重症烧伤休克大鼠白细胞表面L-选择素表达的研究
作者：赵智辉 张敏华 陈元 褚健 董文度 刘官成
单位：(第二军医大学南京军医学院病理教研室，江苏 南京 210099)
关键词：休克；白细胞；烧伤
中国病理生理杂志000223
[摘 要] 目的和方法：将32只SD大鼠随机分为正常对照组(n=8)。单纯手术组(n=8)，手术烧伤休克组(n=8)，单纯烧伤组(n=8)。应用流式细胞技术检测淋巴细胞，中性粒细胞及单核细胞表面L-选择素的表达量变化，同时比较观察两手术组动物肠系膜微循环中微静脉内白细胞与内皮细胞粘附数量变化，探讨L-选择素与白细胞-内皮细胞粘附间的关系。结果：与正常对照组相比，其它三组动物术前，烧伤前L-选择素在淋巴细胞，中性粒细胞和单核细胞均无明显差异(P>0.05)，但术后3 h，烧伤后3 h则明显减少(P<0.05)；手术烧伤休克组自身对照(烫伤前与烫伤后3 h)及手术对照组自身对照(开腹前与开腹后3 h)结果显示，L-选择素表达量也减少(P<0.05)；微循环观察结果显示，手术烧伤休克组动物烫伤后随时程延长，附壁滚动及紧密粘附的白细胞数量明显增多，而单纯手术组则无明显变化。结论：烧伤休克及手术创伤均可造成白细胞表面L-选择素数量明显减少，本实验发现重度烧伤使白细胞粘附数量增多，白细胞-内皮细胞粘附力增强，提示烧伤休克时可能有粘附分子(包括L-选择素)功能的增强。
, http://www.100md.com
[中图分类号] R541.6+4 [文献标识码] A
[文章编号]1000-4718(2000)02-0169-03
白细胞同血管内皮细胞间的粘附具有重要的病理意义。研究表明，休克发生过程中，白细胞粘附于细静脉壁数量增多，造成血流阻力增大，微循环缺血，缺氧。另外，血管内皮细胞与白细胞相互反应后还可使白细胞释放各种生物活性物质，导致微循环的进一步紊乱[1，2]。目前，烧伤创伤休克状态下白细胞与内皮细胞粘附的发生及变化机制尚未完全阐明。本实验在原有对L-选择素转录水平表达的研究基础上[3]，应用流式细胞技术，进一步探讨L-选择素在白细胞表面表达变化及与白细胞-内皮细胞粘附之间的关系。
材 料 和 方 法
一、试剂及仪器
, 百拇医药
(一)抗体FITC(fluorescein isothiocyanate)标记仓鼠抗大鼠CD62L单克隆抗体，美国PharMingen公司产品。
(二)FACSort型流式细胞仪，流式细胞仪校正微球(2 micron beads, CaliBRITE beads)，溶血素，美国Becton-Dickinson公司产品。
(三)倒置微循环观察显微镜，监视器，摄像头，徐州光学仪器厂产品。
(四)大鼠肠系膜微循环恒温观察槽，南京铁道医学院病理生理教研室制作。
二、动物分组及休克模型复制
成年健康SD大鼠32只，体重180～220 g，雌雄不限，随机分为4组：(一)正常组(8只)，(二)假手术对照组(8只)，(三)手术烧伤休克组(8只)，(四)单纯烧伤休克组(8只)。肌肉注射25%乌拉坦(0.6 mL/100 g体重)麻醉。一侧颈动脉插管，用于采血及记录血压。两休克组以80℃热水烫伤腰以下肢体30 s(占体表面积35%～40%)造成深Ⅱ度烧伤，复制重症烧伤休克模型。
, http://www.100md.com
三、肠系膜微循环白细胞-内皮细胞粘附观察
假手术对照组，手术烧伤休克组大鼠中腹部沿腹正中线做3 cm切口，开腹后找到盲肠，沿盲肠游离端所指方向轻轻将一段回肠及肠系膜拉出腹外，将肠系膜平铺于恒温观察槽的圆窗上，盖上塑料薄膜(恒温槽内已注满生理盐水并恒温于38℃。于40倍镜下找到清晰的微动脉(直径小于30 μm)和微静脉(直径小于40 μm)，观察微循环，通过摄录像电视系统每半小时记录白细胞流态及与血管内皮细胞粘附数量变化。检测获得图象中选定微血管段60 s内白细胞滚动附壁数量。将附壁不再运动的白细胞定为紧密粘附的白细胞。计算实验时段两端单位面积内皮细胞表面(104 μm2)紧密粘附的白细胞数量，所得数据以±s表示，均数差异显著性用t检验法。
四、流式细胞术检测
(一)血液标本采集 正常组与烧伤组均于颈动脉插管后采血0.4 mL,肝素抗凝(20～25 IU/mL)，第二次采血于烧伤，开腹后3 h，血量0.4 ml,同法抗凝。
