过氧亚硝酸盐在内皮细胞损伤中的作用
作者：陈愉 金惠铭
单位：(上海医科大学病理生理学教研室，上海 200032)
关键词：亚硝酸盐类；内皮；细胞；一氧化氮
中国病理生理杂志000527 [中图分类号] Q74 [文献标识码] A
[文章编号] 1000-4718(2000)05-0470-04
Effects of peroxynitrite on the endothelial cells
CHEN Yu, JIN Hui-ming
(Dept. of Pathophysiology, Shanghai Medical University, Shanghai 200032, China)
, 百拇医药
【A Review】 Endothelial cells produce both superoxide and nitric oxide. Nitric oxide and superoxide are known to react rapidly to form the stable peroxynitrite anion. Peroxynitrite mediates the oxidation of protein, lipid, deoxyribose and inhibits mitochondrial electron transport. Peroxynitrite may break DNA strands and activate poly(ADP-ribose) synthetase. If the reaction is excessive, it results in a depletion of intracellular NAD+ and ATP. There is ultimately cell death.
, 百拇医药
[MeSH] Nitrites; Endothelium; Cells; Nitric oxide
一氧化氮(nitric oxide, NO)和O-2反应生成过氧亚硝酸盐(ONOO-)，ONOO-性质活泼且氧化能力强，对血管内皮细胞有损伤作用。ONOO-能硝化酪氨酸，对细胞产生广泛的生物效应。ONOO-与多聚ADP核糖合成酶即 poly (ADP-ribose) synthetase, PARS 相互作用产生一系列的反应，影响细胞功能。本综述针对以上问题进行探讨。
一、ONOO-的生成和降解[1～3]
NO是一种气体自由基，具有脂溶性，它是一种多功能的信息分子。内皮细胞在乙酰胆碱、ATP、缓激肽等神经激素及切应力的刺激下，激发受体介导的Ca2+内流，使细胞内Ca2+水平增加，激活Ca2+激活的NADPH依赖酶:一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, NOS)，血管内皮细胞中既有组成型NOS(constitutive NOS,cNOS)，又有诱导型NOS(inducible NOS, iNOS)。在上述刺激因素的作用下，NOS通过氧化L-arginine产生NO。血管内皮细胞能产生高于激活鸟苷酰环化酶所需浓度10～40倍的NO，但大部分NO在血管腔中丧失。NO的反应主要是与鸟苷酰环化酶中的亚铁血红素结合，激活cGMP；通过与O-2反应生成毒性物质过氧亚硝酸盐ONOO-；或者可被氧合血红蛋白清除。高浓度NO细胞的长期作用可使cGMP的浓度升高到足够的水平以激活cAMP依赖性酶。mmol/L的NO会可逆性抑制过氧化物酶，也可抑制核糖核苷酸还原酶，核糖核苷酸还原酶是含有酪氨酸残基的合成DNA前体的关键酶，但这过程是可逆的。NO的作用依赖于其所处的微环境及其与超氧阴离子O-2、血红蛋白、巯基的相互作用。O-2有直接的毒性作用，内皮细胞产生的NO是其作用的重要靶物质。NO是一种在病理状态下能产生足够高的浓度与超氧化物歧化酶竞争O-2的生物分子。而高浓度时则有细胞毒作用，并与细胞损伤有关[1]。以前往往认为NO直接与细胞毒相关，并认为它寿命很短、具有高反应性，实际上，在生理浓度时的NO并不是很活泼，毒性也较体外实验所提示的要低。NO的直接毒性是很弱的，但产生的ONOO-能增强其毒性[2]，mmol/L的NO能短暂抑制细胞色素c氧化酶，增加从电子传递链中泄漏出的O-2，O-2 与NO反应生成的ONOO-会不可逆地损伤线粒体。ONOO-降低NO的生物活性，参与细胞粘附的增强、细胞增殖、血管收缩，加速动脉硬化的损伤。NO与血管内皮细胞释放的超氧阴离子O-2 相作用；生成强氧化剂ONOO-，其速度很快，NO和O-2的反应速率常数(K值)为6.7×109 M.s-1，3倍于超氧化物歧化酶清除O-2 的速度。NO和O-2相遇几乎都能生成ONOO-。生成ONOO-的速度与NO生成速度及O-2的浓度有关。如两者浓度有较小的增加，ONOO-的浓度即会高到细胞毒的水平[3]。ONOO-在37℃时pKa为6.8，半衰期约为1 s。在生理pH溶液中ONOO-是一个不稳定的分子，可生成共轭酸─过氧亚硝酸(ONOOH)，NOOO-一旦质子化则快速降解，ONOO-可分解产生NO2.及.OH分子，μmol/L、mmol/L浓度的ONOO-分解产生羟自由基，有高度的细胞毒作用，引起显著的细胞损伤, ONOO-可作为NO毒性作用的介导。ONOO-也可通过分子内重排产生硝酸盐，分解产物与所处的化学环境有关。在碱性pH溶液中它可作为一个离子稳定存在也是其产生毒性作用的基础。
