亚低温对短暂脑缺血海马区cGMP的合成影响
作者：张敬军 夏作理 房玉珍
单位：(山东省泰山医学院附属医院微循环研究所，山东 泰安 271000)
关键词：脑缺血；海马；低温
中国病理生理杂志000222
[摘 要] 目的：观察脑缺血常温组与亚低温组对海马区cGMP合成的影响。方法：钳夹沙土鼠的双侧颈总动脉制造脑缺血模型，应用免疫荧光法染色，观察海马CA1区cGMP的变化。结果：脑缺血常温组海马本部有许多cGMP强阳性及中等强度细胞，脑缺血亚低温海马本部cGMP阳性细胞较常温组减少，且cGMP阳性细胞的显色较弱。结论：脑缺血亚低温减少了海马本部cGMP的合成。
[中图分类号] R 318.52 [文献标识码] A
, http://www.100md.com
[文章编号]1000-4718(2000)01-0167-02
[MeSH] Cerebral; ischemia; Hippocampus; Hypothermia
近年来，大量的实验材料证实亚低温(mild hypothermia, 32～35℃)对缺血脑有一定的保护作用，尤其对短暂性脑缺血损伤具有明显的预防作用和相当宽的治疗窗[1]。这对临床应用亚低温治疗脑缺血具有重要意义。目前的研究认为亚低温对减轻脑损伤的保护机理主要通过：降低脑能量代谢，保护血脑屏障、减轻脑水肿、抑制内源性有害物质的释放，减少脑细胞蛋白破坏等。但亚低温对缺血脑的保护作用是多种机制共同作用的结果，明确每个机制的确切作用方式及各机制间的相互关系，需要进行更深入的研究。本实验用免疫荧光法观察亚低温对脑缺血海马区cGMP合成的影响，并探讨其作用机制。
材 料 和 方 法
, 百拇医药
一、材料
(一)动物 雄性沙土鼠70～80 g(约12周龄)30只，随机分为3组，假手术动物常温组(37±0.2)℃，脑缺血常温组(37±0.2)℃；脑缺血亚低温组(32±0.2)℃。每组10只动物。
(二)试剂与仪器 抗cGMP抗血清及FITC标记的抗羊IgG(chemicon international INC.公司)。温差电偶仪，新鲜脑组织切片机，低温恒冷切片机。
二、方法
(一)孵化液的配制(mmol.L-1)[2] 用蒸馏水配成的溶液NaCI 121.1, KCI 1.87， KH2PO4 1.17， MgSO4 1.15， NaHCO3 24.9，CaCl2 1.2，葡萄糖11.0， pH 7.4。在4℃条件下向上述配好的溶液通5% CO2及95% O2进行饱和，20 min后使用。
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(二)脑温的测定、维持和脑缺血的复制 1.5%卤烷吸入麻醉沙土鼠，选择一侧脑区，在前囱前及前囱一侧各2 mm的平行线交叉点，用温差电偶探针垂直进针2 mm，监测脑温并维持在(37±0.2)℃为常温组；(32±0.2)℃为亚低温组，脑温的升降及维持，采用60 W白炽灯加热，冰袋降温调节自动控温仪来完成。暴露两侧颈总动脉，停止麻醉药至动物清醒，用无损伤的血管夹立即夹闭双侧颈总动脉5 min后，撤夹恢复血流。假手术动物组不夹闭血管。模型成功标准是：阻断双侧颈总动脉血流后，动物立即出现呼吸加快，肢体痉挛，在10 s～1.5 min内昏迷。血流复通后，动物分别在5～10 min苏醒，不合上述标准者弃去不用。
(三)海马脑片的制备与处理 恢复血流15 min后断头、取脑、剥离海马并固定于切片机上，切成300 μm的脑片。取脑、剥离海马、切片均在冰冷的条件下操作。将每个样本的脑片分别置于含2 mmol*L-1伊菠丁基甲基黄嘌呤的孵化液中，在5% CO2及95% O2，37℃的孵化箱中孵化40 min；加多聚甲醛(最终浓度4%)孵化10 min；4%的多聚甲醛固定2 h，用含5%蔗糖的TBS洗30 min；再恒冷切片，每只动物取出连续6张冠状背侧海马切片，片厚10 μm。
, 百拇医药
(四)海马脑片免疫荧光染色 用10%羊血清孵化30 min(37℃)，用抗cGMP抗体(1∶5000)孵化16 h(4℃)，TBS冲洗，用FITC标记的抗羊的IgG(1∶200)孵化90 min(37℃)，冲洗、封片，荧光显微镜观片。
结 果
根据染色强度cGMP阳性细胞可分为强阳性、中等、弱阳性3种类型。强阳性cGMP着色很强，弱阳性cGMP着色很弱，中等强度介于两者之间。假手术对照常温组：海马本部CA1区放射层及分子层分布着少量微弱的cGMP阳性细胞。脑缺血常温组：海马本部分布着许多cGMP阳性细胞，阳性细胞多为强阳性，主要分布于CA1区的放射层及分子层，细胞形态以圆形或椭圆形的中、小型细胞为主，部分细胞突起明显，cGMP阳性纤维是弱的。脑缺血亚低温组：海马本部分布着一些cGMP阳性细胞，阳性细胞多为弱阳性，分布及形态同脑缺血常温组。3组CA1区锥体细胞均未见cGMP阳性细胞。
, 百拇医药
各组海马本部cGMP阳性细胞密度不一，每只动物取出连续6张冠状背侧海马切片，在荧光显微镜下单侧计数CA1区1 mm长范围的阳性细胞数，阳性细胞数定量分析结果见表1。空白对照实验结果为阴性。
