低分子核糖核酸对白血病细胞系HL-60细胞增殖的抑制作用
作者：倪晓华 毕富勇
单位：(皖南医学院生物化学教研室，安徽 芜湖 241001)
关键词：RNA；胚胎；肝；白血病
中国病理生理杂志000220
[摘 要] 目的：研究低分子核糖核酸(RNA)对白血病细胞系HL-60细胞增殖的影响。方法：采用人胚胎肝细胞提取的低分子RNA掺入HL-60细胞培养。结果：低分子RNA掺入使HL-60细胞集落生长降低，并与掺入浓度呈负相关(r=-0.9435,P<0.01)，细胞蛋白质含量降低(P<0.01)，细胞形体缩小，FITC-ConA实验，帽状细胞数下降(P<0.01)。结论：低分子RNA对HL-60细胞的增殖有显著抑制作用。
[中图分类号] Q279 [文献标识码] A
, 百拇医药
[文章编号] 1000-4718(2000)02-0112-02
[MeSH] RNA; Embryo; Liver; Leukemia
Apirion等于1977年提出细胞核内合成的低分子RNA对基因表达具有抑制作用。Tomizawa发现反义核糖核酸(ribonucleic acid,RNA)可抑制质粒脱氧核糖核酸(deoxyri-bonucleic acid,RNA)的复制，并可调节基因的转录和翻译。1979年Mary等已发现细胞质膜上存在有RNA，Benner于1987年提出“胞外RNA作为细胞间通迅物质”的设想，郑益星也提出动物胰组织RNA对瘤细胞增殖有抑制作用，本实验采用提取胚胎肝细胞的低分子RNA与HL-60细胞培养，以研究低分子RNA对白血病细胞系HL-60细胞增殖的影响。
材料
HL-60细胞：本室传代培养，人胚胎肝细胞组织：附院提供(11例)。
, 百拇医药
方法
1.提取纯化细胞RNA 采用异硫氰酸胍-苯酚-氯仿一步法抽提细胞总RNA。将人胚胎肝细胞组织剪碎匀浆，制备细胞悬液，加入RNAase灭活剂乙基焦碳酸钠，再依次加入异硫氰酸胍、苯酚、氯仿、震荡混匀后，离心13 000 r/min弃上清，真空抽干，加入Tris-EDTA溶液，在752-型分光光度计测定核酸和蛋白的A值，计算RNA纯度A260/A280>1.9，于-70℃贮存备用。2.分离低分子RNA 将SephadexG50加入0.01 mol/L PBS，高压灭菌25 min，浸泡4 h装柱，吸取RNA提取液缓缓加在层析柱上，同0.01 mol/L PBS洗脱，洗脱液在254 nm时出现大小2个峰，分别收集，过滤除菌置-4℃冰箱贮存备用。3.HL-60细胞培养 ①悬液细胞培养 培养基为20%小牛血清的1640液于CO2孵箱37℃培养72 h。②集落细胞培养 细胞终浓度为1×106/mL，培养基为2.5%甲基纤维素。掺入2 μg/mL低分子RNA，置96孔板作集落细胞培养，此为实验组，对照组则加0.01 mol/L的PBS液，于CO2孵箱37℃培养96 h后作集落计算，大于15个细胞为1集落。每组作3孔，取平均值。③小峰组分浓度依赖实验 分别以0.50、0.75、1.25、2.5、5(μL)低分子RNA与HL-60作集落细胞培养。4.测定细胞蛋白含量 采用微量凯氏定氮法测定细胞蛋白含量。5.帽状(capped cell)细胞计数 将异硫氰酸荧光素FITC标记的伴刀豆球蛋白ConA与掺入低分子RNA的HL-60细胞作用15 min，在荧光显微镜下进行膜荧光细胞总数和capped细胞计数。 结果
, http://www.100md.com
1.RNA的层析分离，得到大峰组分和小峰组分(图1)。2.低分子RNA对HL-60细胞集落生长有明显抑制作用，蛋白含量下降(表1)，显微镜下观察，细胞明显瘦小，不规则。3.浓度依赖实验：掺入低分子RNA浓度分别为0.50、0.75、1.25、2.5、5(μL)，细胞集落数则为146、136、120、104、90，而对照组则为150，经相关性检验r=-0.9435,P<0.01。4.FITC-ConA作用15 min后，对照组和实验组荧光细胞数为115、110，而帽状细胞数则为26和14，经χ2检验P<0.01。
讨 论
低分子RNA可透过细胞膜而进入胞内，作为反义RNA，通过碱基配对与mRNA分子结合，形成RNA=RNA的互补双链，从而阻止了RNA的胞内运输，并阻断mRNA的表达导致细胞内蛋白含量下降，有的学者认为反义mRNA阻滞HL-60细胞的GH-CSF的增殖信号，并在细胞增殖中具负调节因子的作用，本实验结果表明从人胚胎肝细胞提取的低分子RNA对HL-60细胞的增殖有抑制作用，并且其抑制程度与低分子RNA浓度呈正相关，且由于低分子RNA的掺入，抑制了HL-60细胞的蛋白合成，说明低分子RNA的掺入对HL-60的基因表达有抑制作用。同时帽状细胞计数则表明低分子RNA通过降低ConA与细胞表面受体的结合率而降低了细胞帽的形成，本实验结果表明低分子RNA对HL-60细胞增殖有明显抑制作用，为临床上应用低分子RNA对白血病进行治疗提供了理论依据。