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二、ONOO-的生物学特性[4～12]
ONOO-可能参与氧化剂诱导的细胞损伤，血管内皮细胞在许多病理状态下成为损伤的靶目标。病理情况下,激活的内皮细胞能在体内产生ONOO-, 降低抗氧化剂的作用, 通过各种机制引起组织的氧化损伤及影响信号转导通路[4，21]，如氧化剂介导的血管内皮细胞损伤导致内皮细胞屏障功能的丧失、血小板粘附和血管调节异常。ONOO-能与很多生物分子起反应，氧化脱氧核糖、脂质和引起巯基的过氧化，可诱发蛋白质酪氨酸残基的修饰，降低GSH含量，引起DNA损伤，抑制线粒体呼吸功能及乌头酸酶的活性，抑制Na+-K+-ATP酶活性等。膜脂质经磷脂酶A2作用后生成的花生四烯酸被ONOO-氧化，引起细胞膜功能障碍和结构损伤。 ONOO-也能破坏肺泡Ⅱ型细胞、特殊表面活性剂脱辅基蛋白及毛细血管内皮细胞。ONOO-氧化表面活性剂蛋白A，使其功能下降，ONOO-作为一个选择性的氧化剂，被认为有直接的细胞毒作用。其作用机制可能是直接氧化细胞成分, 改变其功能特性或致NO2产生及介导羟自由基的作用。
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ONOO-在酪氨酸硝基化中的作用 ONOO-在生理性pH条件下，能与蛋白质中的酪氨酸残基或游离的酪氨酸反应[5]，使酪氨酸硝基化产生硝基酪氨酸，反应不需金属的存在。许多与亚单位相互连接有关的酪氨酸作为未被结合的结构暴露于溶液中，能被与超氧化物歧化酶结合的ONOO-作用。超氧化物歧化酶能快速地与ONOO-结合[6]，更有选择性地催化某些蛋白质中的酪氨酸残基进行硝基化。生物体中存在的大量的ONOO-的靶物质使与超氧化物歧化酶结合的ONOO-具有更高的效力。体内140多种蛋白质的活性与酪氨酸残基有关，如经化学诱导硝基化，可抑制其活性；ONOO-介导的酪氨酸的硝基化可使蛋白质酪氨酸激酶磷酸化合成多肽的能力抑制51%，酪氨酸激酶的硝基化可使其功能进一步恶化。酪氨酸的硝基化可影响酪氨酸的磷酸化与去磷酸化反应，抑制蛋白质的磷酸化，干扰细胞调控和信号转导通路。细胞调节中重要蛋白质的酪氨酸的硝基化可能与许多病理过程有关。血管内皮细胞在ONOO-的作用下，能进行酪氨酸磷酸化的蛋白质的含量降低，而酪氨酸硝基化的蛋白质的含量则增加。酪氨酸的硝基化可干扰靶蛋白的降解过程[7]。结构蛋白在体内量多且较稳定，包括神经微丝和肌动蛋白，在一些疾病中细胞骨架蛋白可能发生硝基化，其硝基化严重损害骨架蛋白亚单位组装成正确的结构，与体内的主要的病理过程有关。结构蛋白的酪氨酸硝基化引起各亚基结构的破坏，影响蛋白质的结构和功能，最终危及细胞功能。酪氨酸的硝基化能抑制细胞色素P450，抑制人免疫球蛋白IgG补体亚单位C1q的结合能力。随着硝基酪氨酸的形成，血浆中的抗坏血酸盐也相应地消耗。血管壁内源性蛋白质的硝基化可增强其抗原性，引起炎症细胞粘附到血管壁，从而导致血管损伤。硝基酪氨酸抗体的出现提示在人动脉硬化等疾病中有血管壁组织的硝基化存在[8]。
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ONOO-激活PARS的联锁反应 ONOO-诱导的细胞损伤作用与多聚ADP核糖合成酶(PARS)有关。PARS是一种染色质结合酶，也是一种核内DNA修复酶, 在DNA链断裂的修复中起着维持基因组完整性的生理作用。生理情况下，PARS被激活后，催化NAD+中的ADP核糖部分转移到蛋白质受体,并形成尼克酰胺,结果使NAD+含量降低,尼克酰胺产生负反馈作用,抑制PARS活性。在ATP作用下, 尼克酰胺生成NAD+。适当的PARS激活有利于维持基因组的完整性,而过度激活则导致细胞死亡[9，22]。在体外各种细胞中, ONOO-是 DNA链断裂的有效激活剂，ONOO-与核糖作用生成8-羟脱氧鸟嘌呤核苷或8-硝基鸟核苷酸，导致核酸戊糖环脱氢，引起DNA单链断裂，断裂的DNA单链过度激活核内酶PARS，消耗细胞内NAD+、ATP，引起剂量依赖性线粒体呼吸的抑制[10]。由于NAD+是线粒体电子传递的必需物,其含量下降致ATP合成减少,最终引起细胞能量障碍, 导致不可逆性细胞毒及细胞死亡，严重时甚至导致器官功能衰竭。ONOO-浓度依赖性激活PARS，暴露于高浓度氧化剂中时，PARS依赖的细胞毒作用占主要优势。但是也有人认为ONOO-在生理溶液的短半衰期使其不太可能穿透细胞膜，进入核破坏DNA，引发PARS的激活和细胞能源耗竭的级联反应；而可能是ONOO-的降解产物介导DNA损伤[11]。
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ONOO-在线粒体损伤中的作用 ONOO-能明显抑制线粒体的电子传递体链的成分如NADH脱氢酶和ATP酶等，酶的抑制在生理性浓度时即可产生[12]。0.5 mmol/L的ONOO-可抑制电子传递体链复合物1和复合物2，而不抑制复合物4，引起呼吸链电子流的阻断，导致谷氨酸/苹果酸、琥珀酸耗氧过程的抑制。ONOO-还能诱导琥珀酸盐激活的H2O2的增加。当琥珀酸脱氢酶和复合物3被ONOO-所抑制时，从琥珀酸脱氢酶到细胞色素c电子传递抑制，增加了漏出的电子传给 O2形成O-2，O-2 迅速被歧化酶歧化产生H2O2，H2O2等活性氧的产生与最初损伤的扩大有关。对线粒体的损伤作用认为主要与ONOO-有关，因为羟自由基的清除剂 (如甘露醇等) 几乎起不到保护作用，而半胱氨酸、尿酸等ONOO-的清除剂则能提供比较有效的保护作用。线粒体的损伤可能是ONOO-在体内产生细胞毒和组织损伤的主要分子机制。