表1 各组海马CA1区cGMP阳性细胞数的变化
Tab 1 Numbers of cGMP positive cells in different
groups in CA1 region(
±s,n=10) Group
Numbers of positive cells
Control(37℃)
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21.0±3.3
Cerebral ischemia(37℃)
184.0±5.9*
Cerebral ischemia(32℃)
107.0±4.7*△
*P<0.01, vs control; △P<0.01, vs cerebral ischemia(37℃)讨 论
实验结果表明短暂性前脑缺血常温组海马本部有许多cGMP阳性细胞，其机制可能是：脑缺血时兴奋性递质谷氨酸从突触前膜释放作用于突触后膜上的谷氨酸受体，突触后膜去极化达一定程度，降低了镁离子对谷氨酸受体的阻断，钙离子通过离子通道进入细胞内，当钙离子达一定浓度时，便激活了神经原生型一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, NOS)，引起一氧化氮合成增加，NO是浆型鸟苷酸环化酶(guanyly cyclase, GC)的主要激活剂，暴发性生成的NO激活GC使cGMP合成增加。
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脑缺血亚低温的实验结果表明：脑缺血亚低温较常温抑制了海马本部cGMP的合成，从cGMP的合成途径上推测其机制可能是：亚低温抑制了兴奋性氨基酸的合成及释放，抑制了谷氨酸受体，稳定细胞各种质膜，抑制钙离子内流，从而抑制了神经原生型NOS的活性，也就抑制了NO的产生及其介导的cGMP的合成。脑缺血亚低温抑制了暴发性生成NO，也就减少了NO介导的谷氨酸的神经毒性，减少了自由基的生成及其对神经细胞的损害。脑缺血亚低温海马本部cGMP阳性细胞多于假手术对照组，但明显弱和少于脑缺血常温组，说明亚低温能减少脑缺血引起的胞内代谢紊乱。这些可能是亚低温对脑组织起保护作用的机制之一。这一实验还说明脑缺血亚低温在减少细胞损伤的同时，明显抑制了cGMP的合成，因而脑缺血亚低温的保护机理不能用cGMP的功效来解释。
常温组及亚低温组CA1区锥体细胞均未发现cGMP阳性细胞，说明这些锥体细胞与cGMP阳性细胞存在着明显的胞内代谢差异，其机制可能与这些锥体细胞中NOS[3,4]及GC[5]的质与量有关。cGMP是第二信使，在细胞内发挥着一系列重要功能，CA1区锥体细胞阴性是否与该种细胞对脑缺血的耐受性差，易发生迟发性神经元坏死或凋亡[6]有关，也待进一步深入研究。
, http://www.100md.com
[基金项目]山东省自然科学基金资助(Y98C19048)
[参 考 文 献]
[1]Winfree CJ, Baker CJ, Connolly ES, et al. Mild hypothermia reduces penumbral glutamate levels in the rat permanent focal cerebral ischemia model [J].Neurosurgery, 1996,38:1216～1222.
[2] 张敬军，韩丰谈，陈青. L-NAME对沙土鼠海马区cGMP的作用研究 [J].中国药学杂志， 1998，33：535～536.
[3] Dinerman JL, Dawson TM, Schell MJ, et al. Endothelial nitric oxide synthase localized to hippocampal pyramidal cells: implications for synaptic plasticity [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1994,91:4214～4218.
, http://www.100md.com
[4] ODell TJ, Huang PL, Dawson TM, et al. Blockade of LTP by inhibitors of nitric oxide synthase (NOS) in mice lacking neuronal NOS suggests a role for endothelial NOS [J]. Science, 1994, 265:542～546.
[5] Furuyama T, Inagaki S, Takagi H, et al. Localization of α1 and β1 subunits of soluble guanylate cyclase in the rat brain [J]. Mol Biain Res, 1993,20:335～344.
[6] 张敬军，陈青.脑缺血再灌流后海马区细胞凋亡的研究[J]. 中国临床神经科学，1999，7：38～40.
