):244～247.
[7] Repp H, Draheim H, Ruland J, et al. Profound differences in potassium current properties of normal and Rous Sarcoma virus-transformed chicken embryo fibroblasts [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1993,90(8):3403～3407.
[8] Lepple Wienhues A, Berweck S, Bohmig M, et al. K+ channels and the intracellular calcium signal in human melanoma cell proliferation [J]. J Membr Biol, 1996, 151(2):149～153.
[9] 董伟华,孔天翰.蝎毒毒、副作用及其治疗原则[M].见:孔天翰主编.蝎与蝎毒.第1版.郑州：河南科学技术出版社，1995.386～398.
[收稿日期]1998-11-09 [修回日期]1999-06-03, http://www.100md.com
单位：(河南医科大学生物毒素中心，河南 郑州 450052)
关键词：蝎毒液类；肝肿瘤；抗肿瘤药
中国病理生理杂志000208
[摘 要] 目的：观察蝎毒抗癌多肽(APBMV)对肝肿瘤的抑制作用。方法：噻唑蓝(MTT)法、台盼蓝拒染法、集落形成以及H22荷瘤小鼠模型。结果：APBMV导致SMMC-7721细胞代谢MTT的能力显著低于对照组，APBMV的IC50为11.33 μg/mL；APBMV能显著抑制该细胞的生长，剂量-效应关系明显，其IC50分别为15.87μg/mL、13.05 μg/mL和8.70 μg/mL；当APBMV的浓度>8 μg/mL时，SMMC-7721细胞的集落形成率显著低于对照组。APBMV能明显抑制H22带瘤小鼠肿瘤的生长，生长抑制率达37.31%(P<0.01)，H22带瘤小鼠外周血白细胞计数和脾脏指数无明显变化或略高于对照组，而5-Fu治疗组H22带瘤小鼠白细胞计数和脾脏指数均明显下降(P<0.01)。结论：APBMV是存在于东亚钳蝎蝎毒中的一种有效低毒的抗肿瘤成分，能够抑制SMMC-7721和H22两种肝癌细胞的生长。
, http://www.100md.com
[中图分类号] R735.7 [文献标识码] A
[文章编号] 1000-4718(2000)02-0123-05
Inhibitive effect of antineoplastic polypeptide from Buthus Martensii Venom on liver neoplasms
DONG Wei-hua, HAN Xue-fei, WEI Ling, KONG Tian-han
(Center of Venom and Biological Toxins, Henan Medical University, Zhengzhou 450052, China)
Abstract AIM: To observe the growth inhibiting effect of antineoplastic polypeptide from Buthus Martensii venom(APBMV)on liver neoplasm. METHODS: MTT calorimetric method, trypin blue exclusion,colony formation and H22-bearing mouse model. RESULTS: The ability to metabolize MTT of SMMC-7721 cells was lower than control distinctly after the cells were treated by APBMV. The IC50 of APBMV was 11.3 μg/mL. The growth of SMMC-7721 cells was inhibited obviously by APBMV and the dose-response relationship was clear, the IC50 were 15.87 μg/mL,13.05 μg/mL and 8.70 μg/mL respectively. The colony formation rate of SMMC-7721 cells was also decreased evidently compared with control when treated concentrations of APBMV were higher than 8 μg/mL. Tumor growth of H22-bearing mice was inhibited by APBMV evidently, the growth inhibiting rate was reached 37.31%(P<0.01). After treatment by APBMV, white blood cell(WBC) number and spleen index of H22-bearing mice were not changed markedly or slightly higher than control group. In 5-fluorouracil treated group,WBC number and spleen index of H22 bearing mice were all reduced distinctly(P<0.01). CONCLUSION: APBMV was one kind of effective and low toxicity antineoplastic components in the venom of Buthus martensii scorpion. It possesses growth inhibiting ability on SMMC-7721 and H22 hepatoma cells.
