噬菌体表面表达随机8肽文库的构建
作者：王华 刘革修 张彤 黄红林 廖端芳
单位：王华(华西医科大学病理教研室， 四川 成都 610044)；刘革修 张彤 黄红林 廖端芳(衡阳医学院药理教研室，湖南 衡阳 421001)
关键词：噬菌体；肽类
中国病理生理杂志000314
[摘 要] 目的：构建噬菌体表面表达随机8肽文库；方法：采用人工合成随机寡核苷酸、基因重组技术，噬菌体表面表达技术等，构建该文库；采用多聚酶链式反应技术、核酸杂交技术和测序分析评价鉴定。多聚酶链式反应所采用的上游引物包括载体克隆位点处部分碱基和部分外源基因的碱基；在核酸杂交中设计了噬菌体载体克隆位点互补探针,以更加准确地排除无外源基因插入的克隆；在测序鉴定中，选择了2个混合探针杂交阳性的克隆。结果：以上证实获得独特克隆为2.1×108；亲和富集实验证实所建噬菌体文库可以稳定扩展。结论：我们成功地构建了噬菌体随机8肽文库,其库容量为2.1×108。
, 百拇医药
[中图分类号] Q782；Q343 [文献标识码] A
[文章编号] 1000-4718(2000)03-0243-04
Construction of phage random eight-peptide library
LIU Ge-xiu，WANG Hua, ZHANG Tong, Huang Hong-lin, LIAO Duan-fang
( Department of Pharmacology, Hengyang Medical College, Hengyang 421001, China)
[Abstract] AIM: To construct random eight-peptide library for the study on atherosclerosis and restenosis. METHODS and RESULTS: Random oligodeoxynucleotides encoded eight peptides were synthesized and amplified by polymerase chain reaction(PCR). The product was cloned into phage surface display vector fUSE5 in Sfi I site and electroporated into competent MC1061. The library was identified through PCR, hybridization, DNA sequencing and affinity biopanning of streptavidin. Because the upstream primer is complementary to part vector clone site sequences and part exogenous gene sequences, and the other one complementary to pIII gene of vector, thus only clones inserted exogenous gene could be amplified easily. Additionally we used the probe oligodeoxynucleotide complementary to vector clone site sequences to identify clones which were not inserted exogeneous genes. Furthermore, two hybridizing positive clones were sequenced. Their sequences are consistent with two oligodeoxynucleotide probe sequences. As a result, 2.1×108 special clones were obtained. Affinity biopanning proved that the libraries could be amplified steadily. CONCLUSION: The eight-peptide library is reliable.
, 百拇医药
[MeSH] Phages; Peptides
噬菌体表面表达技术(phage display techniques, PDT)[1]是以改建的噬菌体为载体，把外源基因插入噬菌体外壳蛋白质基因，以使表达的外源肽或蛋白质显露在噬菌体的表面，并保持其空间构象，通过亲和免疫吸附法筛选出特异表达肽或蛋白质的新技术。目前国外成功地构建了不同大小的肽文库、抗体文库、蛋白质文库，并筛选出了比现有活性物质功能更好的新型分子[2～4]。结合该技术开展心血管疾病药物筛选研究仍处于起步阶段，但是其应用前景令人关注:特异结合抗纤溶酶原激活物抑制剂[5],组织纤溶酶原激活剂和尿激酶型纤溶酶原激活剂抑制物的筛选[6], 血小板膜受体的拮抗剂的筛选[7]，抑制血小板凝聚的短肽[8]的研究。上述这些研究其潜在的药物开发价值是显而易见的。而国内目前无这方面的报道。本文构建噬菌体8肽随机文库旨在为今后开展动脉粥样硬化和再狭窄研究，特别是其标志物和治疗药物的筛选研究打下基础。
