端粒酶活性与慢性粒细胞白血病病程关系的研究
作者：倪晓华 毕富勇 曹根涛
单位：倪晓华 毕富勇(皖南医学院生化教研室， 安徽 芜湖 241001)；曹根涛(中科院上海细胞生物学研究所， 上海 200031)
关键词：端粒；骨髓；白血病， 髓性，慢性
中国病理生理杂志000520 [摘 要] 目的：通过对慢性粒细胞白血病(CML)各期患者骨髓单个核细胞端粒酶活性的检测，以了解端粒酶活性与CML病程的关系。方法：采用聚合酶链反应-酶标记免疫吸附分析法(PCR-ELISA)测定端粒酶活性。结果：正常骨髓组端粒酶活性为9.85±0.68，CML慢性期为24.48±12.73，明显高于正常骨髓组(P<0.05)，加速期为76.76±21.84，急变期为90.62±25.41，两者均明显高于慢性期组(P<0.001，P<0.001)且本身两组间无显著差异(P>0.05)，慢性期治疗后为18.12±6.27，仍高于正常骨髓组(P<0.05)。结论：CML各期端粒酶活性均显著高于正常骨髓组，端粒酶的异常激活表明CML患者进入了加速期，端粒酶活性可作为CML检测和预后的一个有用的新指标。
, 百拇医药
[中图分类号] R733.7 [文献标识] A
[文章编号] 1000-4718(2000)05-0454-03
Relation between telomerase activity and chronic myelocytic leukemia course
NI Xiao-hua， BI Fu-yong,(Dept. of Biochemistry Wanan Medical College， Wuhu 241001， China)
CAO Gen-tao
(Shanghai Institute of Cell Biology, the Chinese Acadmy of Science, Shanghai 200031, China)
, 百拇医药
[Abstract] AIM： Studying the relation between telomerase activity and chronic myelocytic leukemia(CML) courses by detect telomerase activity(TMA) of mononuclear cells of bone marrow samples in different CML phases. METHOD: Using telomerase PCR-ELISA method. RESULTS: Telomerase activity of normal bone marrow is 9.85±0.68, CML chronic phase is 24.48±12.73 which is significantly higher than that of normal bone marrow(P<0.05). CML accelerated phase TMA is 76.76±21.84 and blast crisis is 90.62±25.41, both are significantly higher than that of chronic phase(P<0.001, P<0.001)but there is no significant difference between accelerated phase and blast crisis(P>0.05), at remisson TMA is 18.12±6.27 which is still higher than normal group(P<0.05).CONCLUTIONS: Telomerase activity in different phases of CML is significantly higher than normal bone marrow group. When telomerase is extremely activated , it means that CML patients were entering the accelerated phase. Telomerase activity might be used as an useful new marker in detecting and curing CML.
, 百拇医药
[MeSH] Telomere; Bone marrow; Leukmia, myeloid, chronic
端粒(telomere)和端粒酶(telomerase)是近来生命科学研究的热点之一。正常细胞每分裂一次，端粒会缩短一些，直至危机点，触发停止细胞分裂信号，细胞将走向衰老和死亡，少数细胞若逃脱危机点，激活端粒酶，进而永生化和恶变，因而研究端粒和端粒酶系统对阐明细胞衰老和恶变的机制，对抗衰老和临床上肿瘤的诊断和治疗有着重要的意义。慢性粒细胞白血病(chronic myelocytic leukemia,CML)为一种多能造血干细胞恶性增生疾病，临床上可分为慢性期、加速期和急变期。本文采用聚合酶链反应-酶标记免疫吸附分析法(PCR-ELISA)对CML各期的患者骨髓单个核细胞端粒酶活性进行检测，以研究端粒酶活性水平与CML病程的关系。
材 料 和 方 法
一、材料
, 百拇医药
人白血病细胞系K562、J6-1为本教研室肿瘤生化室传代培养。
二、标本
由医院确诊的CML患者40例，其中慢性期患者15例，加速期患者9例，急变期患者10例，CML慢性期治疗后6例，诊断标准符合1989年第二届全国白血病学术会议制定的分期标准，另有10例为正常骨髓标本。
三、端粒酶活性测定
端粒酶PCR-ELISA试剂盒(德国宝灵曼公司)。
(一)标本制备 细胞系J6-1，K562传代细胞取2×106细胞，4℃ 3 000 r/min离心10 min，弃去上清液，PBS洗两遍，4℃ 3 000 r/min离心10 min，留沉降细胞。
待测标本，骨髓2 mL经肝素抗凝后，淋巴细胞分离液分离，取2×106细胞，PBS洗两遍，4℃ 3 000 r/min 10 min，留沉降细胞。