[收稿日期]1999-06-03 [修回日期]1999-12-03
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单位：(山东省泰山医学院附属医院微循环研究所，山东 泰安 271000)
关键词：脑缺血；海马；低温
中国病理生理杂志000222
[摘 要] 目的：观察脑缺血常温组与亚低温组对海马区cGMP合成的影响。方法：钳夹沙土鼠的双侧颈总动脉制造脑缺血模型，应用免疫荧光法染色，观察海马CA1区cGMP的变化。结果：脑缺血常温组海马本部有许多cGMP强阳性及中等强度细胞，脑缺血亚低温海马本部cGMP阳性细胞较常温组减少，且cGMP阳性细胞的显色较弱。结论：脑缺血亚低温减少了海马本部cGMP的合成。
[中图分类号] R 318.52 [文献标识码] A
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[文章编号]1000-4718(2000)01-0167-02
[MeSH] Cerebral; ischemia; Hippocampus; Hypothermia
近年来，大量的实验材料证实亚低温(mild hypothermia, 32～35℃)对缺血脑有一定的保护作用，尤其对短暂性脑缺血损伤具有明显的预防作用和相当宽的治疗窗[1]。这对临床应用亚低温治疗脑缺血具有重要意义。目前的研究认为亚低温对减轻脑损伤的保护机理主要通过：降低脑能量代谢，保护血脑屏障、减轻脑水肿、抑制内源性有害物质的释放，减少脑细胞蛋白破坏等。但亚低温对缺血脑的保护作用是多种机制共同作用的结果，明确每个机制的确切作用方式及各机制间的相互关系，需要进行更深入的研究。本实验用免疫荧光法观察亚低温对脑缺血海马区cGMP合成的影响，并探讨其作用机制。
材 料 和 方 法
, 百拇医药
一、材料
(一)动物 雄性沙土鼠70～80 g(约12周龄)30只，随机分为3组，假手术动物常温组(37±0.2)℃，脑缺血常温组(37±0.2)℃；脑缺血亚低温组(32±0.2)℃。每组10只动物。
(二)试剂与仪器 抗cGMP抗血清及FITC标记的抗羊IgG(chemicon international INC.公司)。温差电偶仪，新鲜脑组织切片机，低温恒冷切片机。
二、方法
(一)孵化液的配制(mmol.L-1)[2] 用蒸馏水配成的溶液NaCI 121.1, KCI 1.87， KH2PO4 1.17， MgSO4 1.15， NaHCO3 24.9，CaCl2 1.2，葡萄糖11.0， pH 7.4。在4℃条件下向上述配好的溶液通5% CO2及95% O2进行饱和，20 min后使用。
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(二)脑温的测定、维持和脑缺血的复制 1.5%卤烷吸入麻醉沙土鼠，选择一侧脑区，在前囱前及前囱一侧各2 mm的平行线交叉点，用温差电偶探针垂直进针2 mm，监测脑温并维持在(37±0.2)℃为常温组；(32±0.2)℃为亚低温组，脑温的升降及维持，采用60 W白炽灯加热，冰袋降温调节自动控温仪来完成。暴露两侧颈总动脉，停止麻醉药至动物清醒，用无损伤的血管夹立即夹闭双侧颈总动脉5 min后，撤夹恢复血流。假手术动物组不夹闭血管。模型成功标准是：阻断双侧颈总动脉血流后，动物立即出现呼吸加快，肢体痉挛，在10 s～1.5 min内昏迷。血流复通后，动物分别在5～10 min苏醒，不合上述标准者弃去不用。
(三)海马脑片的制备与处理 恢复血流15 min后断头、取脑、剥离海马并固定于切片机上，切成300 μm的脑片。取脑、剥离海马、切片均在冰冷的条件下操作。将每个样本的脑片分别置于含2 mmol*L-1伊菠丁基甲基黄嘌呤的孵化液中，在5% CO2及95% O2，37℃的孵化箱中孵化40 min；加多聚甲醛(最终浓度4%)孵化10 min；4%的多聚甲醛固定2 h，用含5%蔗糖的TBS洗30 min；再恒冷切片，每只动物取出连续6张冠状背侧海马切片，片厚10 μm。
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(四)海马脑片免疫荧光染色 用10%羊血清孵化30 min(37℃)，用抗cGMP抗体(1∶5000)孵化16 h(4℃)，TBS冲洗，用FITC标记的抗羊的IgG(1∶200)孵化90 min(37℃)，冲洗、封片，荧光显微镜观片。
结 果
根据染色强度cGMP阳性细胞可分为强阳性、中等、弱阳性3种类型。强阳性cGMP着色很强，弱阳性cGMP着色很弱，中等强度介于两者之间。假手术对照常温组：海马本部CA1区放射层及分子层分布着少量微弱的cGMP阳性细胞。脑缺血常温组：海马本部分布着许多cGMP阳性细胞，阳性细胞多为强阳性，主要分布于CA1区的放射层及分子层，细胞形态以圆形或椭圆形的中、小型细胞为主，部分细胞突起明显，cGMP阳性纤维是弱的。脑缺血亚低温组：海马本部分布着一些cGMP阳性细胞，阳性细胞多为弱阳性，分布及形态同脑缺血常温组。3组CA1区锥体细胞均未见cGMP阳性细胞。
, 百拇医药
各组海马本部cGMP阳性细胞密度不一，每只动物取出连续6张冠状背侧海马切片，在荧光显微镜下单侧计数CA1区1 mm长范围的阳性细胞数，阳性细胞数定量分析结果见表1。空白对照实验结果为阴性。