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材 料 和 方 法
一、菌株和载体
K 91、MC1061受体菌和噬菌体载体fUSE 5由中国预防医学科学院病毒研究所张英博士和李爱民博士惠赠。
二、酶和试剂
非放射性寡核苷酸3标记试剂盒为Boehringer Mannheim公司产品。限制性内切酶、T4 DNA连接酶、琼脂糖为Promega公司产品，多聚酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)试剂为上海生物工程公司产品，氯仿、乙醇等均为国产分析纯产品，DNA序列分析试剂盒为美国应用生物系统公司产品。
三、DNA合成与纯化
含编码8肽DNA序列为5CATTCTCACTCGGCC
, 百拇医药
GACGGGGCT(NNK)8GGGGCCGCTGGGGCCGAAACTGTTGAA 3，其中N代表A、T、C、G四种碱基，K代表G、T两种碱基，(NNK)8为编码随机8肽部分，划线部分为BglI识别序列。用于扩增8肽随机DNA片段引物：P815CTATTCTCACTCGGCCGACG 3和P825GACCCCGGCTTTGACAACTT 3；测序引物5 TGAATTTTCTGTATGAGG 3, 鉴定引物P83包括载体克隆位点处部分碱基和部分外源基因的碱基(带有*标记的碱基)：5CTATTCTCACTCGGCCGACGG* 3；下游引物P84：5GATGATACAGGAGTGTACTGGTAA
3’，对应载体pⅢ基因。均为上海生物工程公司产品(HPLC纯)。
四、感受态菌的制备
, 百拇医药
取新鲜复活K91、MC1061菌1 mL接种于含链霉素(100μg/mL)的LB培养基250 mL，剧摇3 h，低温低速离心，等体积冰预冷的HEPES液洗涤菌体2次，再用10 mL预冷的10%甘油洗1次，最后用500μL 10%甘油悬浮菌体，分装后置-70℃保存备用。
五、PCR扩增及文库构建[4]
每100μL PCR反应液含1.5 mol/L MgCl2、50μmol/L dNTP、1单位Taq酶、引物各2.5 pmol；扩增反应进行5个循环：95℃ 1.5 min、55℃ 2 min、72℃ 1 min。纯化扩增产物、BglⅠ酶切后，插入fUSE5的SfiI位点，电转化MC 1061菌。转化混合物直接铺含四环素(20 μg/mL)和链霉素(100 μg/mL)平板，明确转化克隆数量。在相同条件下，把电转化混合物先在含1.0 μg/mL四环素的LB液体中扩增1 h后，再使四环素的浓度升至20 μg/mL继续扩增12～16 h，提取噬菌体，即噬菌体8肽原库。
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六、寡核苷酸DNA探针的末端标记与核酸杂交
11种寡核苷酸DNA片段(见表1)，其中P-mcs为与fUSE5载体克隆位点互补的片段。由上海生物工程公司合成。菌落影印原位杂交实验操作见《分子克隆实验指南》(金冬雁译，科学技术出版社，第2版)和Boehringer Mannheim公司试剂盒所附操作规程进行。
七、DNA序列分析
按美国应用生物系统公司Tag测序试剂盒说明书在373A DNA自动序列测序仪上测序。
八、转染单位的测定和亲和素富集筛选
即为每毫升噬菌体感染宿主菌形成的具有侵染能力的菌落单位。对8肽扩增库做连续10倍稀释后加顶层琼脂，迅速直接铺(20 μg/mL)四环素平板，培养16 h，计数形成的菌落。亲和素富集是以亲和素包被聚苯乙烯板，加扩增的8肽库作用3 h，用TBS缓冲液洗板10次，每次2 min，再用洗脱液(pH 2.2,甘氨酸-盐酸液)洗下结合物，用1 mol/L Tris-HCl(pH 9.1)恢复洗脱物pH为7.0，再行扩增。如此反复进行3轮，每轮用亲和素筛选8肽库前后均测定转染单位，以评定亲和素富集肽库的效率。
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结 果
一、噬菌体随机8肽文库的构建及鉴定
(一)PCR鉴定 随机挑取18个噬菌体单克隆，提取载体DNA为扩增模板，采用PCR对不同的样品进行扩增。扩增产物经电泳分析，均见到预计大小的扩增片段533 bp(见图1)。此结果证实获得的噬菌体克隆中已插入编码8肽的DNA片段。
(二)杂交鉴定 如表1所示，采用3′末端标记，将fUSE5载体克隆位点互补P-mcs探针和10种寡核苷酸混合探针分别与构建的噬菌体8肽文库杂交。结果混合探针与噬菌体8肽原库和不同批次扩增肽文库抽提的DNA均发生特异性杂交，而与设立的fUSE5载体没有发生杂交，P-mcs探针与噬菌体8肽原库和不同批次扩增肽文库抽提的DNA极少发生特异性杂交，而与设立的fUSE5载体发生特异杂交。