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(二)端粒酶的提取 取2×106细胞，加200 μL裂解液，冰浴中30 min,4℃ 16 000 r/min 20 min，留上清液。
(三)PCR扩增 取25 μL反应混合液，加3 μL细胞提取液，加双蒸水至50 μL。25℃反应30 min，94℃灭活5 min进入PCR循环：94℃ 30 s，50℃ 30 s，72℃ 90 s共30个循环，72℃延伸10 min，终止反应。
(四)ELISA 扩增产物5 μL加20 μL变性液混匀后，室温放置10 min； 加入225 μL杂交液混匀后，取100 μL加入亲和素包被的反应孔中37℃振荡2 h，弃去液体，清洗液250 μL洗3次； 加100 μL过氧化物酶标记的抗地高辛抗体，37℃反应30 min弃去液体，清洗液洗2次； 加入100 μL TMB显色液室温20 min； 加入100 μL终止液终止反应，静置20 min； 酶标仪测定450 nm和690 nm波长下的吸光度。
, 百拇医药
(五)对照 阳性对照，试剂盒提供的293细胞株裂解上清液。 阴性对照，K562细胞株裂解上清液经65℃灭活10 min。
(六)计算与统计 以450 nm与690 nm的吸光度差值表示其端粒酶活性，并以样品测量值与试剂盒的阳性对照测量值的百分比作为其活性相对值。对各组数据(
±s)进行方差分析及q检验。
结 果
一、 白血病细胞系J6-1，K562有较强的端粒酶活性，见表1。
表1 白血病细胞系的端粒酶活性
Tab 1 Telomerase activity of normal bone marrow,J6-1 and K562(±s,n=10) Group
, 百拇医药
Telomerase activity
Ⅰ(normal bone marrow)
9.85±0.68
Ⅱ(J6-1)
110.00±4.10**
Ⅲ(k562)
107.00±2.86**
** P<0.01， vs group
二、正常骨髓标本10例的端粒酶活性平均值为9.85±0.68，活性微弱。15例CML慢性期均值24.48±12.73，高于正常骨髓对照组(P<0.05)。9例CML加速期患者端粒酶活性均值为76.76±21.84，10例CML急变期患者端粒酶活性平均值为90.62±25.41，两者无显著差异(P>0.05)，但均明显高于慢性期患者(P<0.01，P<0.01)，而慢性期患者治疗后端粒酶活性平均值为18.12±6.27与慢性期患者端粒酶活性相比无显著的差异(P>0.05)，见表2。
, 百拇医药
表2 正常骨髓及CML各期标本的端粒酶活性
Tab 2 Telomerase activity of normal bone marrow and
CML in different phases(±s) Group
n
Telomerase activity
Ⅰ(normal bone marrow)
10
9.85±0.68
Ⅱ(CML chronic phase)
, http://www.100md.com
15
24.48±12.73*
Ⅲ(CML accelerated phase)
9
76.76±21.84*ΔΔ
Ⅳ(CML blast crisis phase)
10
90.62±25.41*ΔΔ#
Ⅴ(CML remission)
6
, http://www.100md.com
18.12±6.27*●
* P<0.05, vs group Ⅰ; ΔΔP<0.01, vs group Ⅱ; #P>0.05, vs group Ⅲ; ●P>0.05, vs groupⅡ讨 论
端粒是真核细胞染色体末端的特殊结构，包括端粒DNA及其结合蛋白，能防止染色体被降解、融合及重组，正常细胞每分裂1次，端粒就会缩短。Harley等提出[1]：端粒可称为细胞的“分裂钟”，它决定着细胞的复制能力。当正常细胞的端粒缩短到临界点时，就会起动停止细胞分裂信号而走向衰老和死亡。端粒酶是一种核糖蛋白复合体，以自身的RNA为模板在端粒末端合成新的重复序列而使端粒延长，稳定染色体结构。文献报道在人体正常细胞端粒酶活性为阴性，而在胚系和肿瘤细胞中存在端粒酶活性，Kim等报道98%已建株的肿瘤细胞系，90%原发性肿瘤皆表现端粒酶活性[2，5]，表明端粒酶活性与细胞增殖与肿瘤发生有密切关系，Shay等[3，4]指出，多数AML和ALL有较强的端粒酶活性，早期的CLL端粒酶活性低于正常对照，而晚期则活性水平增高。
, 百拇医药
本实验结果表明：(1)正常骨髓标本显示出微弱的端粒酶活性(9.85±0.68),而白血病细胞系K562、J6-1则显示出较强的端粒酶活性(107±2.68,110±4.10),阴性对照K562细胞株裂解上清液经65℃,灭活10 min,端粒酶活性比值仅为0.66±0.02,n=10。(2)CML慢性期患者的端粒酶活性高于正常骨髓组，CML慢性期患者经治疗后(化疗3个月～2年)，端粒酶活性虽有下降趋势，但与CML慢性期组无显著差异并仍高于正常骨髓组，说明其端粒酶活性来源于残留的白血病细胞，提示端粒酶活性可作为其预后的指标。(3)CML加速期和急变期患者的端粒酶活性并无明显差异，只是急变期有升高的趋势，但均明显高于正常骨髓组，与慢性期患者相比也有明显增高，提示端粒酶活性可作为CML白血病恶化的标志，即端粒酶的异常激活使之进入了加速期。因而端粒酶活性与CML的病程有密切关系。(4)本研究采用端粒酶PCR-ELISA技术具有灵敏度高无同位素污染的特点 ，且操作简便，一次可测多个样品。因而端粒酶PCR-ELISA技术测定端粒酶活性可作为CML的临床诊断，判断病程以及预后的新指标。
, 百拇医药
[参 考 文 献]
[1] Harley C. Telomere loss: mitotic clock or genetic time bomb[J]? Mutat Res， 1991, 256: 271～282.