, 百拇医药
(二)CD62L免疫荧光标记 取两只塑料管分别标明对照，CD62L。CD62L管加5 μL CD62L-FITC，然后每管加100 μL肝素抗凝血混匀，4℃避光反应30 min,加2 mL溶血素溶血8 min，离心(800 r/min,5 min)，弃去上清液，加2 mL PBS混匀，离心(800 r/min, 5 min)，控干，加1 mL PBS混匀，待测。对照管不加CD62L-FITC，其余步骤相同。
(三)流式细胞术分析
1.流式细胞仪校准 启动Cell Quest软件，用2 micron Beads调整流式细胞仪的荧光检测CV值小于2%。启动FACS Comp软件，用Cali BRIATE Beads自动调整光电倍增管电压。灵敏度，阈值及颜色补偿，使流式细胞仪处于最佳工作状态。
2.淋巴细胞，中性粒细胞，单核细胞表面CD62L表达量分析 启动Cell Quest软件分别测定对照管和测定管的光散射和荧光密度，收集1万个细胞，以对照管的FL1-H为对照，分析测定管的平均荧光密度。对测定结果中的平均荧光密度均值(以
±s表示)采用t检验判定差异显著性。
, 百拇医药
结 果
一、白细胞表面L-选择素表达量变化(表1)
与正常对照组相比，其它3组术前，烧伤前L-选择素在3系细胞均无显著差异(P>0.05)，但在术后及烧伤后3 h(包括单纯烧伤组)L-选择素在3系细胞均显著少于正常对照组(P<0.05)。假手术组术前与术后相比及手术烧伤组术前与术后相比，L-选择素在3系细胞均显著减少(P<0.05)。假手术组术后及手术烧伤组术后与单纯烧伤组相比，L-选择素在3系细胞均无显著差异(P>0.05)。
表1 白细胞表面L-选择素表达量变化
Tab 1 Changes of L-selectin surface expression on leukocytes
Normal
, http://www.100md.com
Burn
Operation
Burn and operation
before
3 h after
before
3 h after
< operation
operation
burn
burn
Lymphocytes
, http://www.100md.com
197.52±42.66
133.30±32.58*
183.11±54.42
135.09±54.61*＃
193.19±63.36
134.94±52.16*△
Granulocytes
300.73±184.97
161.82±86.12*
279.46±84.72
, http://www.100md.com
142.27±32.80*＃
245.08±111.13
123.34±85.21*△
Monocytes
373.60±150.96
276.34±121.49*
404.24±128.68
298.81±168.07*＃
326.71±115.69
255.98±150.18*△
, http://www.100md.com
*P<0.05， vs normal; # P<0.05， vs before operation; △ P<0.05， vs before burn
二、肠系膜微循环中微血管内白细胞与内皮细胞粘附情况变化(图1，图2)
Fig 1 Comparison of rolling adhesion leucocytes between burn (operation) group and operation group±s,n=8,△P<0.05，vs operation group
图1 烧伤休克组与对照组附壁滚动白细胞数目比较
, http://www.100md.com
烧伤后，可见微静脉内附壁滚动的白细胞增多，粘附于壁上的白细胞也见增多，且随着观察时程的延长，附壁滚动的及粘附的白细胞数逐渐增多。微动脉壁上滚动的白细胞极少。在对照组，微静脉内也可见附壁滚动的白细胞，但数量明显比烧伤组少，粘附于壁上的白细胞更少。