(三)测序鉴定 提取2个混合探针杂交阳性的克隆和10个随机克隆单链DNA，测序，结果混合探针杂交阳性的2个克隆的序列与2条寡核苷酸探针序列一致：8 PDT-117与探针probe 3互补，8 PDT-937与probe 9互补。随机克隆的序列相互不同且与前2个序列也不同，插入片段读框正确(见表2)。
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Fig 1 Random eight-peptide library identified by PCR
Lane 1：Amplification of fUSE5 vector DNA using primer P81 and P84
Lane 2：Amplification of fUSE5 vector DNA using primer P83 and P84
Lane 3～21：PCR amplification of single clones using P83 and P84
M.pGEM-7Zf(+)/Hae Ⅲ DNA marker
图1 PCR法鉴定噬菌体随机8肽文库
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表1 11种寡核苷酸探针序列
Tab 1 11 Different probe sequences of oligodeoxynucleotides No
Sequences of ODNs
Base
1
5ACG GTT CTT TGG CAG GCG 3’
18
2
5TTG CGG CGT GGT CAT GCT 3’
18
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*3
5CGT AGG CGG CAT CAG CAT 3’
18
4
5GCT CGT CGG AAG CTT CAG 3’
18
5
5CAG CGT ACG AGT CTG ACG 3’
18
6
5TGG AGG ACT TGT CTG ACG 3’
, 百拇医药
18
7
5AAT AGG ACG CCG CTG TGT 3’
18
8
5GTT GCT AAT CCG CAG TGG 3’
18
#9
5GCT GCG TCG GAT CAT GAG 3’
18
10
5ATG TCT TGT AAG CAG GGT 3’
, 百拇医药
18
Pmsc
5GACGTGGCCTGGCCTCTGGGG 3’
21
表2 随机8肽文库中12个克隆的测序结果
Tab 2 Sequences of various clones in random
eight-peptide library Clone
Sequences
8PDT-1
5ATC CTT CAG AAG CCT AGC AAT CTC3’
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8PDT-2
5AGT AAG CTG AAT CGT CGT ACG CTT3’
8PDT-3
5CTG CGG CAG CTT CGT CAC AAG ATG3’
8PDT-4
5CGT ACG CTG AGC CGG ATC ATG CGT3’
8PDT-5
5CGT CTG AGT CTA CAG CCT CCC ATG3’
8PDT-6
5AGT AAG CGT ACC ATG CAC AGT GCT3’
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8PDT-7
5ACT AGT CAG AAC AGC CTT CCT ACG3’
8PDT-8
5CTG CAT CAC AGG CTA ACT CCG CCT3’
8PDT-9
5AAC CGG ACT AAG AGC AGT ATA CGG3’
8PDT-10
5AGG ACC ACT CAT ATA AAG TGTCTG3’
*8PDT-117
5CGA CAC ATG CTG ATG CCGCCTACG3’
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#8PDT-937
5CAC CGT CTC ATG ATC CGACGCAGC3’
(四)转染单位的测定和亲和素富集筛选评定 为了评定8肽随机文库容量，对8肽扩增库做连续10倍稀释后加顶层琼脂，迅速直接铺(20 μg/mL)四环素平板，培养16 h后，计数并计算得4.3×109菌落。用亲和素作为靶分子，以评定靶分子与构建文库的结合效率。实验以不同浓度的亲和素(0.1～0.001μg/mL)包被聚苯乙烯板，再直接加一定量扩增的8肽库，洗脱与亲和素作用的结合物再进行扩增，如上连续进行3轮亲和筛选，经每轮筛选，8肽库容量下降103～104个单位，经过3轮亲和素筛选的扩增物基本稳定在1010。
三、噬菌体8肽随机克隆的增殖特性