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三、ONOO-与内皮细胞的关系[13～20]
天然低密度脂蛋白(native low density lipoprotein, n-LDL)可干扰血管内皮细胞的氧化代谢，增加O2和NO的产生，增加了形成ONOO-的可能性，提高了硝基酪氨酸的含量。ONOO-能修饰低密度脂蛋白成能被清除受体结合的形式，使其能被巨噬细胞清除受体识别。ONOO-能在体外把脂蛋白氧化，其氧化与动脉硬化特征性脂纹及斑块的形成有关，脂蛋白的氧化可能在动脉硬化的发生和发展过程中起着重要作用[13]。脂蛋白酪氨酸的硝基化通过改变脂蛋白从血浆中清除的方式或改变细胞受体摄取脂蛋白的方式来影响动脉粥样硬化的发展。在高胆固醇血症中ONOO-的形成也是增加的[14]，存在于血液循环中β-极低密度脂蛋白(β-very low density lipoprotein,-VLDL)颗粒被ONOO-硝基化，与脂蛋白结合的硝基酪氨酸的明显增加，与β-VLDL脂蛋白结合的硝基酪氨酸可作为在动脉硬化发展过程ONOO-产生的生物标记[15]。 将血管内皮细胞与NO的供体(sperm NONOate)孵育，它和S-硝基-N-乙酰-D，L-青霉胺(S-nitric-N-acetyl-D, L-penicillamine,SNAP)都不能改变缓激肽刺激的Ca2+信号转导，而用能产生ONOO-的3-Morpholinosydnonimine N-ethylcarbamide(SIN-1)则能明显抑制信号转导。 1mmol/L的SIN-1选择性抑制兴奋剂激活的外源性Ca2+内流,SIN-1还能耗竭细胞内储存的可释放Ca2+。当内皮细胞与SIN-1和SOD培育时对Ca2+信号转导无明显影响，提示外源性产生的ONOO-调节血管内皮细胞的信号转导，与血管调节有关[16]，ONOO-引起冠脉血管系统浓度依赖性血管扩张反应，但可被氧合血红蛋白抑制，提示了NO供体的参与。ONOO-能抑制SNAP、Ach等血管扩张剂诱导的扩血管反应，这种效应与其浓度密切相关。3～1000 μmol/L 的ONOO-抑制扩血管反应；而30～100 mol/L的ONOO-对扩血管反应无明显影响，但在有6 μmol/L的HbO2存在时则能起到抑制扩血管的效应。ONOO-其本身可作为血管扩张剂，长期作用也损伤血管对其它血管扩张剂的反应，能引起血管功能障碍。但ONOO-同时能产生NO，某些浓度NO能消除ONOO-的毒性作用，但高浓度的ONOO-损伤作用则超过所产生的NO所发挥的保护作用。ONOO-源性.OH对内皮细胞依赖性扩血管作用的损伤可能与cGMP的形成减少有关。nmol/L的ONOO-并不引起内皮细胞损伤, 而能抑制内皮细胞和白细胞粘附作用[17]； 与谷胱甘肽(GSH)反应产生低浓度NO,作为NO供体,调节血管自稳态；抑制血小板聚集；激活鸟苷酰环化酶，引起内皮细胞cGMP含量增高。 在体内给予外源性ONOO- 能减弱P-seletin 的上调,减少内皮细胞表面P-seletin表达而减弱小静脉的白细胞滚动和粘附； 在体外能抑制中性粒细胞粘附到由游离凝血酶、H2O2激活的肠系膜动脉内皮细胞上。生理性浓度的ONOO-能抑制多形核中性粒细胞(PMN)粘附到血管内皮细胞，减轻ONOO-介导的游离灌注的鼠心脏的收缩功能下降。在猫的心肌缺血再灌注损伤(MI/R) 模型中，给予生理性浓度的ONOO-(1mmol/L)或灌注液pH为8.4的0.9% NaCl，用ONOO-灌注的猫心比只用媒介液的心脏，在MI/R后的心肌坏死明显减轻；对扩血管药乙酰胆碱和A23187反应性好。提示ONOO-可保持再灌注后冠脉血管的内皮功能，ONOO-也能明显减少粘附到缺血再灌注的左前降支冠脉内皮的中性粒细胞[18]。在灌注ONOO-的MI/R心脏中，P-selectin的免疫组化定位明显减弱。这些都提示生理性浓度的ONOO-通过减少中性粒细胞和内皮细胞的相互作用而在猫的MI/R心脏中发挥着心脏保护和血管保护作用[19]。
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综上所述，ONOO-在低浓度下发挥保护性的作用，而在高浓度时ONOO-不仅参与体内广泛的硝基化反应，还参与线粒体的损伤；ONOO-通过引发DNA链的断裂激活PARS，进一步损伤细胞，产生广泛的细胞损伤作用[20]，对内皮细胞作用也是如此。
[参 考 文 献]
[1] Blundell G, Jones BG, Rose FA,et al. Homocysteine mediated endothelial cell toxicity and its amelioration [J]. Atherosclerosis, 1996, 122(2): 163～172.
