人补体C5b～9复合物对大鼠肾系膜细胞一氧化氮生成的影响
作者：王迎伟 何球藻 秦慧莲 汤仁仙 高丰光 张光毅
单位：王迎伟 汤仁仙 高丰光(江苏徐州医学院免疫学教研室， 江苏 徐州 221002)；何球藻 秦慧莲(上海医科大学免疫学教研室，上海)；张光毅(徐州医学院生化教研室，江苏 徐州)
关键词：补体膜攻击复合物；肾小球膜； 细胞；一氧化氮；大鼠
中国病理生理杂志000319
[摘 要] 目的：探讨人补体 C5b～9复合物对大鼠肾小球系膜细胞(MC)合成一氧化氮(NO)的影响。方法：首先提取人补体C5b～9复合物，同时培养出大鼠肾小球MC。然后用C5b～9复合物刺激MC，观察刺激后6 h、24 h、和48 h培养上清液中NO代谢产物-硝酸根(NO-3)和亚硝酸根(NO2)量的变化，并测定刺激后24 h、48 h时MC内环鸟苷酸(cGMP)的水平。结果：用人C5b～9复合物刺激大鼠MC后可致培养上清中NO3/NO2含量增加，细胞内cGMP水平上升。NO合成增多能够被NO合酶(NOS)抑制剂—─-NG-硝基-L-精氨酸甲基酯(L-NAME)所抑制。结论：人C5b～9复合物能够增加大鼠肾MC 的NO合成。
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[中图分类号] R692.3 [文献标识码] A
[文章编号] 1000-4718(2000)03-0262-04
The effect of human complement C5b～9 complex on nitric oxide synthesis in glomerular mesangial cells of rats
WANG Ying-wei, HE Qiu-zao, QIN Hui-lian, TANG Ren-xian, GAO Feng-guang, ZHANG Guang-yi
(Dept of Immunology, Xuzhou Medical College, Xuzhou 221002, China)
, http://www.100md.com
[Abstract] AIM：To study the effect of human complement C5b～9 complex on nitric oxide(NO) synthesis of glomerular mesangial cells (MC). METHODS: First, the human complement C5b～9 complexes were isolated and glomerular MC of rats were cultured. Second, the MC were stimulated with C5b～9 complex and changes of metabolism products of NO(NO3 and NO2) in MC culture supernatant at 6,24 and 48 hours after C5b～9 stimulating were detected. Moreover, cGMP levels in cultured MC were also measured. RESULTS： NO3/NO2 contents from culture supernatant and cGMP levels in MC were increased parallelly after C5b～9 complex stimulation. Further, NO synthesis was inhibited by L-NG-nitro-arginine-methylester(L-NAME). CONCLUSION： NO synthesis of rat glomerular MC was incerased by human complement C5b～9 stimulation.
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[MeSH] Complement membrane attack complex; Glomerular mesangium; Cells; Nitric oxide; Rats
近年来对一氧化氮(nitric oxide， NO)参与机体组织功能的变化日益为人们所关注[1]。肾小球炎症时，NO合成的增加不仅可以改变肾小球的滤过率，而且还可引发肾细胞的病理损伤。已有资料表明，肾炎时肾内NO合成的增多与某些刺激因子如细菌脂多糖，肿瘤坏死因子α(tumour necrosis factor α，TNF-α)等作用密切相关[2]。另有实验证实，补体C5b～9复合物可作为肾细胞有效的刺激剂。亚溶量的C5b～9复合物能够插入细胞膜磷脂双层，参与细胞信号传导并激活细胞多种代谢途径，致使炎性介质释放，蛋白酶活化及代谢产物的堆积等[3，4]。本文利用提取的人补体C5b～9复合物作为刺激因子，观察它对体外培养的大鼠肾小球系膜细胞(mesangial cell,MC)合成NO的影响。