, 百拇医药 取8肽原库10 μL转染K91菌，原库中噬菌体能侵染K91菌，并形成大量的噬菌体病毒粒子，再用扩增6肽库菌液和提取的噬菌体转染K91菌仍能侵染K91菌。即使高倍稀释(108、1010)扩增物仍保持侵染K91菌的能力。为进一步证实原库在体外增殖的稳定性，实验又用8肽原库一代扩增噬菌体连续传代3次，结果传代扩增物均能在含四环素抗性的LB液体中稳定增殖，每次扩增库容量以转染单位评定，均稳定在1.0～1.9×1010。讨 论
大量的研究结果表明，噬菌体随机肽文库的容量、广谱性以及稳定性是衡量肽文库成功构建的重要指标。影响肽文库容量的因素主要有：转化的效率、随机DNA合成的质量、随机DNA的克隆以及引入的酶切位点等。肽文库构建的成功与否，关键的因素取决于获得的噬菌体独特克隆的数目。以构建6肽库而言，由于编码6肽DNA的随机性，即约109(326)个不同的DNA序列，编码大约0.64×108(206)种的氨基酸序列，按理论值计算至少要获得约10亿个左右的独立克隆，考虑到密码子的简并性以及转化效率等因素的影响，实际实验所获得的独立克隆一般为107～109。Scott等[4]首先成功地构建了6肽库，其库容量为2.0×108，显然小于理论计算值的。虽然这样，国外也有构建更长肽数的随机肽文库，结果也筛选到他们所需要的克隆。转化方法直接影响获得的克隆数量。电转化是现有转化方法中效率最高者。故我们采用电转化技术构建了随机8肽文库，以增加文库容量。现有评定方法有：计数转染后克隆数、限制性内切酶、PCR扩增鉴定、杂交和测序鉴定以及亲和富集评定。Cwirla等[9]全面地阐明了序列测定是评定肽文库容量的重要指标。为了证实构建的8肽文库的容量，我们从以下几个方面验证。首先，计数连接物电转化后实际获得的克隆数，结果为2.1×108，其次，结合限制性内切酶、PCR扩增鉴定、杂交和测序鉴定以及亲和富集评定证实了8肽文库的容量。更重要的是我们在现有的方法中作了一些改进：一是PCR鉴定，因插入片段仅为39 bp且随机,酶切电泳鉴定有一定的局限性，我们的PCR扩增上游引物选定在包括载体克隆位点处部分碱基和部分外源基因的碱基位置；下游引物对应载体，扩增长度为533 bp，这样便于扩增和电泳检测。结果8肽文库中的克隆DNA均扩增出预计大小的扩增片段，证实获得的噬菌体克隆中已插入编码8肽的DNA片段。二是探针杂交方法，为了更好地评定肽文库容量，我们设计了一个噬菌体表面表达载体克隆位点互补探针。此探针可以更加准确地排除无外源基因插入的克隆。结果混合探针与噬菌体8肽原库和不同批次扩增肽文库抽提的DNA均发生特异性杂交，而与设立的fUSE5载体以及野生型噬菌体f1均没有发生杂交，P-mcs探针与噬菌体8肽原库和不同批次扩增肽文库抽提的DNA均没有发生特异性杂交，而与设立的fUSE5载体发生特异杂交。此结果又强有力的证实了8肽文库的容量。三是在测序鉴定中，我们选择了2个混合探针杂交阳性的克隆和10个随机克隆进行测序分析，结果混合探针杂交阳性的2个克隆的序列分别与2个合成的寡核苷酸探针序列一致，10个随机克隆的序列相互不同且与前2个序列也不同。由此证实构成8肽文库的克隆的插入序列是编码不同8肽的DNA随机片段。总之，成功地构建了噬菌体随机8肽文库。这为今后开展动脉粥样硬化和再狭窄研究，特别是其标志物和治疗药物的筛选研究打下基础。
, 百拇医药
[参 考 文 献]
[1] Wilson DR, Finlay BB. Phage display: applications, innovations, and issues in phage and host biology [J]. Can J Microbiol， 1998，44(4):313～329.
[2] Rodi DJ, Makowski L. Phage-display technology-finding a needle in a vast molecular haystack [J]. Curr Opin Biotechnol，1999，10(1):87～93.
[3] Arap W, Pasqualini R, Ruoslahti E. Cancer treatment by targeted drug delivery to tumor vasculature in a mouse model [J]. Science，1998，279(5349):377～380.
, 百拇医药
[4] Scott JK,Smith GP. Searching for peptide ligands with an epitope library [J]. Science，1990，249:386～390.
[5] Pannckock H, van Meijer M, Schleef RR,et al. Functional display of human plasminogen-activator inhibitor (PAI-1) on phages:novel perspectives for structure-function analysis by error-prone DNA synthesis[J]. Gene，1993，128:135～140.