, 百拇医药
MeSH Scorpion venoms; Liver neoplasms; Antineoplastic agents
近年来，生物毒素对肿瘤细胞作用的研究日益增多。笔者于近10余年对东亚钳蝎蝎毒[1]以及其初分组份[2]进行了研究，结果表明东亚钳蝎蝎毒和其分离组分对数种人肿瘤细胞(Eca109、Hep-2、C 1184、CNE-2Z等)有抑制作用；最近，其它研究者对蝎毒的研究结果[3]亦一致。笔者将从蝎毒中分离出的抗肿瘤有效成分命名为蝎毒抗癌多肽(antineoplastic polypeptide from Buthus Martensii Veonm, APBMV)。本研究主要观察APBMV对肝肿瘤的抑制作用。
材 料 和 方 法
一、材料
, 百拇医药 (一)细胞株 人肝癌细胞株SMMC-7721和小鼠肝癌细胞株H22。
(二)动物 昆明种小鼠，雄性，6～8周龄，(20±2)g，河南省实验动物中心提供。
(三)APBMV和对照药品 APBMV系从河南东亚钳蝎蝎毒中分离。采用本实验室的常规方法进行分离，HPLC法分析监测分离效果,经冷冻干燥后-20℃保存，临用前用生理盐水配制成所需浓度。对照药品选择常用的化疗药物丝裂霉素(mitomycin C, MMC)和5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-Fu)。
二、方法
(一)细胞培养和传代 SMMC-7721细胞培养于RPMI 1640完全培养体系中，按本实验室的常规方法[2]传代培养。无菌条件下，抽取第6～7 d生长良好的H22荷瘤小鼠腹水，D-Hanks液洗3次，台盼兰染色镜检活细胞数>98%，用RPMI 1640完全培养液调细胞浓度至1×105/mL，接种于无菌96孔板，每孔100 μL。
, 百拇医药
(二)H22带瘤动物的移植和接种[4] 取传代6～7 d的H22带瘤小鼠，无菌抽取乳白色腹水，0.2%台盼蓝染色镜检活细胞>98%，无菌生理盐水稀释成1.5×107细胞/mL的悬液，每只小鼠右侧腋部皮下接种0.2 mL。
(三)实验分组 实验分为APBMV处理组、阳性对照组和空白对照组(control)。APBMV处理SMMC-7721细胞时选用4个浓度(4.0 μg/mL，8.0 μg/mL,12 μg/mL,16 μg/mL)，MMC(0.25 μg/mL)为阳性对照；处理H22细胞时，APBMV选用3个浓度(0.03 μg/mL，0.06 μg/mL和0.09 μg/mL)，阳性对照选用5-Fu(10 μg/mL)。小鼠接种H22细胞24 h后，随机分为APBMV处理组、阳性对照组和空白对照组；阳性对照组选用5-Fu(20 mg/kg)[4]；APBMV的给药剂量参照LD50并经预实验确定为0.03 mg/kg，0.04 mg/kg和0.06 mg/kg；空白对照组给予等体积生理盐水。
, http://www.100md.com
(四)实验方法
1.细胞毒性实验 采用噻唑蓝法[1]。APBMV和阳性对照药物分别处理2种肝癌细胞48 h。
2.细胞生长抑制实验 采用台盼蓝拒染法[1]。观察APBMV处理SMMC-7721细胞24 h、48 h和96 h后活细胞数变化，计算生长抑制率(growth inhibiting rate, GIR%)和半数抑制浓度(IC50)。
3.克隆形成实验 按本实验室的常规方法[5]。
4.H22带瘤小鼠的抑瘤实验[4] 接种H2224 h后的带瘤小鼠按以上分组分别给予相应的药物和剂量腹腔注射，每 d 1次，连续给药10 d。末次给药后次日处死小鼠，剥离瘤块，称瘤重，计算肿瘤生长抑制率(%)(=对照组平均瘤重-治疗组平均瘤重/对照组平均瘤重×100)，实验重复3次。进行第三批实验时, 测定带瘤小鼠外周血白细胞数及脾重指数(spleen index, SI)：SI=脾脏重量(mg)/体重(g)(结果以mg/10 g体重表示)。
, http://www.100md.com
三、统计学处理
细胞学实验采用F,q和χ2检验，并做剂量效应和时间效应的直线回归和相关分析(相关系数用t检验)；对数机率单位法求IC50；动物实验采用两均数比较的t检验。
结 果
一、APBMV对肝癌细胞的毒性作用