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材 料 和 方 法
一、主要材料
健康人血清由徐州市中心血站健康B型献血员提供。小牛血清购自南京卫岗血清厂。Ⅳ型胶原酶、牛胰岛素、L-精氨酸、L-NAME及3-异丁-甲基黄嘌呤(3-isobuthyl-1-methylxanthine，IBMX)均属Sigma公司产品。RPMI 1640干粉购自GIBCO公司。单克隆抗结蛋白、肌动蛋白、细胞角蛋白及第Ⅷ因子抗体为DAKO公司产品。多克隆抗人C3、C5和C9抗体及ABC法染色试剂购自上海生物制品研究所，多克隆抗人C5b～9复合物及C5b～9标准抗原由中国医学科学院基础所生化室提供。NO-3/NO-2测定试剂盒由南京建成生物工程研究所供应。[3H]-cGMP放免试剂盒来源于中国原子能研究院。SD大鼠及长耳白兔由徐州医学院实验动物中心提供。
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二、实验方法
1.人补体C5b～9复合物的提取 取新鲜正常人血清300 mL加入等体积10%的兔红细胞悬液，37℃水浴至兔红细胞全部溶血，离心洗涤沉淀的兔红细胞膜，再用10%脱氧胆酸钠溶解。样品经不同梯度蔗糖超速离心180?000×g 3 h后分段分管收集。各管液体先行电镜负染法检查提取物，再分别用抗人C3、C5、C9及抗人C5b～9复合物抗体进行斑点ELISA(Dot-ELISA)法鉴定。鉴定后的人补体C5b～9复合物经透析和超滤浓缩后按Lowry法测定蛋白量，-20℃保存。具体步骤参见文献[5，6]。
2.大鼠肾MC的培养与鉴定 取SD大鼠5只，雌性，体重150～200 g，乙醚麻醉后经胸主动脉插管用冷Hanks液灌洗双肾，剪取的肾皮质经50目、100目及200目不锈钢筛网分离收获肾小球，然后加入Ⅳ型胶原酶消化20 min。消化后的肾小球置于完全营养液(RPMI 1640+20%小牛血清+0.66 U/mL胰岛素)37℃ 5% CO2孵箱中培养。培养各期的MC用倒置显微镜、光镜、电镜作常规检查。原代培养2周及传代培养1周的MC以单克隆抗结蛋白、肌动蛋白、角蛋白及第VIII因子抗体为一抗，行常规ABC法染色鉴定。
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3. C5b～9复合物刺激剂量的确定及MC的分组处理 原代培养3周的MC配成1×105/mL悬液后转种24孔培养板。传代第3 d将培养液换成不含酚红液的RPMI 1640营养液(添加10%小牛血清及1 mmol/L精氨酸)培养24 h。然后取1块24孔培养板按不同浓度加入C5b～9复合物(1μg、10μg、20μg、40μg及80μg/mL)静置培养24 h，分别收集各孔的培养上清液用NO测定试剂盒测定NO3/NO2含量，根据NO3/NO2量确定C5b～9复合物刺激的最佳剂量(注：此次以40μg/mL C5b～9复合物刺激效果最好)。其余培养板中的MC分别作如下处理：(1)C5b～9组：每孔加含C5b～9复合物40μg/mL的营养液1 mL。(2)L-NAME组：每孔加入含2 mmol/L的 L-NAME营养液1 mL。(3)C5b～9+L-NAME组：每孔中加入含C5b～9复合物40μg/mL及含2 mmol/L的L-NAME营养液1 mL。(4)对照组：每孔仅加营养液1 mL。各组均设6个复孔。
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4. 检测指标 (1)NO3/NO2含量：上述分组处理的各孔培养的MC继续培养6 h、24 h、48 h后分别收集其培养上清液用硝酸还原酶法测定上清液中NO3/NO2的浓度。结果以μmol/L表示。(2)cGMP水平 分组处理同前所述，但各组所用的试剂中再加入终浓度为0.5 mmol/L IBMX，培养24 h和48 h后弃去营养液，细胞用生理盐水洗涤2次。留于孔内的细胞再用5%冷三氯醋酸处理1h。样品吸出后三氯醋酸经水饱和乙醚抽提4次除去。各组样品用[3H]-cGMP放免分析试剂盒测定其cGMP含量。孔内的MC蛋白经1%SDS溶解过夜，Lowry法定蛋白含量。最后以所测各孔cGMP值除以各孔MC蛋白量进行计算，结果以pmol/mg蛋白表示。
三、统计分析
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所得数据用