[6] Wang VI, Yang Q, Craik CS. Isolation of a high affinity inhibitor of uPA by phage display of ecotion [J]. Protein Eng，1995，8:84～90.
, 百拇医药
[7] ONeil KT, Hoess RH, Jakson SA, et al. Identification of novel peptide antagonists for GPIIb/IIIa from a conformationally constrianed phage peptide library [J]. Proteins，1992，14:509～515.
[8] Doorbar J, Winter G. Isolation of a peptide antagonist to the thrombin receptor using phage display [J]. J Mol Biol, 1994, 244:361～369.
[9] Cwirla SE, Peters EA, Barret RW, et al. Peptide on phage: A vast library of peptide for identifying ligands [J]. Proc Natl Acad Sci USA，1990，87:6378～6382.
[收稿日期] 1999-02-26 [修回日期] 1999-09-03
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单位：王华(华西医科大学病理教研室， 四川 成都 610044)；刘革修 张彤 黄红林 廖端芳(衡阳医学院药理教研室，湖南 衡阳 421001)
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[摘 要] 目的：构建噬菌体表面表达随机8肽文库；方法：采用人工合成随机寡核苷酸、基因重组技术，噬菌体表面表达技术等，构建该文库；采用多聚酶链式反应技术、核酸杂交技术和测序分析评价鉴定。多聚酶链式反应所采用的上游引物包括载体克隆位点处部分碱基和部分外源基因的碱基；在核酸杂交中设计了噬菌体载体克隆位点互补探针,以更加准确地排除无外源基因插入的克隆；在测序鉴定中，选择了2个混合探针杂交阳性的克隆。结果：以上证实获得独特克隆为2.1×108；亲和富集实验证实所建噬菌体文库可以稳定扩展。结论：我们成功地构建了噬菌体随机8肽文库,其库容量为2.1×108。
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[中图分类号] Q782；Q343 [文献标识码] A
[文章编号] 1000-4718(2000)03-0243-04
Construction of phage random eight-peptide library
LIU Ge-xiu，WANG Hua, ZHANG Tong, Huang Hong-lin, LIAO Duan-fang
( Department of Pharmacology, Hengyang Medical College, Hengyang 421001, China)
[Abstract] AIM: To construct random eight-peptide library for the study on atherosclerosis and restenosis. METHODS and RESULTS: Random oligodeoxynucleotides encoded eight peptides were synthesized and amplified by polymerase chain reaction(PCR). The product was cloned into phage surface display vector fUSE5 in Sfi I site and electroporated into competent MC1061. The library was identified through PCR, hybridization, DNA sequencing and affinity biopanning of streptavidin. Because the upstream primer is complementary to part vector clone site sequences and part exogenous gene sequences, and the other one complementary to pIII gene of vector, thus only clones inserted exogenous gene could be amplified easily. Additionally we used the probe oligodeoxynucleotide complementary to vector clone site sequences to identify clones which were not inserted exogeneous genes. Furthermore, two hybridizing positive clones were sequenced. Their sequences are consistent with two oligodeoxynucleotide probe sequences. As a result, 2.1×108 special clones were obtained. Affinity biopanning proved that the libraries could be amplified steadily. CONCLUSION: The eight-peptide library is reliable.