APBMV处理SMMC-7721和H22细胞48 h后，细胞代谢MTT能力下降，细胞毒性明显(见表1和表2)。处理SMMC-7721时剂量效应关系显著，相关系数r=0.9863(P<0.02)，APBMV的IC50为11.33 μg/mL；APBMV处理H22细胞以0.06 μg/mL时细胞毒性最强，剂量效应关系不明显(P>0.05)。
, 百拇医药
二、APBMV对SMMC-7721细胞的生长抑制作用
经APBMV处理24 h、48 h和96 h后，SMMC-7721的生长明显抑制(表3)，其抑制效应与APBMV剂量有良好的相关关系，剂量与效应的相关系数在24 h、48 h和96 h时分别为r=0.9899、r=0.9808和r=0.9997(P<0.02、P<0.01)，其IC50分别为15.87 μg/mL、13.05 μg/mL和8.70 μg/mL；SMMC-7721细胞的生长抑制效应亦随APBMV作用时间的延长而增强。
三、APBMV对SMMC-7721细胞集落形成的抑制作用
APBMV浓度8 μg/mL时，SMMC-7721细胞的集落形成能力、集落形成率(colony formation rate, CFR)均明显低于对照组，GIR随APBMV的剂量增大而升高(表4)，有明显的剂量效应关系(r=0.9905，P<0.01)，IC50为10.83 μg/mL。
, http://www.100md.com
表1 APBMV对SMMC-7721细胞毒性作用(处理细胞48 h)
Tab 1 The cytotoxic effect of APBMV on SMMC-7721 cells
treated by 48 h (
±s) GroupDose(μg/mL)
OD
IR(%)
Control
0
0.658±0.013
, http://www.100md.com
0
MMC
0.25
0.208±0.017
68.39*
APBMV
4
0.583±0.010
11.40
8
0.498±0.021
24.32*
, 百拇医药
12
0.298±0.017
54.71*
16
0.205±0.022
68.84*
*P<0.01,vs control；IR＝inhibiting rate表2 APBMV对H22细胞的毒性作用(处理细胞48 h)
Tab 2 The cytotoxic effect of APBMV on H22 cells
treated by 48 h (
±s) Group, 百拇医药
Dose(μg/mL)
OD
IR(%)
Control
0
0.970±0.018
5-Fu
10
0.435±0.033
55.15*
APBMV
0.03
, 百拇医药
0.783±0.025
19.28*
0.06
0.680±0.018
29.90*
0.09
0.775±0.006
20.10*
*P<0.01， vs control表3 APBMV对SMMC-7721细胞的生长抑制作用
Tab 3 The growth inhibiting effect of APBMV on SMMC-7721 cells (
±s) Group, http://www.100md.com
Dose
(μg/mL)
Cell number×104/mL
GIR(%)
24 h
48 h
96 h
24 h
48 h
96 h
Control
0
, 百拇医药
4.88±0.52
6.70±0.79
17.10±1.92
0
0
0
MMC
0.25
2.43±0.43
2.40±0.60
1.67±0.64
50.20**
, 百拇医药
64.18**
90.23**
APBMV
4
4.51±0.66
6.09±0.77
14.79±1.26
7.58
9.10
13.51*
8
3.79±0.40
, 百拇医药
5.57±0.47
10.68±1.32
22.34**
16.87**
37.54**
12
3.28±0.56
3.74±0.39
6.46±0.97
32.79**
44.18**
, 百拇医药
62.22**
16
2.23±0.41
2.40±0.69
1.87±0.77
54.30**
64.18**
89.06**
*P<0.05, **P<0.01, vs control表4 APBMV对SMMC-7721细胞集落形成的抑制作用
Tab 4 The colony-formation inhibiting effect of