±s表示，均数差异显著性用计算机PEMS软件检验判断。
结 果
一、人C5b～9复合物的鉴定
抽提的人C5b～9复合物样品经不同梯度蔗糖超速离心后可见离心管中上部有一乳白色的致密环，电镜负染显示该致密物中主要是一些呈空心环状、γ形或π样的结构，这与国外文献报道的结果基本一致。另用Dot-ELISA法检测表明，提取的人C5b～9复合物经抗人C5、C9和C5b～9抗体染色均呈阳性，而用抗人C3染色呈阴性反应。
二、肾小球MC的培养
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倒置显微镜观察发现，经三道筛网分离的肾小球纯度达90%以上。原代培养4～6天肾小球多已贴壁。最初从肾小球中长出的细胞含有圆形或卵圆形的上皮细胞，2周后上皮细胞渐渐死亡，残留的MC多呈星形，梭形或不规则状。HE染色镜检MC形态有不规则突起。培养的MC电镜下可见富含微丝结构。原代培养2周后或传代培养的MC经免疫组化染色显示胞浆内结蛋白，肌动蛋白呈阳性，而细胞角蛋白(上皮细胞含有)，第Ⅷ因子(内皮细胞含有)呈阴性。由此排除了上皮细胞及内皮细胞混杂生长的可能性。
三、C5b～9复合物对MC产生NO-3/NO-2的影响
培养的MC用不同剂量人C5b～9复合物刺激24h时取各孔培养上清液测定NO-3/NO-2含量，与不加任何刺激物的对照组相比，差异以40μg/mL、80μg/mL C5b～9用量效果最为显著(P<0.01)，见表1。故在以后的实验中以40μg/mL C5b～9复合物作为刺激剂量，按方法3分组检测传代培养的MC经6 h、24 h和48 h培养后其上清液中的NO-3/NO-2含量变化，结果见表2。
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四、C5b～9复合物刺激对MC细胞内cGMP的影响
以剂量为40μg/mL的C5b～9复合物刺激，传代培养的MC按表3分组处理后经24 h、48 h时分别取样测定MC胞内cGMP含量，结果列于表3。
表1 不同浓度的C5b～9复合物刺激MC 24 h后其培养
上清液中NO3/NO2浓度的变化
Tab 1 Concentration changes of NO3/NO2 in culture
supernatant from MC stimulated for 24h with various dose
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of human C5b～9 complexes(±s,n=4) C5b～9 dose(μg/mL)
NO-3/NO-2(μmol/L)
0(Control)
27.55±4.01
1
25.16±3.46
10
30.74±3.95
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20
36.92±4.52*
40
49.68±7.75**
80
67.23±8.09**
*P<0.05,**P<0.01，vs control group表2 C5b～9复合物对MC生成NO-3/NO-2的影响
Tab 2 Effect of C5b～9 complex on NO-3/NO-2 production from MC (±s, n=6) Group
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NO-3/NO-2(μmol/L)
6 h
24 h
48 h
Control
28.16±4.56
28.16±4.34
27.93±4.56
C5b～9
36.34+5.37*
, http://www.100md.com
50.08±13.11**ΔΔ
46.61±13.82**Δ
L-NAME
27.93±3.51
28.55±2.98
26.85±5.21
C5b～9+L-NAME
32.80±7.16
30.02±3.97
31.79±4.10
, http://www.100md.com *P<0.05，**P<0.01，vs control group；ΔP<0.05，ΔΔP<0.01, vs C5b～9+L-NAME group表3 C5b～9复合物对MC内cGMP的影响
Tab 3 Effect C5b～9 complex on cGMP level in MC(±s,n=6) Group
Level of cGMP (pmol/mg protein)
24 h
48 h
Control
380±121
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445±114
C5b～9
1043±513*Δ
851±316*
L-NAME
329±95
328±91