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[MeSH] Phages; Peptides
噬菌体表面表达技术(phage display techniques, PDT)[1]是以改建的噬菌体为载体，把外源基因插入噬菌体外壳蛋白质基因，以使表达的外源肽或蛋白质显露在噬菌体的表面，并保持其空间构象，通过亲和免疫吸附法筛选出特异表达肽或蛋白质的新技术。目前国外成功地构建了不同大小的肽文库、抗体文库、蛋白质文库，并筛选出了比现有活性物质功能更好的新型分子[2～4]。结合该技术开展心血管疾病药物筛选研究仍处于起步阶段，但是其应用前景令人关注:特异结合抗纤溶酶原激活物抑制剂[5],组织纤溶酶原激活剂和尿激酶型纤溶酶原激活剂抑制物的筛选[6], 血小板膜受体的拮抗剂的筛选[7]，抑制血小板凝聚的短肽[8]的研究。上述这些研究其潜在的药物开发价值是显而易见的。而国内目前无这方面的报道。本文构建噬菌体8肽随机文库旨在为今后开展动脉粥样硬化和再狭窄研究，特别是其标志物和治疗药物的筛选研究打下基础。
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材 料 和 方 法
一、菌株和载体
K 91、MC1061受体菌和噬菌体载体fUSE 5由中国预防医学科学院病毒研究所张英博士和李爱民博士惠赠。
二、酶和试剂
非放射性寡核苷酸3标记试剂盒为Boehringer Mannheim公司产品。限制性内切酶、T4 DNA连接酶、琼脂糖为Promega公司产品，多聚酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)试剂为上海生物工程公司产品，氯仿、乙醇等均为国产分析纯产品，DNA序列分析试剂盒为美国应用生物系统公司产品。
三、DNA合成与纯化
含编码8肽DNA序列为5CATTCTCACTCGGCC
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GACGGGGCT(NNK)8GGGGCCGCTGGGGCCGAAACTGTTGAA 3，其中N代表A、T、C、G四种碱基，K代表G、T两种碱基，(NNK)8为编码随机8肽部分，划线部分为BglI识别序列。用于扩增8肽随机DNA片段引物：P815CTATTCTCACTCGGCCGACG 3和P825GACCCCGGCTTTGACAACTT 3；测序引物5 TGAATTTTCTGTATGAGG 3, 鉴定引物P83包括载体克隆位点处部分碱基和部分外源基因的碱基(带有*标记的碱基)：5CTATTCTCACTCGGCCGACGG* 3；下游引物P84：5GATGATACAGGAGTGTACTGGTAA
3’，对应载体pⅢ基因。均为上海生物工程公司产品(HPLC纯)。
四、感受态菌的制备
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取新鲜复活K91、MC1061菌1 mL接种于含链霉素(100μg/mL)的LB培养基250 mL，剧摇3 h，低温低速离心，等体积冰预冷的HEPES液洗涤菌体2次，再用10 mL预冷的10%甘油洗1次，最后用500μL 10%甘油悬浮菌体，分装后置-70℃保存备用。
五、PCR扩增及文库构建[4]
每100μL PCR反应液含1.5 mol/L MgCl2、50μmol/L dNTP、1单位Taq酶、引物各2.5 pmol；扩增反应进行5个循环：95℃ 1.5 min、55℃ 2 min、72℃ 1 min。纯化扩增产物、BglⅠ酶切后，插入fUSE5的SfiI位点，电转化MC 1061菌。转化混合物直接铺含四环素(20 μg/mL)和链霉素(100 μg/mL)平板，明确转化克隆数量。在相同条件下，把电转化混合物先在含1.0 μg/mL四环素的LB液体中扩增1 h后，再使四环素的浓度升至20 μg/mL继续扩增12～16 h，提取噬菌体，即噬菌体8肽原库。
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六、寡核苷酸DNA探针的末端标记与核酸杂交
11种寡核苷酸DNA片段(见表1)，其中P-mcs为与fUSE5载体克隆位点互补的片段。由上海生物工程公司合成。菌落影印原位杂交实验操作见《分子克隆实验指南》(金冬雁译，科学技术出版社，第2版)和Boehringer Mannheim公司试剂盒所附操作规程进行。
七、DNA序列分析
按美国应用生物系统公司Tag测序试剂盒说明书在373A DNA自动序列测序仪上测序。
八、转染单位的测定和亲和素富集筛选
即为每毫升噬菌体感染宿主菌形成的具有侵染能力的菌落单位。对8肽扩增库做连续10倍稀释后加顶层琼脂，迅速直接铺(20 μg/mL)四环素平板，培养16 h，计数形成的菌落。亲和素富集是以亲和素包被聚苯乙烯板，加扩增的8肽库作用3 h，用TBS缓冲液洗板10次，每次2 min，再用洗脱液(pH 2.2,甘氨酸-盐酸液)洗下结合物，用1 mol/L Tris-HCl(pH 9.1)恢复洗脱物pH为7.0，再行扩增。如此反复进行3轮，每轮用亲和素筛选8肽库前后均测定转染单位，以评定亲和素富集肽库的效率。