[2] Harley CB, Futcher AB, Greider CW, et al. Telomeres shortern during ageing of human fibroblasts[J]. Nature， 1990, 345: 458～466.
[3] Shay JW, Weibin H, Wright WE, et al. Telomeres and telomerase in human leukemias[J]. Leukemia， 1996, 10: 1255～1261.
, 百拇医药 [4] Counter CM，Gupta J，Harley CB, et al. Telomarase activity in normal leukocytes and in hematologic malignancies[J]. Blood， 1995，85：2315～2320.
[5] Kim JL，Piatyszek MA，Prowse KR，et al. Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer[J]. Science， 1994，266：2011～2015.
[6] 卫立辛，吴孟超，郭亚军.端粒酶活性检测方法研究进展[J]. 国外医学临床生物化学与检验学分册， 1998, 19(2):63～64.
[7] 谢万灼，林茂芳.端粒及端粒酶在恶性血液病中的研究进展[J].国外医学输血及血液学分册，1998, 21(4):234～237.
[收稿日期] 1999-12-17 [修回日期] 2000-03-20
, 百拇医药
单位：倪晓华 毕富勇(皖南医学院生化教研室， 安徽 芜湖 241001)；曹根涛(中科院上海细胞生物学研究所， 上海 200031)
关键词：端粒；骨髓；白血病， 髓性，慢性
中国病理生理杂志000520 [摘 要] 目的：通过对慢性粒细胞白血病(CML)各期患者骨髓单个核细胞端粒酶活性的检测，以了解端粒酶活性与CML病程的关系。方法：采用聚合酶链反应-酶标记免疫吸附分析法(PCR-ELISA)测定端粒酶活性。结果：正常骨髓组端粒酶活性为9.85±0.68，CML慢性期为24.48±12.73，明显高于正常骨髓组(P<0.05)，加速期为76.76±21.84，急变期为90.62±25.41，两者均明显高于慢性期组(P<0.001，P<0.001)且本身两组间无显著差异(P>0.05)，慢性期治疗后为18.12±6.27，仍高于正常骨髓组(P<0.05)。结论：CML各期端粒酶活性均显著高于正常骨髓组，端粒酶的异常激活表明CML患者进入了加速期，端粒酶活性可作为CML检测和预后的一个有用的新指标。
, 百拇医药
[中图分类号] R733.7 [文献标识] A
[文章编号] 1000-4718(2000)05-0454-03
Relation between telomerase activity and chronic myelocytic leukemia course
NI Xiao-hua， BI Fu-yong,(Dept. of Biochemistry Wanan Medical College， Wuhu 241001， China)
CAO Gen-tao
(Shanghai Institute of Cell Biology, the Chinese Acadmy of Science, Shanghai 200031, China)
, 百拇医药
[Abstract] AIM： Studying the relation between telomerase activity and chronic myelocytic leukemia(CML) courses by detect telomerase activity(TMA) of mononuclear cells of bone marrow samples in different CML phases. METHOD: Using telomerase PCR-ELISA method. RESULTS: Telomerase activity of normal bone marrow is 9.85±0.68, CML chronic phase is 24.48±12.73 which is significantly higher than that of normal bone marrow(P<0.05). CML accelerated phase TMA is 76.76±21.84 and blast crisis is 90.62±25.41, both are significantly higher than that of chronic phase(P<0.001, P<0.001)but there is no significant difference between accelerated phase and blast crisis(P>0.05), at remisson TMA is 18.12±6.27 which is still higher than normal group(P<0.05).CONCLUTIONS: Telomerase activity in different phases of CML is significantly higher than normal bone marrow group. When telomerase is extremely activated , it means that CML patients were entering the accelerated phase. Telomerase activity might be used as an useful new marker in detecting and curing CML.