C5b～9+L-NAME
485±121
537±220
*P<0.05，vs control group;ΔP<0.05,vs C5b～9+L-NAME group讨 论
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补体复合物是补体活化后最终形成的效应单位。兔红细胞表面缺乏C3b受体，它与异种血清接触后可活化补体旁路途径导致兔红细胞溶解。利用这一特性通过生化手段能获得较纯的C5b～9复合物，这在本次实验中得到证实。已知补体介导的反应存在着同源限制性，即种属相同的补体与细胞反应时效率极低，这与细胞表面存在着同源限制因子(homologous restriction factor, HRF)有关[7]，本实验用人血清C5b～9复合物作用大鼠的肾小球MC，排除了HRF对补体刺激效应的干扰。
肾脏炎症时，由于免疫复合物等因素可使补体激活最终形成攻膜成分即C5b～9复合物而导致细胞损伤。新近研究发现：系膜增生性肾炎具有补体依赖性[8]。肾小球系膜区C5b～9复合物能够作为MC的激活剂，刺激MC释放多种介质及细胞因子等，但并不造成细胞损伤，故有人将此C5b～9称为亚溶解剂量的C5b～9复合物[9]。
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NO作为一种亲脂性分子，在肾细胞生理功能及病理反应中起着一定的作用[1]。目前已知，肾小球细胞内存在着两种NO合酶(nitric oxide synthase,NOS)即结构型NOS和诱生型NOS，后者在有刺激剂存在时，迅速催化底物合成NO。NO半衰期极短，在氧参与下生成二氧化氮，二氧化氮在液体中可转变成NO-3和NO-2。另一方面，NO受体还与鸟苷酸环化酶相连，NO与其受体结合后可激活此酶，产生cGMP，导致胞内cGMP含量升高。根据这一原理，本实验以人C5b～9复合物为刺激因子，利用NO产物NO-3/NO-2和细胞内cGMP含量作为检测指标，观察其对大鼠肾MC产生NO的影响。结果表明，用C5b～9复合物处理的MC其培养上清液中NO-3/NO-2含量在6 h时开始上升，24 h达到高峰，48 h时仍处于较高水平，与对照组相比有显著差异，与C5b～9+L-NAME(NOS抑制剂)组相比也有明显差别。此外，放射免疫测定表明，用C5b～9复合物刺激培养的MC 24 h时细胞内cGMP水平明显上升；与对照组和C5b～9加L-NAME组相比，差异均较显著，在刺激48 h时后胞内cGMP水平仍高于对照组。但与C5b～9+L-NAME组相比，差异已无显著性。综合实验结果表明，一定剂量的C5b～9复合物刺激能使大鼠肾MC合成的NO量增高。由于C5b～9复合物插入细胞膜能介导多种信号传递，促进炎症介质及细胞因子如TNF-α的释放，而TNF-α也可促进细胞合成NO[2]。本文已证实，C5b～9复合物作为始动因素能诱导MC合成NO，但这一作用究竟是C5b～9复合物的直接刺激还是细胞因子的间接效应？还是两者均有作用？仍有待进一步研究。
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[基金项目] 江苏省及省卫生厅自然科学基金资助
[参 考 文 献]
[1] Klahr S. Renal disease:the two faces of nitric oxide [J]. Lab Invest,1995,72:1～3.
[2] Raij L, Baylis C. Glomerular actions of nitric oxide [J].Kidney Int,1995,48:20～32.
[3] Lovett DH, Haensch GM, Goppelt M,&127;et al.&127;Activation of glomerular mesangial cells by the terminal membrane attack complex of complement [J]. J Immunol, 1987,138(8):2473～2480.
, http://www.100md.com
[4] 王迎伟，何球藻. 补体C5b～9复合物介导肾小球细胞炎性损伤的研 究进展 [J]. 国外医学免疫学分册，1999,22(2):71～74.
[5] Bhakdi S, Tranum-jensen J. Terminal membrane C5b～9 complex of human complement:Transition from an amphiphilic to a hydrophilic state through binding of the S protein from serum [J]. J Cell Biol,1982,94:755～759.