[2] Fukuto, Jon M. In vivo aspects of nitric oxide (NO) chemistry: Does peroxynitrite play a major role in cytotoxicity [J]? Acc.Chem.Res.1997,30 (4):149～152.
, 百拇医药
[3] Munzel T, Heitzer T, Harrison DG. The physiology and pathophysiology of the nitric oxide/superoxide system [J]. Herz，1997 Jun，22(3):158～172.
[4] Keller-JN; Mattson-MP. Roles of lipid peroxidation in modulation of cellular signaling pathways, cell dysfunction, and death in the nervous system [J]. Rev Neurosci, 1998, 9(2): 105～110.
[5] Skinner KA, Crow JP, Skinner HB, et al. Free and protein-associated nitrotysine formation following rat liver preservation and transplantation [J]. Arch Biochem Biophys, 1997,342(2):282～288.
, http://www.100md.com
[6] Beckman, Joseph S, Willem H, Koppenol. Nitric Oxide, superoxide, and peroxynitrite: the good, the bad, and the ugly [J]. Am J Physiol, 1996, 271(Cell Physiol.40):C1424～1437.
[7] Gow AJ, Duran D, Malcolm S, et al. Effects of peroxynitrite-induced protein modifications on tyrosine phosphorylation and degradation [J]. FEBS Lett, 1996, Apr 29, 385(1-2): 63～66.
[8] Ischiropouios H , Michael F S, Ohnishi T,et al. Nitric oxide production and perivascular tyrosine nitration in brain after carbon monoxide poisoning in the rat [J]. J Clin Invest, 1996, 97:2260～2267.
, 百拇医药
[9] Grupp IL, Jackson TM, Hake P, et al. Protection against hypoxia-reoxygenation in the absence of poly (ADP-ribose) synthetase in isolated working hearts [J]. J Mol Cell Cardiol, 1999, 31(1): 297～303.
[10] Szabo C, Cuzzocrea S, Zingarelli B. Endothelial dysfunction in a rat model of endotoxic shock. Importance of the activation of poly (ADP-ribose) synthetase by peroxynitrite [J]. J Clin Invest, 1997, Aug 1;100(3):723～735.
[11] Szabo.C, Zingarelli.Basilla, Michale.O'connor. DNA strand breakage, activation of poly (ADP-ribose) synthetase, and cellular energy depletion are involved in the cytotoxicity in macrophages and smooth muscle cellls exposed to peroxynitrite [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1996,93:1753～1758.
, http://www.100md.com
[12] Park LC, Zhang H, Sheu KF, et al. Metabolic impairment induces oxidative stress, compromises inflammatory responses, and inactivates a key mitochondrial enzyme in microglia [J]. J Neurochem, 1999, 72(5): 1948～1954.
[13] Xin L.Ma, Lopez BL, Gao lin liu, et al. Hypercholesterolemia impairs a detoxification mechanism against peroxynitrite and renders the vascular tissue more susceptible to oxidative injury [J]. Circ Res, 1997, 80(6):894～901.
, 百拇医药
[14] Xin L.Ma, Lopez BL, Gao lin liu, et al. Hypercholesterolemia impairs a detoxification mechanism against peroxynitrite and renders the vascular tissue more susceptible to oxidative injury [J]. Circ Res, 1997,80 (6),894～901.
[15] Patricia, Dulcineia M, Abdalla S P,et al. Nitrotyrosine bound to b-VLDL-apoproteins: a biomarker of peroxynitrite formation in experimental atherosclerosis [J]. Biochem Biophys Res Commun,1997,232(2):332～335.
, 百拇医药
[16] Elliott,SJ. Peroxynitrite modulates receptor-activated Ca2+ signaling in vascular endothelial cells [J]. Am J Physiol, 1996, 270(6 pt 1):L954～961.
[17] Lefer,Pavid, Scallia R, Campbell B, et al. Peroxynitrite inhibits leukocyto-endothelia cell interactions and protects aganist ischemia-reperfusion injury in rats [J]. J Clin Invest,1997,99(4),684～691.
[18] Nossulli To, Hayward R, Scalia R,et al. Peroxynitrite reduces myocardial infarct size and preserves coronary endothelium after ischemia and reperfusion in cats [J]. Circulation,1997,96(7):2317～2324.
, http://www.100md.com
[19] Fukuto, Jon M. In vivo aspects of nitric oxide (NO) chemistry: Does peroxynitrite play a major role in cytotoxicity [J]? Acc Chem Res,1997,30 (4):149～155.
[20] Yasmin W, Ken D, Schulz R. Generation of peroxynitrite contribute to ischemia-reperfusion injury in isolated rat hearts [J]. Cardiovasc Res,1997,33(2):422～427.
[21] Schieke SM, Briviba K, Klotz LO, et al. Activation pattern of mitogen-activated protein kinases elicited by peroxynitrite: attenuation by selenite supplementation [J]. FEBS Lett, 1999, 448(2-3): 301～307.
[22] Thiemermann C, Bowes J, Fiona P, et al. Inhibition of the activity of poly (ADP ribose) synthetase reduces ischemia-reperfusion injury in the heart and skeletal muscle [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1997,94(2).679～684.