, http://www.100md.com
APBMV on SMMC-7721 cells Group
Dose
(μg/mL)
Colony number
/600 cells
GFR(%)
Control
0
123.80
0
MMC
0.25
, http://www.100md.com
25.50
79.40*
APBMV
4
101.00
18.42
8
87.75
29.12*
12
61.50
50.32*
, 百拇医药
16
36.00
70.92*
*P<0.01,vs control
四、APBMV对H22实体瘤的疗效
实验结果见表5。第一次实验中APBMV三个剂量组的瘤重均比对照组降低，但以APBMV 0.06 mg/kg组瘤重降低最明显，与对照组比较差异非常明显(P<0.01)，随APBMV的剂量增高，对H22的疗效未见增高，这与体外实验结果一致。调整APBMV浓度为0.03 mg/kg、0.04 mg/kg和0.06 mg/kg,重复实验2次的结果均表明，APBMV在该剂量范围内，对H22有明显疗效(P<0.01)。
, 百拇医药 五、APBMV对H22带瘤小鼠白细胞计数和脾脏指数的影响
经APBMV治疗后，带瘤小鼠外周血白细胞数与对照组相比无明显变化，5-Fu治疗组带瘤小鼠的外周血白细胞数显著下降，与对照组及APBMV各剂量组比较均有显著差异(P<0.01)(见表6)；脾脏指数亦以5-Fu治疗组为最低，APBMV治疗组脾脏指数比对照组略有升高，但无明显差异(P>0.05),但与5-Fu组相比差异非常明显(P<0.01)(见表6)。
表5 APBMV对小鼠肝癌H22实体瘤的生长抑制作用
Tab 5 The growth-inhibiting effect of APBMV on hepatoma of H22 bearing mice (
±s), 百拇医药
Group
Dose(mg/kg*d-1)
Body weight changes(g)
Tumor weight (g)
IR(%)
1
Control
0
+7.12
1.27±0.29
0
5-Fu
, 百拇医药
20
-0.30
0.69±0.41
45.67*
APBMV
0.06
+5.90
0.90±0.24
29.13*
0.12
+7.00
1.07±0.53
, http://www.100md.com
15.75
0.24
+6.86
1.24±0.49
2.36
2
Control
0
+8.51
1.21±0.25
0
5-Fu
20
, 百拇医药
+0.11
0.54±0.17
55.37*
APBMV
0.03
+8.31
0.84±0.21
30.58*
0.04
+8.82
0.78±0.20
35.54*
, 百拇医药
0.06
+7.68
0.77±0.22
36.36*
3
Control
0
+7.61
1.34±0.31
0
5-Fu
20
-1.30
, 百拇医药
0.60±0.20
55.22*
APBMV
0.03
+6.50
0.90±0.17
32.84*
0.04
+7.86
0.80±0.20
40.30*
0.06
, 百拇医药
+10.06
0.84±0.12
37.31*
*P<0.01,vs control表6 APBMV对H22带瘤小鼠白细胞计数和脾重指数的影响
Tab 6 Influence of APBMV on WBC counts and spleen index of
H22-carrying mice (
±s) GroupDose
(mg/kg)
, 百拇医药
n
WBC
(×109/L)
Spleen index
(mg/10 g body weight)
Control
0
25
8.40±1.09
63.86±16.19
5-Fu
20
, 百拇医药
10
3.50±1.46*
41.36±8.12*
APBMV
0.03
10
8.63±1.57△
69.03±11.46△
0.04
10
9.12±1.14△
, http://www.100md.com
73.43±26.51△
0.06
10
8.37±1.87△
70.72±16.69△
*P<0.01, vs control; △P<0.01, vs 5-Fu讨 论