[6] 王迎伟，杜文平. Dot-IGSS和Dot-ELISA法检测GBM-Ab和Tub-Ab的比较研究 [J]. 基础医学与临床, 1998,18(1):27～30.
, http://www.100md.com [7] 张页，周凤兰. 补体介导溶细胞反应的同种限制现象及其产生机制 [J].生理科学进展，1991,22(3):231～234.
[8] Brandt J, Pippin J, Schulze M, et al. Role of the complement membrane attack complex C5b～9 in mediating experimental mesangioproliferative glomerulonephritis [J]. Kidney Int, 1996, 49:335～343.
[9] Schonermark M, Deppisch R, Rideasch G, et al. Induction of mediator release from human glomerular mesangial cells by the terminal complement components C5b～9 [J]. Int&127;Arch Allergy Appl Immunol, 1991,96:331～335.
[收稿日期]1999-01-08 [修回日期]1999-04-30
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单位：王迎伟 汤仁仙 高丰光(江苏徐州医学院免疫学教研室， 江苏 徐州 221002)；何球藻 秦慧莲(上海医科大学免疫学教研室，上海)；张光毅(徐州医学院生化教研室，江苏 徐州)
关键词：补体膜攻击复合物；肾小球膜； 细胞；一氧化氮；大鼠
中国病理生理杂志000319
[摘 要] 目的：探讨人补体 C5b～9复合物对大鼠肾小球系膜细胞(MC)合成一氧化氮(NO)的影响。方法：首先提取人补体C5b～9复合物，同时培养出大鼠肾小球MC。然后用C5b～9复合物刺激MC，观察刺激后6 h、24 h、和48 h培养上清液中NO代谢产物-硝酸根(NO-3)和亚硝酸根(NO2)量的变化，并测定刺激后24 h、48 h时MC内环鸟苷酸(cGMP)的水平。结果：用人C5b～9复合物刺激大鼠MC后可致培养上清中NO3/NO2含量增加，细胞内cGMP水平上升。NO合成增多能够被NO合酶(NOS)抑制剂—─-NG-硝基-L-精氨酸甲基酯(L-NAME)所抑制。结论：人C5b～9复合物能够增加大鼠肾MC 的NO合成。
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[中图分类号] R692.3 [文献标识码] A
[文章编号] 1000-4718(2000)03-0262-04
The effect of human complement C5b～9 complex on nitric oxide synthesis in glomerular mesangial cells of rats
WANG Ying-wei, HE Qiu-zao, QIN Hui-lian, TANG Ren-xian, GAO Feng-guang, ZHANG Guang-yi
(Dept of Immunology, Xuzhou Medical College, Xuzhou 221002, China)
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[Abstract] AIM：To study the effect of human complement C5b～9 complex on nitric oxide(NO) synthesis of glomerular mesangial cells (MC). METHODS: First, the human complement C5b～9 complexes were isolated and glomerular MC of rats were cultured. Second, the MC were stimulated with C5b～9 complex and changes of metabolism products of NO(NO3 and NO2) in MC culture supernatant at 6,24 and 48 hours after C5b～9 stimulating were detected. Moreover, cGMP levels in cultured MC were also measured. RESULTS： NO3/NO2 contents from culture supernatant and cGMP levels in MC were increased parallelly after C5b～9 complex stimulation. Further, NO synthesis was inhibited by L-NG-nitro-arginine-methylester(L-NAME). CONCLUSION： NO synthesis of rat glomerular MC was incerased by human complement C5b～9 stimulation.