[收稿日期]1999-04-21 [修回日期]1999-08-10
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单位：(上海医科大学病理生理学教研室，上海 200032)
关键词：亚硝酸盐类；内皮；细胞；一氧化氮
中国病理生理杂志000527 [中图分类号] Q74 [文献标识码] A
[文章编号] 1000-4718(2000)05-0470-04
Effects of peroxynitrite on the endothelial cells
CHEN Yu, JIN Hui-ming
(Dept. of Pathophysiology, Shanghai Medical University, Shanghai 200032, China)
, 百拇医药
【A Review】 Endothelial cells produce both superoxide and nitric oxide. Nitric oxide and superoxide are known to react rapidly to form the stable peroxynitrite anion. Peroxynitrite mediates the oxidation of protein, lipid, deoxyribose and inhibits mitochondrial electron transport. Peroxynitrite may break DNA strands and activate poly(ADP-ribose) synthetase. If the reaction is excessive, it results in a depletion of intracellular NAD+ and ATP. There is ultimately cell death.
, 百拇医药
[MeSH] Nitrites; Endothelium; Cells; Nitric oxide
一氧化氮(nitric oxide, NO)和O-2反应生成过氧亚硝酸盐(ONOO-)，ONOO-性质活泼且氧化能力强，对血管内皮细胞有损伤作用。ONOO-能硝化酪氨酸，对细胞产生广泛的生物效应。ONOO-与多聚ADP核糖合成酶即 poly (ADP-ribose) synthetase, PARS 相互作用产生一系列的反应，影响细胞功能。本综述针对以上问题进行探讨。
一、ONOO-的生成和降解[1～3]
NO是一种气体自由基，具有脂溶性，它是一种多功能的信息分子。内皮细胞在乙酰胆碱、ATP、缓激肽等神经激素及切应力的刺激下，激发受体介导的Ca2+内流，使细胞内Ca2+水平增加，激活Ca2+激活的NADPH依赖酶:一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, NOS)，血管内皮细胞中既有组成型NOS(constitutive NOS,cNOS)，又有诱导型NOS(inducible NOS, iNOS)。在上述刺激因素的作用下，NOS通过氧化L-arginine产生NO。血管内皮细胞能产生高于激活鸟苷酰环化酶所需浓度10～40倍的NO，但大部分NO在血管腔中丧失。NO的反应主要是与鸟苷酰环化酶中的亚铁血红素结合，激活cGMP；通过与O-2反应生成毒性物质过氧亚硝酸盐ONOO-；或者可被氧合血红蛋白清除。高浓度NO细胞的长期作用可使cGMP的浓度升高到足够的水平以激活cAMP依赖性酶。mmol/L的NO会可逆性抑制过氧化物酶，也可抑制核糖核苷酸还原酶，核糖核苷酸还原酶是含有酪氨酸残基的合成DNA前体的关键酶，但这过程是可逆的。NO的作用依赖于其所处的微环境及其与超氧阴离子O-2、血红蛋白、巯基的相互作用。O-2有直接的毒性作用，内皮细胞产生的NO是其作用的重要靶物质。NO是一种在病理状态下能产生足够高的浓度与超氧化物歧化酶竞争O-2的生物分子。而高浓度时则有细胞毒作用，并与细胞损伤有关[1]。以前往往认为NO直接与细胞毒相关，并认为它寿命很短、具有高反应性，实际上，在生理浓度时的NO并不是很活泼，毒性也较体外实验所提示的要低。NO的直接毒性是很弱的，但产生的ONOO-能增强其毒性[2]，mmol/L的NO能短暂抑制细胞色素c氧化酶，增加从电子传递链中泄漏出的O-2，O-2 与NO反应生成的ONOO-会不可逆地损伤线粒体。ONOO-降低NO的生物活性，参与细胞粘附的增强、细胞增殖、血管收缩，加速动脉硬化的损伤。NO与血管内皮细胞释放的超氧阴离子O-2 相作用；生成强氧化剂ONOO-，其速度很快，NO和O-2的反应速率常数(K值)为6.7×109 M.s-1，3倍于超氧化物歧化酶清除O-2 的速度。NO和O-2相遇几乎都能生成ONOO-。生成ONOO-的速度与NO生成速度及O-2的浓度有关。如两者浓度有较小的增加，ONOO-的浓度即会高到细胞毒的水平[3]。ONOO-在37℃时pKa为6.8，半衰期约为1 s。在生理pH溶液中ONOO-是一个不稳定的分子，可生成共轭酸─过氧亚硝酸(ONOOH)，NOOO-一旦质子化则快速降解，ONOO-可分解产生NO2.及.OH分子，μmol/L、mmol/L浓度的ONOO-分解产生羟自由基，有高度的细胞毒作用，引起显著的细胞损伤, ONOO-可作为NO毒性作用的介导。ONOO-也可通过分子内重排产生硝酸盐，分解产物与所处的化学环境有关。在碱性pH溶液中它可作为一个离子稳定存在也是其产生毒性作用的基础。