Fig 2 Comparison of tight adhesion leucocytes between burn (operation) group and operation group±s,n=8,△P<0.05,vs operation group
图2 烧伤休克组与对照组紧密粘附白细胞数目比较
讨 论
, http://www.100md.com
为明确烧伤休克对白细胞表面L-选择素数量变化的影响，我们将动物分为4组进行实验观察，发现与正常组对比，假手术组术后3 h，手术烧伤组烧伤后3 h及单纯烧伤组烧伤后3 h，3系白细胞L-选择素表面数量均发生明显减少(P<0.05)，表明手术创伤及烧伤休克均可导致白细胞L-选择素表面数量的减少。假手术组，烧伤休克组自身前后对照结果亦显示白细胞L-选择素表面数量明显减少(P<0.05)，同样支持前面的结论。假手术组术后3 h，手术烧伤组烧伤后3 h及单纯烧伤组烧伤后3 h相比，3系白细胞L-选择素表面数量无显著差异(P>0.05)，进一步表明创伤因素，烧伤休克均导致L-选择素数量减少，但两者未显示明显的叠加效应。
根据已有的研究结果，我们推测，创伤，烧伤休克使白细胞表面L-选择素数量减少的机制可能有两个方面，一是在这些因素的影响下，L-选择素从白细胞表面脱落下来(shedding)，并在血浆中以可溶性形成存在[4]，二是L-选择素转录水平表达的下调，使其细胞表面数量不能得到有效补充[3]。
, 百拇医药
在观察肠系膜微循环时我们发现，手术烧伤休克组动物烧伤时程的延长，滚动粘附及紧密粘附于微静脉壁上的白细胞数量逐渐增多，变化显著，而在假手术组则无明显改变，说明严重烧伤休克对白细胞-内皮细胞粘附影响较大，使二者的粘附力增强，而本实验的手术创伤对白细胞-内皮细胞粘附未产生明显的影响。
已知选择素家族的3个成员是介导白细胞与内皮细胞滚动粘附的主要分子。L-选择素只表达在白细胞上，在有一定切应力的情况下，其作用尤为突出[5，6]，本实验结果提示，烧伤休克大鼠白细胞表面L-选择素数量变化与粘附于内皮细胞上的白细胞数量变化呈相反的趋势，白细胞-内皮细胞粘附力增强是否与L-选择素功能(即与配体的结合力)的改变有关，是否与内皮细胞表达的E-选择素，P-选择素的数量及功能变化有关尚待进一步的研究。
白细胞同微血管内皮细胞粘附造成微循环功能障碍是重症休克发生的重要原因已为学术界所公认，如何防止和解除粘附则是研究的热点。我们认为，解决问题的关键是从粘附分子功能调节及受配体结合的角度入手进行更深入的研究。
, 百拇医药
[参 考 文 献]
[1] Zhao KS, Zhu ZG, Woo GY, et al.Effect of naloxane on microcirculatory behevior during irreversible hemorrhagic shock[J]. Microvasc Res, 1987, 34:84～95.
[2] 赵克森.休克微循环中白细胞流变行为的研究[J].微循环杂志，1992，2(3)：40～43.
[3] 赵智辉，赵克森，朱佐江.重度烧伤休克大鼠L-选择素转录水平表达的研究[J].中国病理生理杂志，1998，14(1)：43～46.
[4] Oda T, Katori M, Hatanaka K, et al. Five steps in leucocyte extravasation in the microcirculation by chemoattractans[J]. Mediators in the Inflammation， 1992, 1:403～409.
, 百拇医药
[5] Kansas GS. Structure and function of L-selectin[J]. AMPIS, 1992, 100(4):287～293.
[6] kansas GS, Ley K, Munro JM, et al. Regulation of leucocyte rolling and adhesion to high endothelium vensules through the cytoplasmic domain of L-selectin[J]. J Exp Med, 1993, 177(3):833～838.