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[MeSH] Telomere; Bone marrow; Leukmia, myeloid, chronic
端粒(telomere)和端粒酶(telomerase)是近来生命科学研究的热点之一。正常细胞每分裂一次，端粒会缩短一些，直至危机点，触发停止细胞分裂信号，细胞将走向衰老和死亡，少数细胞若逃脱危机点，激活端粒酶，进而永生化和恶变，因而研究端粒和端粒酶系统对阐明细胞衰老和恶变的机制，对抗衰老和临床上肿瘤的诊断和治疗有着重要的意义。慢性粒细胞白血病(chronic myelocytic leukemia,CML)为一种多能造血干细胞恶性增生疾病，临床上可分为慢性期、加速期和急变期。本文采用聚合酶链反应-酶标记免疫吸附分析法(PCR-ELISA)对CML各期的患者骨髓单个核细胞端粒酶活性进行检测，以研究端粒酶活性水平与CML病程的关系。
材 料 和 方 法
一、材料
, 百拇医药
人白血病细胞系K562、J6-1为本教研室肿瘤生化室传代培养。
二、标本
由医院确诊的CML患者40例，其中慢性期患者15例，加速期患者9例，急变期患者10例，CML慢性期治疗后6例，诊断标准符合1989年第二届全国白血病学术会议制定的分期标准，另有10例为正常骨髓标本。
三、端粒酶活性测定
端粒酶PCR-ELISA试剂盒(德国宝灵曼公司)。
(一)标本制备 细胞系J6-1，K562传代细胞取2×106细胞，4℃ 3 000 r/min离心10 min，弃去上清液，PBS洗两遍，4℃ 3 000 r/min离心10 min，留沉降细胞。
待测标本，骨髓2 mL经肝素抗凝后，淋巴细胞分离液分离，取2×106细胞，PBS洗两遍，4℃ 3 000 r/min 10 min，留沉降细胞。
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(二)端粒酶的提取 取2×106细胞，加200 μL裂解液，冰浴中30 min,4℃ 16 000 r/min 20 min，留上清液。
(三)PCR扩增 取25 μL反应混合液，加3 μL细胞提取液，加双蒸水至50 μL。25℃反应30 min，94℃灭活5 min进入PCR循环：94℃ 30 s，50℃ 30 s，72℃ 90 s共30个循环，72℃延伸10 min，终止反应。
(四)ELISA 扩增产物5 μL加20 μL变性液混匀后，室温放置10 min； 加入225 μL杂交液混匀后，取100 μL加入亲和素包被的反应孔中37℃振荡2 h，弃去液体，清洗液250 μL洗3次； 加100 μL过氧化物酶标记的抗地高辛抗体，37℃反应30 min弃去液体，清洗液洗2次； 加入100 μL TMB显色液室温20 min； 加入100 μL终止液终止反应，静置20 min； 酶标仪测定450 nm和690 nm波长下的吸光度。
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(五)对照 阳性对照，试剂盒提供的293细胞株裂解上清液。 阴性对照，K562细胞株裂解上清液经65℃灭活10 min。
(六)计算与统计 以450 nm与690 nm的吸光度差值表示其端粒酶活性，并以样品测量值与试剂盒的阳性对照测量值的百分比作为其活性相对值。对各组数据(
±s)进行方差分析及q检验。结 果
一、 白血病细胞系J6-1，K562有较强的端粒酶活性，见表1。
表1 白血病细胞系的端粒酶活性
Tab 1 Telomerase activity of normal bone marrow,J6-1 and K562(
±s,n=10) Group, 百拇医药
Telomerase activity
Ⅰ(normal bone marrow)
9.85±0.68
Ⅱ(J6-1)
110.00±4.10**
Ⅲ(k562)
107.00±2.86**
** P<0.01， vs group
二、正常骨髓标本10例的端粒酶活性平均值为9.85±0.68，活性微弱。15例CML慢性期均值24.48±12.73，高于正常骨髓对照组(P<0.05)。9例CML加速期患者端粒酶活性均值为76.76±21.84，10例CML急变期患者端粒酶活性平均值为90.62±25.41，两者无显著差异(P>0.05)，但均明显高于慢性期患者(P<0.01，P<0.01)，而慢性期患者治疗后端粒酶活性平均值为18.12±6.27与慢性期患者端粒酶活性相比无显著的差异(P>0.05)，见表2。
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表2 正常骨髓及CML各期标本的端粒酶活性
Tab 2 Telomerase activity of normal bone marrow and
CML in different phases(
±s) Groupn
Telomerase activity
Ⅰ(normal bone marrow)