本研究组在近十年的时间里对东亚钳蝎粗毒[1]和其分离组分[2、5]分别进行了抗肿瘤作用的实验观察，证实东亚钳蝎粗毒和其分离组分对数种人肿瘤细胞均有抑制作用。本实验选用人和鼠的2种肝癌细胞株(SMMC-7721和H22)，观察APBMV对它们生长的抑制作用以及体内的抑瘤作用。实验结果表明APBMV处理SMMC-7721细胞后，细胞的生存性(viability)和生长(growth)能力均受到影响，表现为活细胞减少，代谢MTT的能力降低，细胞的生长受到抑制，克隆形成能力下降。APBMV的作用与其浓度和作用时间均有明显的依赖关系，这与以前的研究结果[1，2，5]基本一致。进一步说明APBMV是存在于蝎毒中的抗肿瘤有效成分。细胞学和动物实验的结果均表明，APBMV仅在一定的浓度范围内对H22肿瘤细胞和H22带瘤小鼠的肿瘤具有抑制作用和治疗作用。APBMV对SMMC-7721和H22 2种肝癌细胞的作用有所差异。
, 百拇医药
蝎毒可以抑制恶性转化鸡胚成纤维细胞膜K+通道，影响细胞内的游离钙水平[7]；作为细胞分裂信使的钙离子水平下降，可以导致人黑色素瘤细胞增殖受到抑制[8]。APBMV可以引起人鼻咽癌(CNE-2Z)细胞膜钾电位降低，使CNE-2Z细胞周期阻滞于G1期(待发表)。APBMV对不同肿瘤细胞的不同作用方式及其抗肿瘤作用机制正在进一步研究之中。
全蝎是中国传统医学中用于治疗肿瘤的一味重要药物，目前认为蝎毒是全蝎发挥药理作用的重要成分。蝎毒的成分复杂，应用时毒副作用大[9]。5-Fu治疗恶性肿瘤的过程中，最主要的毒性为骨髓抑制作用，表现为白细胞、血小板减少和贫血。我们从蝎毒中分离得到的抗肿瘤有效成分APBMV经实验治疗小鼠肝癌H22后，带瘤小鼠外周血白细胞计数和脾脏指数均比5-Fu治疗组明显升高，APBMV在抑制肝癌H22的同时，没有出现骨髓抑制等毒副作用。APBMV很可能是蝎毒中的一种有效、低毒的抗肿瘤成分。
, 百拇医药
[基金项目] 河南省计委“九五”攻关重点课题
[参 考 文 献]
[1] 董伟华，孔天翰，郑智敏,等.河南马氏钳蝎粗毒对体外培养的食管癌细胞株(Eca109)的毒性[J].中国病理生理杂志，1992,8(1):25～28.
[2] 董伟华，臧梦维，孔天翰,等.河南马氏钳蝎蝎毒对Eca109细胞的杀伤及生长抑制作用[J].中国病理生理杂志，1995,11(3):251～255.
[3] 高春芳，吴保平，李东辉.东亚钳蝎毒对大鼠实验性结肠癌的抑制作用[J].前卫医药杂志,1996,13(3):141～144.
[4] 韩 锐.动物移植性肿瘤的体内实验法[M].见:韩锐主编.抗癌药物研究与实验技术.第1版.北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1997.295～298.
, 百拇医药
[5] 臧梦维，董伟华，孔天翰,等.马氏钳蝎毒分离组分Ⅲ体外抗癌活性的实验研究[J].中国病理生理杂志，1996,12(1):72～77.
[6] 孔天翰，董伟华，田中岭.全蝎及蝎毒抗肿瘤研究进展[J].河南肿瘤学杂志,1994,(3):244～247.
[7] Repp H, Draheim H, Ruland J, et al. Profound differences in potassium current properties of normal and Rous Sarcoma virus-transformed chicken embryo fibroblasts [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1993,90(8):3403～3407.
[8] Lepple Wienhues A, Berweck S, Bohmig M, et al. K+ channels and the intracellular calcium signal in human melanoma cell proliferation [J]. J Membr Biol, 1996, 151(2):149～153.
[9] 董伟华,孔天翰.蝎毒毒、副作用及其治疗原则[M].见:孔天翰主编.蝎与蝎毒.第1版.郑州：河南科学技术出版社，1995.386～398.
[收稿日期]1998-11-09 [修回日期]1999-06-03, http://www.100md.com