[收稿日期] 1998-09-14 [修回日期] 1999-11-19
, 百拇医药
单位：(第二军医大学南京军医学院病理教研室，江苏 南京 210099)
关键词：休克；白细胞；烧伤
中国病理生理杂志000223
[摘 要] 目的和方法：将32只SD大鼠随机分为正常对照组(n=8)。单纯手术组(n=8)，手术烧伤休克组(n=8)，单纯烧伤组(n=8)。应用流式细胞技术检测淋巴细胞，中性粒细胞及单核细胞表面L-选择素的表达量变化，同时比较观察两手术组动物肠系膜微循环中微静脉内白细胞与内皮细胞粘附数量变化，探讨L-选择素与白细胞-内皮细胞粘附间的关系。结果：与正常对照组相比，其它三组动物术前，烧伤前L-选择素在淋巴细胞，中性粒细胞和单核细胞均无明显差异(P>0.05)，但术后3 h，烧伤后3 h则明显减少(P<0.05)；手术烧伤休克组自身对照(烫伤前与烫伤后3 h)及手术对照组自身对照(开腹前与开腹后3 h)结果显示，L-选择素表达量也减少(P<0.05)；微循环观察结果显示，手术烧伤休克组动物烫伤后随时程延长，附壁滚动及紧密粘附的白细胞数量明显增多，而单纯手术组则无明显变化。结论：烧伤休克及手术创伤均可造成白细胞表面L-选择素数量明显减少，本实验发现重度烧伤使白细胞粘附数量增多，白细胞-内皮细胞粘附力增强，提示烧伤休克时可能有粘附分子(包括L-选择素)功能的增强。
, http://www.100md.com
[中图分类号] R541.6+4 [文献标识码] A
[文章编号]1000-4718(2000)02-0169-03
白细胞同血管内皮细胞间的粘附具有重要的病理意义。研究表明，休克发生过程中，白细胞粘附于细静脉壁数量增多，造成血流阻力增大，微循环缺血，缺氧。另外，血管内皮细胞与白细胞相互反应后还可使白细胞释放各种生物活性物质，导致微循环的进一步紊乱[1，2]。目前，烧伤创伤休克状态下白细胞与内皮细胞粘附的发生及变化机制尚未完全阐明。本实验在原有对L-选择素转录水平表达的研究基础上[3]，应用流式细胞技术，进一步探讨L-选择素在白细胞表面表达变化及与白细胞-内皮细胞粘附之间的关系。
材 料 和 方 法
一、试剂及仪器
, 百拇医药
(一)抗体FITC(fluorescein isothiocyanate)标记仓鼠抗大鼠CD62L单克隆抗体，美国PharMingen公司产品。
(二)FACSort型流式细胞仪，流式细胞仪校正微球(2 micron beads, CaliBRITE beads)，溶血素，美国Becton-Dickinson公司产品。
(三)倒置微循环观察显微镜，监视器，摄像头，徐州光学仪器厂产品。
(四)大鼠肠系膜微循环恒温观察槽，南京铁道医学院病理生理教研室制作。
二、动物分组及休克模型复制
成年健康SD大鼠32只，体重180～220 g，雌雄不限，随机分为4组：(一)正常组(8只)，(二)假手术对照组(8只)，(三)手术烧伤休克组(8只)，(四)单纯烧伤休克组(8只)。肌肉注射25%乌拉坦(0.6 mL/100 g体重)麻醉。一侧颈动脉插管，用于采血及记录血压。两休克组以80℃热水烫伤腰以下肢体30 s(占体表面积35%～40%)造成深Ⅱ度烧伤，复制重症烧伤休克模型。
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三、肠系膜微循环白细胞-内皮细胞粘附观察
假手术对照组，手术烧伤休克组大鼠中腹部沿腹正中线做3 cm切口，开腹后找到盲肠，沿盲肠游离端所指方向轻轻将一段回肠及肠系膜拉出腹外，将肠系膜平铺于恒温观察槽的圆窗上，盖上塑料薄膜(恒温槽内已注满生理盐水并恒温于38℃。于40倍镜下找到清晰的微动脉(直径小于30 μm)和微静脉(直径小于40 μm)，观察微循环，通过摄录像电视系统每半小时记录白细胞流态及与血管内皮细胞粘附数量变化。检测获得图象中选定微血管段60 s内白细胞滚动附壁数量。将附壁不再运动的白细胞定为紧密粘附的白细胞。计算实验时段两端单位面积内皮细胞表面(104 μm2)紧密粘附的白细胞数量，所得数据以±s表示，均数差异显著性用t检验法。
四、流式细胞术检测
(一)血液标本采集 正常组与烧伤组均于颈动脉插管后采血0.4 mL,肝素抗凝(20～25 IU/mL)，第二次采血于烧伤，开腹后3 h，血量0.4 ml,同法抗凝。
, 百拇医药