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[MeSH] Complement membrane attack complex; Glomerular mesangium; Cells; Nitric oxide; Rats
近年来对一氧化氮(nitric oxide， NO)参与机体组织功能的变化日益为人们所关注[1]。肾小球炎症时，NO合成的增加不仅可以改变肾小球的滤过率，而且还可引发肾细胞的病理损伤。已有资料表明，肾炎时肾内NO合成的增多与某些刺激因子如细菌脂多糖，肿瘤坏死因子α(tumour necrosis factor α，TNF-α)等作用密切相关[2]。另有实验证实，补体C5b～9复合物可作为肾细胞有效的刺激剂。亚溶量的C5b～9复合物能够插入细胞膜磷脂双层，参与细胞信号传导并激活细胞多种代谢途径，致使炎性介质释放，蛋白酶活化及代谢产物的堆积等[3，4]。本文利用提取的人补体C5b～9复合物作为刺激因子，观察它对体外培养的大鼠肾小球系膜细胞(mesangial cell,MC)合成NO的影响。
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材 料 和 方 法
一、主要材料
健康人血清由徐州市中心血站健康B型献血员提供。小牛血清购自南京卫岗血清厂。Ⅳ型胶原酶、牛胰岛素、L-精氨酸、L-NAME及3-异丁-甲基黄嘌呤(3-isobuthyl-1-methylxanthine，IBMX)均属Sigma公司产品。RPMI 1640干粉购自GIBCO公司。单克隆抗结蛋白、肌动蛋白、细胞角蛋白及第Ⅷ因子抗体为DAKO公司产品。多克隆抗人C3、C5和C9抗体及ABC法染色试剂购自上海生物制品研究所，多克隆抗人C5b～9复合物及C5b～9标准抗原由中国医学科学院基础所生化室提供。NO-3/NO-2测定试剂盒由南京建成生物工程研究所供应。[3H]-cGMP放免试剂盒来源于中国原子能研究院。SD大鼠及长耳白兔由徐州医学院实验动物中心提供。
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二、实验方法
1.人补体C5b～9复合物的提取 取新鲜正常人血清300 mL加入等体积10%的兔红细胞悬液，37℃水浴至兔红细胞全部溶血，离心洗涤沉淀的兔红细胞膜，再用10%脱氧胆酸钠溶解。样品经不同梯度蔗糖超速离心180?000×g 3 h后分段分管收集。各管液体先行电镜负染法检查提取物，再分别用抗人C3、C5、C9及抗人C5b～9复合物抗体进行斑点ELISA(Dot-ELISA)法鉴定。鉴定后的人补体C5b～9复合物经透析和超滤浓缩后按Lowry法测定蛋白量，-20℃保存。具体步骤参见文献[5，6]。
2.大鼠肾MC的培养与鉴定 取SD大鼠5只，雌性，体重150～200 g，乙醚麻醉后经胸主动脉插管用冷Hanks液灌洗双肾，剪取的肾皮质经50目、100目及200目不锈钢筛网分离收获肾小球，然后加入Ⅳ型胶原酶消化20 min。消化后的肾小球置于完全营养液(RPMI 1640+20%小牛血清+0.66 U/mL胰岛素)37℃ 5% CO2孵箱中培养。培养各期的MC用倒置显微镜、光镜、电镜作常规检查。原代培养2周及传代培养1周的MC以单克隆抗结蛋白、肌动蛋白、角蛋白及第VIII因子抗体为一抗，行常规ABC法染色鉴定。
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3. C5b～9复合物刺激剂量的确定及MC的分组处理 原代培养3周的MC配成1×105/mL悬液后转种24孔培养板。传代第3 d将培养液换成不含酚红液的RPMI 1640营养液(添加10%小牛血清及1 mmol/L精氨酸)培养24 h。然后取1块24孔培养板按不同浓度加入C5b～9复合物(1μg、10μg、20μg、40μg及80μg/mL)静置培养24 h，分别收集各孔的培养上清液用NO测定试剂盒测定NO3/NO2含量，根据NO3/NO2量确定C5b～9复合物刺激的最佳剂量(注：此次以40μg/mL C5b～9复合物刺激效果最好)。其余培养板中的MC分别作如下处理：(1)C5b～9组：每孔加含C5b～9复合物40μg/mL的营养液1 mL。(2)L-NAME组：每孔加入含2 mmol/L的 L-NAME营养液1 mL。(3)C5b～9+L-NAME组：每孔中加入含C5b～9复合物40μg/mL及含2 mmol/L的L-NAME营养液1 mL。(4)对照组：每孔仅加营养液1 mL。各组均设6个复孔。