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结 果
一、噬菌体随机8肽文库的构建及鉴定
(一)PCR鉴定 随机挑取18个噬菌体单克隆，提取载体DNA为扩增模板，采用PCR对不同的样品进行扩增。扩增产物经电泳分析，均见到预计大小的扩增片段533 bp(见图1)。此结果证实获得的噬菌体克隆中已插入编码8肽的DNA片段。
(二)杂交鉴定 如表1所示，采用3′末端标记，将fUSE5载体克隆位点互补P-mcs探针和10种寡核苷酸混合探针分别与构建的噬菌体8肽文库杂交。结果混合探针与噬菌体8肽原库和不同批次扩增肽文库抽提的DNA均发生特异性杂交，而与设立的fUSE5载体没有发生杂交，P-mcs探针与噬菌体8肽原库和不同批次扩增肽文库抽提的DNA极少发生特异性杂交，而与设立的fUSE5载体发生特异杂交。
(三)测序鉴定 提取2个混合探针杂交阳性的克隆和10个随机克隆单链DNA，测序，结果混合探针杂交阳性的2个克隆的序列与2条寡核苷酸探针序列一致：8 PDT-117与探针probe 3互补，8 PDT-937与probe 9互补。随机克隆的序列相互不同且与前2个序列也不同，插入片段读框正确(见表2)。
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Fig 1 Random eight-peptide library identified by PCR
Lane 1：Amplification of fUSE5 vector DNA using primer P81 and P84
Lane 2：Amplification of fUSE5 vector DNA using primer P83 and P84
Lane 3～21：PCR amplification of single clones using P83 and P84
M.pGEM-7Zf(+)/Hae Ⅲ DNA marker
图1 PCR法鉴定噬菌体随机8肽文库
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表1 11种寡核苷酸探针序列
Tab 1 11 Different probe sequences of oligodeoxynucleotides No
Sequences of ODNs
Base
1
5ACG GTT CTT TGG CAG GCG 3’
18
2
5TTG CGG CGT GGT CAT GCT 3’
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*3
5CGT AGG CGG CAT CAG CAT 3’
18
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5GCT CGT CGG AAG CTT CAG 3’
18
5
5CAG CGT ACG AGT CTG ACG 3’
18
6
5TGG AGG ACT TGT CTG ACG 3’
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18
7
5AAT AGG ACG CCG CTG TGT 3’
18
8
5GTT GCT AAT CCG CAG TGG 3’
18
#9
5GCT GCG TCG GAT CAT GAG 3’
18
10
5ATG TCT TGT AAG CAG GGT 3’
, 百拇医药
18
Pmsc
5GACGTGGCCTGGCCTCTGGGG 3’
21
表2 随机8肽文库中12个克隆的测序结果
Tab 2 Sequences of various clones in random
eight-peptide library Clone
Sequences
8PDT-1
5ATC CTT CAG AAG CCT AGC AAT CTC3’
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8PDT-2
5AGT AAG CTG AAT CGT CGT ACG CTT3’
8PDT-3
5CTG CGG CAG CTT CGT CAC AAG ATG3’
8PDT-4
5CGT ACG CTG AGC CGG ATC ATG CGT3’
8PDT-5
5CGT CTG AGT CTA CAG CCT CCC ATG3’
8PDT-6
5AGT AAG CGT ACC ATG CAC AGT GCT3’
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8PDT-7
5ACT AGT CAG AAC AGC CTT CCT ACG3’
8PDT-8