10
9.85±0.68
Ⅱ(CML chronic phase)
, http://www.100md.com
15
24.48±12.73*
Ⅲ(CML accelerated phase)
9
76.76±21.84*ΔΔ
Ⅳ(CML blast crisis phase)
10
90.62±25.41*ΔΔ#
Ⅴ(CML remission)
6
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18.12±6.27*●
* P<0.05, vs group Ⅰ; ΔΔP<0.01, vs group Ⅱ; #P>0.05, vs group Ⅲ; ●P>0.05, vs groupⅡ讨 论
端粒是真核细胞染色体末端的特殊结构，包括端粒DNA及其结合蛋白，能防止染色体被降解、融合及重组，正常细胞每分裂1次，端粒就会缩短。Harley等提出[1]：端粒可称为细胞的“分裂钟”，它决定着细胞的复制能力。当正常细胞的端粒缩短到临界点时，就会起动停止细胞分裂信号而走向衰老和死亡。端粒酶是一种核糖蛋白复合体，以自身的RNA为模板在端粒末端合成新的重复序列而使端粒延长，稳定染色体结构。文献报道在人体正常细胞端粒酶活性为阴性，而在胚系和肿瘤细胞中存在端粒酶活性，Kim等报道98%已建株的肿瘤细胞系，90%原发性肿瘤皆表现端粒酶活性[2，5]，表明端粒酶活性与细胞增殖与肿瘤发生有密切关系，Shay等[3，4]指出，多数AML和ALL有较强的端粒酶活性，早期的CLL端粒酶活性低于正常对照，而晚期则活性水平增高。
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本实验结果表明：(1)正常骨髓标本显示出微弱的端粒酶活性(9.85±0.68),而白血病细胞系K562、J6-1则显示出较强的端粒酶活性(107±2.68,110±4.10),阴性对照K562细胞株裂解上清液经65℃,灭活10 min,端粒酶活性比值仅为0.66±0.02,n=10。(2)CML慢性期患者的端粒酶活性高于正常骨髓组，CML慢性期患者经治疗后(化疗3个月～2年)，端粒酶活性虽有下降趋势，但与CML慢性期组无显著差异并仍高于正常骨髓组，说明其端粒酶活性来源于残留的白血病细胞，提示端粒酶活性可作为其预后的指标。(3)CML加速期和急变期患者的端粒酶活性并无明显差异，只是急变期有升高的趋势，但均明显高于正常骨髓组，与慢性期患者相比也有明显增高，提示端粒酶活性可作为CML白血病恶化的标志，即端粒酶的异常激活使之进入了加速期。因而端粒酶活性与CML的病程有密切关系。(4)本研究采用端粒酶PCR-ELISA技术具有灵敏度高无同位素污染的特点 ，且操作简便，一次可测多个样品。因而端粒酶PCR-ELISA技术测定端粒酶活性可作为CML的临床诊断，判断病程以及预后的新指标。
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[参 考 文 献]
[1] Harley C. Telomere loss: mitotic clock or genetic time bomb[J]? Mutat Res， 1991, 256: 271～282.
[2] Harley CB, Futcher AB, Greider CW, et al. Telomeres shortern during ageing of human fibroblasts[J]. Nature， 1990, 345: 458～466.
[3] Shay JW, Weibin H, Wright WE, et al. Telomeres and telomerase in human leukemias[J]. Leukemia， 1996, 10: 1255～1261.
, 百拇医药 [4] Counter CM，Gupta J，Harley CB, et al. Telomarase activity in normal leukocytes and in hematologic malignancies[J]. Blood， 1995，85：2315～2320.
[5] Kim JL，Piatyszek MA，Prowse KR，et al. Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer[J]. Science， 1994，266：2011～2015.
[6] 卫立辛，吴孟超，郭亚军.端粒酶活性检测方法研究进展[J]. 国外医学临床生物化学与检验学分册， 1998, 19(2):63～64.
[7] 谢万灼，林茂芳.端粒及端粒酶在恶性血液病中的研究进展[J].国外医学输血及血液学分册，1998, 21(4):234～237.
[收稿日期] 1999-12-17 [修回日期] 2000-03-20
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