, 百拇医药
Fig 1 Chromatographic seperation of RNA
A:High molecular RNA; B:Low molecular RNA
图1 RNA层析分离
表1 RNA对HL-60细胞集落生长及蛋白含量的影响
Tab 1 The effect of RNA to colony growth and the content
of protein (Pro) of HL-60 cell (
±s,n=11)
Control
, 百拇医药
A
B
The number
of colony cell
140±15
128±20
66±13**
Content of
Pro(μg/mL)
0.806±0.036
0.789±0.041
0.380±0.022**
, http://www.100md.com
**P<0.01,vs control group [参 考 文 献]
[1] Potter AM, Watmore A. Cytogenetics in myeloid leukaemia [M].In:Human cytogenetics. ed. Vol Ⅱ. Oxford University Press:Oxford, 1992. 27.
[2]Thibodeau SN, Schaid BD. Microsatellite instability in cancer of proximal colon[J]. Science, 1993, 260:816.
[3] 周爱儒. 反义RNA[J]. 生命的化学，1991,11(3)：14.
[4] 郑益星. 胰RNA对瘤细胞作用的研究[J]. 生物化学与生物物理进展，1989，16(2)：137～139.
[5] 吴克复. 当前实验血液学的主要动向[J]. 中华血液学杂志，1991，12(3)：157～159.
[收稿日期]1999-03-31 [修回日期]1999-12-22, 百拇医药
单位：(皖南医学院生物化学教研室，安徽 芜湖 241001)
关键词：RNA；胚胎；肝；白血病
中国病理生理杂志000220
[摘 要] 目的：研究低分子核糖核酸(RNA)对白血病细胞系HL-60细胞增殖的影响。方法：采用人胚胎肝细胞提取的低分子RNA掺入HL-60细胞培养。结果：低分子RNA掺入使HL-60细胞集落生长降低，并与掺入浓度呈负相关(r=-0.9435,P<0.01)，细胞蛋白质含量降低(P<0.01)，细胞形体缩小，FITC-ConA实验，帽状细胞数下降(P<0.01)。结论：低分子RNA对HL-60细胞的增殖有显著抑制作用。
[中图分类号] Q279 [文献标识码] A
, 百拇医药
[文章编号] 1000-4718(2000)02-0112-02
[MeSH] RNA; Embryo; Liver; Leukemia
Apirion等于1977年提出细胞核内合成的低分子RNA对基因表达具有抑制作用。Tomizawa发现反义核糖核酸(ribonucleic acid,RNA)可抑制质粒脱氧核糖核酸(deoxyri-bonucleic acid,RNA)的复制，并可调节基因的转录和翻译。1979年Mary等已发现细胞质膜上存在有RNA，Benner于1987年提出“胞外RNA作为细胞间通迅物质”的设想，郑益星也提出动物胰组织RNA对瘤细胞增殖有抑制作用，本实验采用提取胚胎肝细胞的低分子RNA与HL-60细胞培养，以研究低分子RNA对白血病细胞系HL-60细胞增殖的影响。
材料
HL-60细胞：本室传代培养，人胚胎肝细胞组织：附院提供(11例)。
, 百拇医药
方法