(二)CD62L免疫荧光标记 取两只塑料管分别标明对照，CD62L。CD62L管加5 μL CD62L-FITC，然后每管加100 μL肝素抗凝血混匀，4℃避光反应30 min,加2 mL溶血素溶血8 min，离心(800 r/min,5 min)，弃去上清液，加2 mL PBS混匀，离心(800 r/min, 5 min)，控干，加1 mL PBS混匀，待测。对照管不加CD62L-FITC，其余步骤相同。
(三)流式细胞术分析
1.流式细胞仪校准 启动Cell Quest软件，用2 micron Beads调整流式细胞仪的荧光检测CV值小于2%。启动FACS Comp软件，用Cali BRIATE Beads自动调整光电倍增管电压。灵敏度，阈值及颜色补偿，使流式细胞仪处于最佳工作状态。
2.淋巴细胞，中性粒细胞，单核细胞表面CD62L表达量分析 启动Cell Quest软件分别测定对照管和测定管的光散射和荧光密度，收集1万个细胞，以对照管的FL1-H为对照，分析测定管的平均荧光密度。对测定结果中的平均荧光密度均值(以
±s表示)采用t检验判定差异显著性。, 百拇医药
结 果
一、白细胞表面L-选择素表达量变化(表1)
与正常对照组相比，其它3组术前，烧伤前L-选择素在3系细胞均无显著差异(P>0.05)，但在术后及烧伤后3 h(包括单纯烧伤组)L-选择素在3系细胞均显著少于正常对照组(P<0.05)。假手术组术前与术后相比及手术烧伤组术前与术后相比，L-选择素在3系细胞均显著减少(P<0.05)。假手术组术后及手术烧伤组术后与单纯烧伤组相比，L-选择素在3系细胞均无显著差异(P>0.05)。
表1 白细胞表面L-选择素表达量变化
Tab 1 Changes of L-selectin surface expression on leukocytes
Normal
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Burn
Operation
Burn and operation
before
3 h after
before
3 h after
< operation
operation
burn
burn
Lymphocytes
, http://www.100md.com
197.52±42.66
133.30±32.58*
183.11±54.42
135.09±54.61*＃
193.19±63.36
134.94±52.16*△
Granulocytes
300.73±184.97
161.82±86.12*
279.46±84.72
, http://www.100md.com
142.27±32.80*＃
245.08±111.13
123.34±85.21*△
Monocytes
373.60±150.96
276.34±121.49*
404.24±128.68
298.81±168.07*＃
326.71±115.69
255.98±150.18*△
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*P<0.05， vs normal; # P<0.05， vs before operation; △ P<0.05， vs before burn
二、肠系膜微循环中微血管内白细胞与内皮细胞粘附情况变化(图1，图2)
Fig 1 Comparison of rolling adhesion leucocytes between burn (operation) group and operation group
±s,n=8,△P<0.05，vs operation group图1 烧伤休克组与对照组附壁滚动白细胞数目比较
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烧伤后，可见微静脉内附壁滚动的白细胞增多，粘附于壁上的白细胞也见增多，且随着观察时程的延长，附壁滚动的及粘附的白细胞数逐渐增多。微动脉壁上滚动的白细胞极少。在对照组，微静脉内也可见附壁滚动的白细胞，但数量明显比烧伤组少，粘附于壁上的白细胞更少。
Fig 2 Comparison of tight adhesion leucocytes between burn (operation) group and operation group
±s,n=8,△P<0.05,vs operation group图2 烧伤休克组与对照组紧密粘附白细胞数目比较
讨 论