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二、ONOO-的生物学特性[4～12]
ONOO-可能参与氧化剂诱导的细胞损伤，血管内皮细胞在许多病理状态下成为损伤的靶目标。病理情况下,激活的内皮细胞能在体内产生ONOO-, 降低抗氧化剂的作用, 通过各种机制引起组织的氧化损伤及影响信号转导通路[4，21]，如氧化剂介导的血管内皮细胞损伤导致内皮细胞屏障功能的丧失、血小板粘附和血管调节异常。ONOO-能与很多生物分子起反应，氧化脱氧核糖、脂质和引起巯基的过氧化，可诱发蛋白质酪氨酸残基的修饰，降低GSH含量，引起DNA损伤，抑制线粒体呼吸功能及乌头酸酶的活性，抑制Na+-K+-ATP酶活性等。膜脂质经磷脂酶A2作用后生成的花生四烯酸被ONOO-氧化，引起细胞膜功能障碍和结构损伤。 ONOO-也能破坏肺泡Ⅱ型细胞、特殊表面活性剂脱辅基蛋白及毛细血管内皮细胞。ONOO-氧化表面活性剂蛋白A，使其功能下降，ONOO-作为一个选择性的氧化剂，被认为有直接的细胞毒作用。其作用机制可能是直接氧化细胞成分, 改变其功能特性或致NO2产生及介导羟自由基的作用。
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ONOO-在酪氨酸硝基化中的作用 ONOO-在生理性pH条件下，能与蛋白质中的酪氨酸残基或游离的酪氨酸反应[5]，使酪氨酸硝基化产生硝基酪氨酸，反应不需金属的存在。许多与亚单位相互连接有关的酪氨酸作为未被结合的结构暴露于溶液中，能被与超氧化物歧化酶结合的ONOO-作用。超氧化物歧化酶能快速地与ONOO-结合[6]，更有选择性地催化某些蛋白质中的酪氨酸残基进行硝基化。生物体中存在的大量的ONOO-的靶物质使与超氧化物歧化酶结合的ONOO-具有更高的效力。体内140多种蛋白质的活性与酪氨酸残基有关，如经化学诱导硝基化，可抑制其活性；ONOO-介导的酪氨酸的硝基化可使蛋白质酪氨酸激酶磷酸化合成多肽的能力抑制51%，酪氨酸激酶的硝基化可使其功能进一步恶化。酪氨酸的硝基化可影响酪氨酸的磷酸化与去磷酸化反应，抑制蛋白质的磷酸化，干扰细胞调控和信号转导通路。细胞调节中重要蛋白质的酪氨酸的硝基化可能与许多病理过程有关。血管内皮细胞在ONOO-的作用下，能进行酪氨酸磷酸化的蛋白质的含量降低，而酪氨酸硝基化的蛋白质的含量则增加。酪氨酸的硝基化可干扰靶蛋白的降解过程[7]。结构蛋白在体内量多且较稳定，包括神经微丝和肌动蛋白，在一些疾病中细胞骨架蛋白可能发生硝基化，其硝基化严重损害骨架蛋白亚单位组装成正确的结构，与体内的主要的病理过程有关。结构蛋白的酪氨酸硝基化引起各亚基结构的破坏，影响蛋白质的结构和功能，最终危及细胞功能。酪氨酸的硝基化能抑制细胞色素P450，抑制人免疫球蛋白IgG补体亚单位C1q的结合能力。随着硝基酪氨酸的形成，血浆中的抗坏血酸盐也相应地消耗。血管壁内源性蛋白质的硝基化可增强其抗原性，引起炎症细胞粘附到血管壁，从而导致血管损伤。硝基酪氨酸抗体的出现提示在人动脉硬化等疾病中有血管壁组织的硝基化存在[8]。
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ONOO-激活PARS的联锁反应 ONOO-诱导的细胞损伤作用与多聚ADP核糖合成酶(PARS)有关。PARS是一种染色质结合酶，也是一种核内DNA修复酶, 在DNA链断裂的修复中起着维持基因组完整性的生理作用。生理情况下，PARS被激活后，催化NAD+中的ADP核糖部分转移到蛋白质受体,并形成尼克酰胺,结果使NAD+含量降低,尼克酰胺产生负反馈作用,抑制PARS活性。在ATP作用下, 尼克酰胺生成NAD+。适当的PARS激活有利于维持基因组的完整性,而过度激活则导致细胞死亡[9，22]。在体外各种细胞中, ONOO-是 DNA链断裂的有效激活剂，ONOO-与核糖作用生成8-羟脱氧鸟嘌呤核苷或8-硝基鸟核苷酸，导致核酸戊糖环脱氢，引起DNA单链断裂，断裂的DNA单链过度激活核内酶PARS，消耗细胞内NAD+、ATP，引起剂量依赖性线粒体呼吸的抑制[10]。由于NAD+是线粒体电子传递的必需物,其含量下降致ATP合成减少,最终引起细胞能量障碍, 导致不可逆性细胞毒及细胞死亡，严重时甚至导致器官功能衰竭。ONOO-浓度依赖性激活PARS，暴露于高浓度氧化剂中时，PARS依赖的细胞毒作用占主要优势。但是也有人认为ONOO-在生理溶液的短半衰期使其不太可能穿透细胞膜，进入核破坏DNA，引发PARS的激活和细胞能源耗竭的级联反应；而可能是ONOO-的降解产物介导DNA损伤[11]。
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ONOO-在线粒体损伤中的作用 ONOO-能明显抑制线粒体的电子传递体链的成分如NADH脱氢酶和ATP酶等，酶的抑制在生理性浓度时即可产生[12]。0.5 mmol/L的ONOO-可抑制电子传递体链复合物1和复合物2，而不抑制复合物4，引起呼吸链电子流的阻断，导致谷氨酸/苹果酸、琥珀酸耗氧过程的抑制。ONOO-还能诱导琥珀酸盐激活的H2O2的增加。当琥珀酸脱氢酶和复合物3被ONOO-所抑制时，从琥珀酸脱氢酶到细胞色素c电子传递抑制，增加了漏出的电子传给 O2形成O-2，O-2 迅速被歧化酶歧化产生H2O2，H2O2等活性氧的产生与最初损伤的扩大有关。对线粒体的损伤作用认为主要与ONOO-有关，因为羟自由基的清除剂 (如甘露醇等) 几乎起不到保护作用，而半胱氨酸、尿酸等ONOO-的清除剂则能提供比较有效的保护作用。线粒体的损伤可能是ONOO-在体内产生细胞毒和组织损伤的主要分子机制。