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4. 检测指标 (1)NO3/NO2含量：上述分组处理的各孔培养的MC继续培养6 h、24 h、48 h后分别收集其培养上清液用硝酸还原酶法测定上清液中NO3/NO2的浓度。结果以μmol/L表示。(2)cGMP水平 分组处理同前所述，但各组所用的试剂中再加入终浓度为0.5 mmol/L IBMX，培养24 h和48 h后弃去营养液，细胞用生理盐水洗涤2次。留于孔内的细胞再用5%冷三氯醋酸处理1h。样品吸出后三氯醋酸经水饱和乙醚抽提4次除去。各组样品用[3H]-cGMP放免分析试剂盒测定其cGMP含量。孔内的MC蛋白经1%SDS溶解过夜，Lowry法定蛋白含量。最后以所测各孔cGMP值除以各孔MC蛋白量进行计算，结果以pmol/mg蛋白表示。
三、统计分析
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所得数据用
±s表示，均数差异显著性用计算机PEMS软件检验判断。结 果
一、人C5b～9复合物的鉴定
抽提的人C5b～9复合物样品经不同梯度蔗糖超速离心后可见离心管中上部有一乳白色的致密环，电镜负染显示该致密物中主要是一些呈空心环状、γ形或π样的结构，这与国外文献报道的结果基本一致。另用Dot-ELISA法检测表明，提取的人C5b～9复合物经抗人C5、C9和C5b～9抗体染色均呈阳性，而用抗人C3染色呈阴性反应。
二、肾小球MC的培养
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倒置显微镜观察发现，经三道筛网分离的肾小球纯度达90%以上。原代培养4～6天肾小球多已贴壁。最初从肾小球中长出的细胞含有圆形或卵圆形的上皮细胞，2周后上皮细胞渐渐死亡，残留的MC多呈星形，梭形或不规则状。HE染色镜检MC形态有不规则突起。培养的MC电镜下可见富含微丝结构。原代培养2周后或传代培养的MC经免疫组化染色显示胞浆内结蛋白，肌动蛋白呈阳性，而细胞角蛋白(上皮细胞含有)，第Ⅷ因子(内皮细胞含有)呈阴性。由此排除了上皮细胞及内皮细胞混杂生长的可能性。
三、C5b～9复合物对MC产生NO-3/NO-2的影响
培养的MC用不同剂量人C5b～9复合物刺激24h时取各孔培养上清液测定NO-3/NO-2含量，与不加任何刺激物的对照组相比，差异以40μg/mL、80μg/mL C5b～9用量效果最为显著(P<0.01)，见表1。故在以后的实验中以40μg/mL C5b～9复合物作为刺激剂量，按方法3分组检测传代培养的MC经6 h、24 h和48 h培养后其上清液中的NO-3/NO-2含量变化，结果见表2。
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四、C5b～9复合物刺激对MC细胞内cGMP的影响
以剂量为40μg/mL的C5b～9复合物刺激，传代培养的MC按表3分组处理后经24 h、48 h时分别取样测定MC胞内cGMP含量，结果列于表3。
表1 不同浓度的C5b～9复合物刺激MC 24 h后其培养
上清液中NO3/NO2浓度的变化
Tab 1 Concentration changes of NO3/NO2 in culture
supernatant from MC stimulated for 24h with various dose
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of human C5b～9 complexes(
±s,n=4) C5b～9 dose(μg/mL)NO-3/NO-2(μmol/L)
0(Control)
27.55±4.01
1
25.16±3.46
10
30.74±3.95
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20
36.92±4.52*
40
49.68±7.75**
80
67.23±8.09**
*P<0.05,**P<0.01，vs control group表2 C5b～9复合物对MC生成NO-3/NO-2的影响
Tab 2 Effect of C5b～9 complex on NO-3/NO-2 production from MC (
±s, n=6) Group, http://www.100md.com
NO-3/NO-2(μmol/L)
6 h
24 h
48 h
Control
28.16±4.56
28.16±4.34
27.93±4.56
C5b～9
36.34+5.37*
, http://www.100md.com