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为明确烧伤休克对白细胞表面L-选择素数量变化的影响，我们将动物分为4组进行实验观察，发现与正常组对比，假手术组术后3 h，手术烧伤组烧伤后3 h及单纯烧伤组烧伤后3 h，3系白细胞L-选择素表面数量均发生明显减少(P<0.05)，表明手术创伤及烧伤休克均可导致白细胞L-选择素表面数量的减少。假手术组，烧伤休克组自身前后对照结果亦显示白细胞L-选择素表面数量明显减少(P<0.05)，同样支持前面的结论。假手术组术后3 h，手术烧伤组烧伤后3 h及单纯烧伤组烧伤后3 h相比，3系白细胞L-选择素表面数量无显著差异(P>0.05)，进一步表明创伤因素，烧伤休克均导致L-选择素数量减少，但两者未显示明显的叠加效应。
根据已有的研究结果，我们推测，创伤，烧伤休克使白细胞表面L-选择素数量减少的机制可能有两个方面，一是在这些因素的影响下，L-选择素从白细胞表面脱落下来(shedding)，并在血浆中以可溶性形成存在[4]，二是L-选择素转录水平表达的下调，使其细胞表面数量不能得到有效补充[3]。
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在观察肠系膜微循环时我们发现，手术烧伤休克组动物烧伤时程的延长，滚动粘附及紧密粘附于微静脉壁上的白细胞数量逐渐增多，变化显著，而在假手术组则无明显改变，说明严重烧伤休克对白细胞-内皮细胞粘附影响较大，使二者的粘附力增强，而本实验的手术创伤对白细胞-内皮细胞粘附未产生明显的影响。
已知选择素家族的3个成员是介导白细胞与内皮细胞滚动粘附的主要分子。L-选择素只表达在白细胞上，在有一定切应力的情况下，其作用尤为突出[5，6]，本实验结果提示，烧伤休克大鼠白细胞表面L-选择素数量变化与粘附于内皮细胞上的白细胞数量变化呈相反的趋势，白细胞-内皮细胞粘附力增强是否与L-选择素功能(即与配体的结合力)的改变有关，是否与内皮细胞表达的E-选择素，P-选择素的数量及功能变化有关尚待进一步的研究。
白细胞同微血管内皮细胞粘附造成微循环功能障碍是重症休克发生的重要原因已为学术界所公认，如何防止和解除粘附则是研究的热点。我们认为，解决问题的关键是从粘附分子功能调节及受配体结合的角度入手进行更深入的研究。
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[参 考 文 献]
[1] Zhao KS, Zhu ZG, Woo GY, et al.Effect of naloxane on microcirculatory behevior during irreversible hemorrhagic shock[J]. Microvasc Res, 1987, 34:84～95.
[2] 赵克森.休克微循环中白细胞流变行为的研究[J].微循环杂志，1992，2(3)：40～43.
[3] 赵智辉，赵克森，朱佐江.重度烧伤休克大鼠L-选择素转录水平表达的研究[J].中国病理生理杂志，1998，14(1)：43～46.
[4] Oda T, Katori M, Hatanaka K, et al. Five steps in leucocyte extravasation in the microcirculation by chemoattractans[J]. Mediators in the Inflammation， 1992, 1:403～409.
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[5] Kansas GS. Structure and function of L-selectin[J]. AMPIS, 1992, 100(4):287～293.
[6] kansas GS, Ley K, Munro JM, et al. Regulation of leucocyte rolling and adhesion to high endothelium vensules through the cytoplasmic domain of L-selectin[J]. J Exp Med, 1993, 177(3):833～838.
[收稿日期] 1998-09-14 [修回日期] 1999-11-19
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