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三、ONOO-与内皮细胞的关系[13～20]
天然低密度脂蛋白(native low density lipoprotein, n-LDL)可干扰血管内皮细胞的氧化代谢，增加O2和NO的产生，增加了形成ONOO-的可能性，提高了硝基酪氨酸的含量。ONOO-能修饰低密度脂蛋白成能被清除受体结合的形式，使其能被巨噬细胞清除受体识别。ONOO-能在体外把脂蛋白氧化，其氧化与动脉硬化特征性脂纹及斑块的形成有关，脂蛋白的氧化可能在动脉硬化的发生和发展过程中起着重要作用[13]。脂蛋白酪氨酸的硝基化通过改变脂蛋白从血浆中清除的方式或改变细胞受体摄取脂蛋白的方式来影响动脉粥样硬化的发展。在高胆固醇血症中ONOO-的形成也是增加的[14]，存在于血液循环中β-极低密度脂蛋白(β-very low density lipoprotein,-VLDL)颗粒被ONOO-硝基化，与脂蛋白结合的硝基酪氨酸的明显增加，与β-VLDL脂蛋白结合的硝基酪氨酸可作为在动脉硬化发展过程ONOO-产生的生物标记[15]。 将血管内皮细胞与NO的供体(sperm NONOate)孵育，它和S-硝基-N-乙酰-D，L-青霉胺(S-nitric-N-acetyl-D, L-penicillamine,SNAP)都不能改变缓激肽刺激的Ca2+信号转导，而用能产生ONOO-的3-Morpholinosydnonimine N-ethylcarbamide(SIN-1)则能明显抑制信号转导。 1mmol/L的SIN-1选择性抑制兴奋剂激活的外源性Ca2+内流,SIN-1还能耗竭细胞内储存的可释放Ca2+。当内皮细胞与SIN-1和SOD培育时对Ca2+信号转导无明显影响，提示外源性产生的ONOO-调节血管内皮细胞的信号转导，与血管调节有关[16]，ONOO-引起冠脉血管系统浓度依赖性血管扩张反应，但可被氧合血红蛋白抑制，提示了NO供体的参与。ONOO-能抑制SNAP、Ach等血管扩张剂诱导的扩血管反应，这种效应与其浓度密切相关。3～1000 μmol/L 的ONOO-抑制扩血管反应；而30～100 mol/L的ONOO-对扩血管反应无明显影响，但在有6 μmol/L的HbO2存在时则能起到抑制扩血管的效应。ONOO-其本身可作为血管扩张剂，长期作用也损伤血管对其它血管扩张剂的反应，能引起血管功能障碍。但ONOO-同时能产生NO，某些浓度NO能消除ONOO-的毒性作用，但高浓度的ONOO-损伤作用则超过所产生的NO所发挥的保护作用。ONOO-源性.OH对内皮细胞依赖性扩血管作用的损伤可能与cGMP的形成减少有关。nmol/L的ONOO-并不引起内皮细胞损伤, 而能抑制内皮细胞和白细胞粘附作用[17]； 与谷胱甘肽(GSH)反应产生低浓度NO,作为NO供体,调节血管自稳态；抑制血小板聚集；激活鸟苷酰环化酶，引起内皮细胞cGMP含量增高。 在体内给予外源性ONOO- 能减弱P-seletin 的上调,减少内皮细胞表面P-seletin表达而减弱小静脉的白细胞滚动和粘附； 在体外能抑制中性粒细胞粘附到由游离凝血酶、H2O2激活的肠系膜动脉内皮细胞上。生理性浓度的ONOO-能抑制多形核中性粒细胞(PMN)粘附到血管内皮细胞，减轻ONOO-介导的游离灌注的鼠心脏的收缩功能下降。在猫的心肌缺血再灌注损伤(MI/R) 模型中，给予生理性浓度的ONOO-(1mmol/L)或灌注液pH为8.4的0.9% NaCl，用ONOO-灌注的猫心比只用媒介液的心脏，在MI/R后的心肌坏死明显减轻；对扩血管药乙酰胆碱和A23187反应性好。提示ONOO-可保持再灌注后冠脉血管的内皮功能，ONOO-也能明显减少粘附到缺血再灌注的左前降支冠脉内皮的中性粒细胞[18]。在灌注ONOO-的MI/R心脏中，P-selectin的免疫组化定位明显减弱。这些都提示生理性浓度的ONOO-通过减少中性粒细胞和内皮细胞的相互作用而在猫的MI/R心脏中发挥着心脏保护和血管保护作用[19]。
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综上所述，ONOO-在低浓度下发挥保护性的作用，而在高浓度时ONOO-不仅参与体内广泛的硝基化反应，还参与线粒体的损伤；ONOO-通过引发DNA链的断裂激活PARS，进一步损伤细胞，产生广泛的细胞损伤作用[20]，对内皮细胞作用也是如此。
[参 考 文 献]
[1] Blundell G, Jones BG, Rose FA,et al. Homocysteine mediated endothelial cell toxicity and its amelioration [J]. Atherosclerosis, 1996, 122(2): 163～172.