1.提取纯化细胞RNA 采用异硫氰酸胍-苯酚-氯仿一步法抽提细胞总RNA。将人胚胎肝细胞组织剪碎匀浆，制备细胞悬液，加入RNAase灭活剂乙基焦碳酸钠，再依次加入异硫氰酸胍、苯酚、氯仿、震荡混匀后，离心13 000 r/min弃上清，真空抽干，加入Tris-EDTA溶液，在752-型分光光度计测定核酸和蛋白的A值，计算RNA纯度A260/A280>1.9，于-70℃贮存备用。2.分离低分子RNA 将SephadexG50加入0.01 mol/L PBS，高压灭菌25 min，浸泡4 h装柱，吸取RNA提取液缓缓加在层析柱上，同0.01 mol/L PBS洗脱，洗脱液在254 nm时出现大小2个峰，分别收集，过滤除菌置-4℃冰箱贮存备用。3.HL-60细胞培养 ①悬液细胞培养 培养基为20%小牛血清的1640液于CO2孵箱37℃培养72 h。②集落细胞培养 细胞终浓度为1×106/mL，培养基为2.5%甲基纤维素。掺入2 μg/mL低分子RNA，置96孔板作集落细胞培养，此为实验组，对照组则加0.01 mol/L的PBS液，于CO2孵箱37℃培养96 h后作集落计算，大于15个细胞为1集落。每组作3孔，取平均值。③小峰组分浓度依赖实验 分别以0.50、0.75、1.25、2.5、5(μL)低分子RNA与HL-60作集落细胞培养。4.测定细胞蛋白含量 采用微量凯氏定氮法测定细胞蛋白含量。5.帽状(capped cell)细胞计数 将异硫氰酸荧光素FITC标记的伴刀豆球蛋白ConA与掺入低分子RNA的HL-60细胞作用15 min，在荧光显微镜下进行膜荧光细胞总数和capped细胞计数。 结果
, http://www.100md.com
1.RNA的层析分离，得到大峰组分和小峰组分(图1)。2.低分子RNA对HL-60细胞集落生长有明显抑制作用，蛋白含量下降(表1)，显微镜下观察，细胞明显瘦小，不规则。3.浓度依赖实验：掺入低分子RNA浓度分别为0.50、0.75、1.25、2.5、5(μL)，细胞集落数则为146、136、120、104、90，而对照组则为150，经相关性检验r=-0.9435,P<0.01。4.FITC-ConA作用15 min后，对照组和实验组荧光细胞数为115、110，而帽状细胞数则为26和14，经χ2检验P<0.01。
讨 论
低分子RNA可透过细胞膜而进入胞内，作为反义RNA，通过碱基配对与mRNA分子结合，形成RNA=RNA的互补双链，从而阻止了RNA的胞内运输，并阻断mRNA的表达导致细胞内蛋白含量下降，有的学者认为反义mRNA阻滞HL-60细胞的GH-CSF的增殖信号，并在细胞增殖中具负调节因子的作用，本实验结果表明从人胚胎肝细胞提取的低分子RNA对HL-60细胞的增殖有抑制作用，并且其抑制程度与低分子RNA浓度呈正相关，且由于低分子RNA的掺入，抑制了HL-60细胞的蛋白合成，说明低分子RNA的掺入对HL-60的基因表达有抑制作用。同时帽状细胞计数则表明低分子RNA通过降低ConA与细胞表面受体的结合率而降低了细胞帽的形成，本实验结果表明低分子RNA对HL-60细胞增殖有明显抑制作用，为临床上应用低分子RNA对白血病进行治疗提供了理论依据。
, 百拇医药
Fig 1 Chromatographic seperation of RNA
A:High molecular RNA; B:Low molecular RNA
图1 RNA层析分离
表1 RNA对HL-60细胞集落生长及蛋白含量的影响
Tab 1 The effect of RNA to colony growth and the content
of protein (Pro) of HL-60 cell (
±s,n=11)Control
, 百拇医药
A
B
The number
of colony cell
140±15
128±20
66±13**
Content of
Pro(μg/mL)
0.806±0.036
0.789±0.041
0.380±0.022**
, http://www.100md.com
**P<0.01,vs control group [参 考 文 献]
[1] Potter AM, Watmore A. Cytogenetics in myeloid leukaemia [M].In:Human cytogenetics. ed. Vol Ⅱ. Oxford University Press:Oxford, 1992. 27.
[2]Thibodeau SN, Schaid BD. Microsatellite instability in cancer of proximal colon[J]. Science, 1993, 260:816.
[3] 周爱儒. 反义RNA[J]. 生命的化学，1991,11(3)：14.
[4] 郑益星. 胰RNA对瘤细胞作用的研究[J]. 生物化学与生物物理进展，1989，16(2)：137～139.
[5] 吴克复. 当前实验血液学的主要动向[J]. 中华血液学杂志，1991，12(3)：157～159.
[收稿日期]1999-03-31 [修回日期]1999-12-22, 百拇医药