5CTG CAT CAC AGG CTA ACT CCG CCT3’
8PDT-9
5AAC CGG ACT AAG AGC AGT ATA CGG3’
8PDT-10
5AGG ACC ACT CAT ATA AAG TGTCTG3’
*8PDT-117
5CGA CAC ATG CTG ATG CCGCCTACG3’
, 百拇医药
#8PDT-937
5CAC CGT CTC ATG ATC CGACGCAGC3’
(四)转染单位的测定和亲和素富集筛选评定 为了评定8肽随机文库容量，对8肽扩增库做连续10倍稀释后加顶层琼脂，迅速直接铺(20 μg/mL)四环素平板，培养16 h后，计数并计算得4.3×109菌落。用亲和素作为靶分子，以评定靶分子与构建文库的结合效率。实验以不同浓度的亲和素(0.1～0.001μg/mL)包被聚苯乙烯板，再直接加一定量扩增的8肽库，洗脱与亲和素作用的结合物再进行扩增，如上连续进行3轮亲和筛选，经每轮筛选，8肽库容量下降103～104个单位，经过3轮亲和素筛选的扩增物基本稳定在1010。
三、噬菌体8肽随机克隆的增殖特性
, 百拇医药 取8肽原库10 μL转染K91菌，原库中噬菌体能侵染K91菌，并形成大量的噬菌体病毒粒子，再用扩增6肽库菌液和提取的噬菌体转染K91菌仍能侵染K91菌。即使高倍稀释(108、1010)扩增物仍保持侵染K91菌的能力。为进一步证实原库在体外增殖的稳定性，实验又用8肽原库一代扩增噬菌体连续传代3次，结果传代扩增物均能在含四环素抗性的LB液体中稳定增殖，每次扩增库容量以转染单位评定，均稳定在1.0～1.9×1010。讨 论
大量的研究结果表明，噬菌体随机肽文库的容量、广谱性以及稳定性是衡量肽文库成功构建的重要指标。影响肽文库容量的因素主要有：转化的效率、随机DNA合成的质量、随机DNA的克隆以及引入的酶切位点等。肽文库构建的成功与否，关键的因素取决于获得的噬菌体独特克隆的数目。以构建6肽库而言，由于编码6肽DNA的随机性，即约109(326)个不同的DNA序列，编码大约0.64×108(206)种的氨基酸序列，按理论值计算至少要获得约10亿个左右的独立克隆，考虑到密码子的简并性以及转化效率等因素的影响，实际实验所获得的独立克隆一般为107～109。Scott等[4]首先成功地构建了6肽库，其库容量为2.0×108，显然小于理论计算值的。虽然这样，国外也有构建更长肽数的随机肽文库，结果也筛选到他们所需要的克隆。转化方法直接影响获得的克隆数量。电转化是现有转化方法中效率最高者。故我们采用电转化技术构建了随机8肽文库，以增加文库容量。现有评定方法有：计数转染后克隆数、限制性内切酶、PCR扩增鉴定、杂交和测序鉴定以及亲和富集评定。Cwirla等[9]全面地阐明了序列测定是评定肽文库容量的重要指标。为了证实构建的8肽文库的容量，我们从以下几个方面验证。首先，计数连接物电转化后实际获得的克隆数，结果为2.1×108，其次，结合限制性内切酶、PCR扩增鉴定、杂交和测序鉴定以及亲和富集评定证实了8肽文库的容量。更重要的是我们在现有的方法中作了一些改进：一是PCR鉴定，因插入片段仅为39 bp且随机,酶切电泳鉴定有一定的局限性，我们的PCR扩增上游引物选定在包括载体克隆位点处部分碱基和部分外源基因的碱基位置；下游引物对应载体，扩增长度为533 bp，这样便于扩增和电泳检测。结果8肽文库中的克隆DNA均扩增出预计大小的扩增片段，证实获得的噬菌体克隆中已插入编码8肽的DNA片段。二是探针杂交方法，为了更好地评定肽文库容量，我们设计了一个噬菌体表面表达载体克隆位点互补探针。此探针可以更加准确地排除无外源基因插入的克隆。结果混合探针与噬菌体8肽原库和不同批次扩增肽文库抽提的DNA均发生特异性杂交，而与设立的fUSE5载体以及野生型噬菌体f1均没有发生杂交，P-mcs探针与噬菌体8肽原库和不同批次扩增肽文库抽提的DNA均没有发生特异性杂交，而与设立的fUSE5载体发生特异杂交。此结果又强有力的证实了8肽文库的容量。三是在测序鉴定中，我们选择了2个混合探针杂交阳性的克隆和10个随机克隆进行测序分析，结果混合探针杂交阳性的2个克隆的序列分别与2个合成的寡核苷酸探针序列一致，10个随机克隆的序列相互不同且与前2个序列也不同。由此证实构成8肽文库的克隆的插入序列是编码不同8肽的DNA随机片段。总之，成功地构建了噬菌体随机8肽文库。这为今后开展动脉粥样硬化和再狭窄研究，特别是其标志物和治疗药物的筛选研究打下基础。
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[参 考 文 献]
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, 百拇医药
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[收稿日期] 1999-02-26 [修回日期] 1999-09-03
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