表1 各组海马CA1区cGMP阳性细胞数的变化
Tab 1 Numbers of cGMP positive cells in different
groups in CA1 region(
±s,n=10) GroupNumbers of positive cells
Control(37℃)
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21.0±3.3
Cerebral ischemia(37℃)
184.0±5.9*
Cerebral ischemia(32℃)
107.0±4.7*△
*P<0.01, vs control; △P<0.01, vs cerebral ischemia(37℃)讨 论
实验结果表明短暂性前脑缺血常温组海马本部有许多cGMP阳性细胞，其机制可能是：脑缺血时兴奋性递质谷氨酸从突触前膜释放作用于突触后膜上的谷氨酸受体，突触后膜去极化达一定程度，降低了镁离子对谷氨酸受体的阻断，钙离子通过离子通道进入细胞内，当钙离子达一定浓度时，便激活了神经原生型一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, NOS)，引起一氧化氮合成增加，NO是浆型鸟苷酸环化酶(guanyly cyclase, GC)的主要激活剂，暴发性生成的NO激活GC使cGMP合成增加。
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脑缺血亚低温的实验结果表明：脑缺血亚低温较常温抑制了海马本部cGMP的合成，从cGMP的合成途径上推测其机制可能是：亚低温抑制了兴奋性氨基酸的合成及释放，抑制了谷氨酸受体，稳定细胞各种质膜，抑制钙离子内流，从而抑制了神经原生型NOS的活性，也就抑制了NO的产生及其介导的cGMP的合成。脑缺血亚低温抑制了暴发性生成NO，也就减少了NO介导的谷氨酸的神经毒性，减少了自由基的生成及其对神经细胞的损害。脑缺血亚低温海马本部cGMP阳性细胞多于假手术对照组，但明显弱和少于脑缺血常温组，说明亚低温能减少脑缺血引起的胞内代谢紊乱。这些可能是亚低温对脑组织起保护作用的机制之一。这一实验还说明脑缺血亚低温在减少细胞损伤的同时，明显抑制了cGMP的合成，因而脑缺血亚低温的保护机理不能用cGMP的功效来解释。
常温组及亚低温组CA1区锥体细胞均未发现cGMP阳性细胞，说明这些锥体细胞与cGMP阳性细胞存在着明显的胞内代谢差异，其机制可能与这些锥体细胞中NOS[3,4]及GC[5]的质与量有关。cGMP是第二信使，在细胞内发挥着一系列重要功能，CA1区锥体细胞阴性是否与该种细胞对脑缺血的耐受性差，易发生迟发性神经元坏死或凋亡[6]有关，也待进一步深入研究。
, http://www.100md.com
[基金项目]山东省自然科学基金资助(Y98C19048)
[参 考 文 献]
[1]Winfree CJ, Baker CJ, Connolly ES, et al. Mild hypothermia reduces penumbral glutamate levels in the rat permanent focal cerebral ischemia model [J].Neurosurgery, 1996,38:1216～1222.
[2] 张敬军，韩丰谈，陈青. L-NAME对沙土鼠海马区cGMP的作用研究 [J].中国药学杂志， 1998，33：535～536.
[3] Dinerman JL, Dawson TM, Schell MJ, et al. Endothelial nitric oxide synthase localized to hippocampal pyramidal cells: implications for synaptic plasticity [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1994,91:4214～4218.
, http://www.100md.com
[4] ODell TJ, Huang PL, Dawson TM, et al. Blockade of LTP by inhibitors of nitric oxide synthase (NOS) in mice lacking neuronal NOS suggests a role for endothelial NOS [J]. Science, 1994, 265:542～546.
[5] Furuyama T, Inagaki S, Takagi H, et al. Localization of α1 and β1 subunits of soluble guanylate cyclase in the rat brain [J]. Mol Biain Res, 1993,20:335～344.
[6] 张敬军，陈青.脑缺血再灌流后海马区细胞凋亡的研究[J]. 中国临床神经科学，1999，7：38～40.
[收稿日期]1999-06-03 [修回日期]1999-12-03
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