50.08±13.11**ΔΔ
46.61±13.82**Δ
L-NAME
27.93±3.51
28.55±2.98
26.85±5.21
C5b～9+L-NAME
32.80±7.16
30.02±3.97
31.79±4.10
, http://www.100md.com *P<0.05，**P<0.01，vs control group；ΔP<0.05，ΔΔP<0.01, vs C5b～9+L-NAME group表3 C5b～9复合物对MC内cGMP的影响
Tab 3 Effect C5b～9 complex on cGMP level in MC(
±s,n=6) GroupLevel of cGMP (pmol/mg protein)
24 h
48 h
Control
380±121
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445±114
C5b～9
1043±513*Δ
851±316*
L-NAME
329±95
328±91
C5b～9+L-NAME
485±121
537±220
*P<0.05，vs control group;ΔP<0.05,vs C5b～9+L-NAME group讨 论
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补体复合物是补体活化后最终形成的效应单位。兔红细胞表面缺乏C3b受体，它与异种血清接触后可活化补体旁路途径导致兔红细胞溶解。利用这一特性通过生化手段能获得较纯的C5b～9复合物，这在本次实验中得到证实。已知补体介导的反应存在着同源限制性，即种属相同的补体与细胞反应时效率极低，这与细胞表面存在着同源限制因子(homologous restriction factor, HRF)有关[7]，本实验用人血清C5b～9复合物作用大鼠的肾小球MC，排除了HRF对补体刺激效应的干扰。
肾脏炎症时，由于免疫复合物等因素可使补体激活最终形成攻膜成分即C5b～9复合物而导致细胞损伤。新近研究发现：系膜增生性肾炎具有补体依赖性[8]。肾小球系膜区C5b～9复合物能够作为MC的激活剂，刺激MC释放多种介质及细胞因子等，但并不造成细胞损伤，故有人将此C5b～9称为亚溶解剂量的C5b～9复合物[9]。
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NO作为一种亲脂性分子，在肾细胞生理功能及病理反应中起着一定的作用[1]。目前已知，肾小球细胞内存在着两种NO合酶(nitric oxide synthase,NOS)即结构型NOS和诱生型NOS，后者在有刺激剂存在时，迅速催化底物合成NO。NO半衰期极短，在氧参与下生成二氧化氮，二氧化氮在液体中可转变成NO-3和NO-2。另一方面，NO受体还与鸟苷酸环化酶相连，NO与其受体结合后可激活此酶，产生cGMP，导致胞内cGMP含量升高。根据这一原理，本实验以人C5b～9复合物为刺激因子，利用NO产物NO-3/NO-2和细胞内cGMP含量作为检测指标，观察其对大鼠肾MC产生NO的影响。结果表明，用C5b～9复合物处理的MC其培养上清液中NO-3/NO-2含量在6 h时开始上升，24 h达到高峰，48 h时仍处于较高水平，与对照组相比有显著差异，与C5b～9+L-NAME(NOS抑制剂)组相比也有明显差别。此外，放射免疫测定表明，用C5b～9复合物刺激培养的MC 24 h时细胞内cGMP水平明显上升；与对照组和C5b～9加L-NAME组相比，差异均较显著，在刺激48 h时后胞内cGMP水平仍高于对照组。但与C5b～9+L-NAME组相比，差异已无显著性。综合实验结果表明，一定剂量的C5b～9复合物刺激能使大鼠肾MC合成的NO量增高。由于C5b～9复合物插入细胞膜能介导多种信号传递，促进炎症介质及细胞因子如TNF-α的释放，而TNF-α也可促进细胞合成NO[2]。本文已证实，C5b～9复合物作为始动因素能诱导MC合成NO，但这一作用究竟是C5b～9复合物的直接刺激还是细胞因子的间接效应？还是两者均有作用？仍有待进一步研究。
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[基金项目] 江苏省及省卫生厅自然科学基金资助
[参 考 文 献]
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[收稿日期]1999-01-08 [修回日期]1999-04-30
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