[2] Fukuto, Jon M. In vivo aspects of nitric oxide (NO) chemistry: Does peroxynitrite play a major role in cytotoxicity [J]? Acc.Chem.Res.1997,30 (4):149～152.
, 百拇医药
[3] Munzel T, Heitzer T, Harrison DG. The physiology and pathophysiology of the nitric oxide/superoxide system [J]. Herz，1997 Jun，22(3):158～172.
[4] Keller-JN; Mattson-MP. Roles of lipid peroxidation in modulation of cellular signaling pathways, cell dysfunction, and death in the nervous system [J]. Rev Neurosci, 1998, 9(2): 105～110.
[5] Skinner KA, Crow JP, Skinner HB, et al. Free and protein-associated nitrotysine formation following rat liver preservation and transplantation [J]. Arch Biochem Biophys, 1997,342(2):282～288.
, http://www.100md.com
[6] Beckman, Joseph S, Willem H, Koppenol. Nitric Oxide, superoxide, and peroxynitrite: the good, the bad, and the ugly [J]. Am J Physiol, 1996, 271(Cell Physiol.40):C1424～1437.
[7] Gow AJ, Duran D, Malcolm S, et al. Effects of peroxynitrite-induced protein modifications on tyrosine phosphorylation and degradation [J]. FEBS Lett, 1996, Apr 29, 385(1-2): 63～66.
[8] Ischiropouios H , Michael F S, Ohnishi T,et al. Nitric oxide production and perivascular tyrosine nitration in brain after carbon monoxide poisoning in the rat [J]. J Clin Invest, 1996, 97:2260～2267.
, 百拇医药
[9] Grupp IL, Jackson TM, Hake P, et al. Protection against hypoxia-reoxygenation in the absence of poly (ADP-ribose) synthetase in isolated working hearts [J]. J Mol Cell Cardiol, 1999, 31(1): 297～303.
[10] Szabo C, Cuzzocrea S, Zingarelli B. Endothelial dysfunction in a rat model of endotoxic shock. Importance of the activation of poly (ADP-ribose) synthetase by peroxynitrite [J]. J Clin Invest, 1997, Aug 1;100(3):723～735.
[11] Szabo.C, Zingarelli.Basilla, Michale.O'connor. DNA strand breakage, activation of poly (ADP-ribose) synthetase, and cellular energy depletion are involved in the cytotoxicity in macrophages and smooth muscle cellls exposed to peroxynitrite [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1996,93:1753～1758.
, http://www.100md.com
[12] Park LC, Zhang H, Sheu KF, et al. Metabolic impairment induces oxidative stress, compromises inflammatory responses, and inactivates a key mitochondrial enzyme in microglia [J]. J Neurochem, 1999, 72(5): 1948～1954.
[13] Xin L.Ma, Lopez BL, Gao lin liu, et al. Hypercholesterolemia impairs a detoxification mechanism against peroxynitrite and renders the vascular tissue more susceptible to oxidative injury [J]. Circ Res, 1997, 80(6):894～901.
, 百拇医药
[14] Xin L.Ma, Lopez BL, Gao lin liu, et al. Hypercholesterolemia impairs a detoxification mechanism against peroxynitrite and renders the vascular tissue more susceptible to oxidative injury [J]. Circ Res, 1997,80 (6),894～901.
[15] Patricia, Dulcineia M, Abdalla S P,et al. Nitrotyrosine bound to b-VLDL-apoproteins: a biomarker of peroxynitrite formation in experimental atherosclerosis [J]. Biochem Biophys Res Commun,1997,232(2):332～335.
, 百拇医药
[16] Elliott,SJ. Peroxynitrite modulates receptor-activated Ca2+ signaling in vascular endothelial cells [J]. Am J Physiol, 1996, 270(6 pt 1):L954～961.
[17] Lefer,Pavid, Scallia R, Campbell B, et al. Peroxynitrite inhibits leukocyto-endothelia cell interactions and protects aganist ischemia-reperfusion injury in rats [J]. J Clin Invest,1997,99(4),684～691.
[18] Nossulli To, Hayward R, Scalia R,et al. Peroxynitrite reduces myocardial infarct size and preserves coronary endothelium after ischemia and reperfusion in cats [J]. Circulation,1997,96(7):2317～2324.
, http://www.100md.com
[19] Fukuto, Jon M. In vivo aspects of nitric oxide (NO) chemistry: Does peroxynitrite play a major role in cytotoxicity [J]? Acc Chem Res,1997,30 (4):149～155.
[20] Yasmin W, Ken D, Schulz R. Generation of peroxynitrite contribute to ischemia-reperfusion injury in isolated rat hearts [J]. Cardiovasc Res,1997,33(2):422～427.
[21] Schieke SM, Briviba K, Klotz LO, et al. Activation pattern of mitogen-activated protein kinases elicited by peroxynitrite: attenuation by selenite supplementation [J]. FEBS Lett, 1999, 448(2-3): 301～307.
[22] Thiemermann C, Bowes J, Fiona P, et al. Inhibition of the activity of poly (ADP ribose) synthetase reduces ischemia-reperfusion injury in the heart and skeletal muscle [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1997,94(2).679～684.
[收稿日期]1999-04-21 [修回日期]1999-08-10
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