高胆固醇诱发 Oddi括约肌功能紊乱实验研究
作者：魏经国 杜凡 王耀程 王玮
单位：(西安第四军医大学唐都医院放射科，陕西 西安 710038)
关键词：胆固醇；奥狄氏括约肌；显微镜检查，电子
中国病理生理杂志000518
[摘 要] 目的：探讨高胆固醇血症胆管 Oddi括约肌功能改变特征及病理组织基础。方法：纯种新西兰兔24只，随机分为3组，喂饲胆固醇饲料制作高胆固醇血症模型。采用胆管造影，单腔管测压，一氧化氮合酶定量分析等方法，研究胆管 Oddi括约肌影像、功能及病理组织学的特征。结果：高胆固醇血症胆管Oddi括约肌近侧低压段基础压力实验Ⅰ组和Ⅱ组(20.9±6.1) mmHg，(25.6±9.1) mmHg显著高于对照组(11.7±2.8) mmHg，(P<0.01， P<0.01)， 远端高压“阀门”段的基础压力实验Ⅰ、Ⅱ组(138.4±45.5) mmHg，(144.5± 40.4) mmHg与对照组(69.3±9.8) mmHg比较，差异非常显著(P<0.01，P<0.01)。胆囊容积增大，实验Ⅰ、Ⅱ组(3.4 ±1.0) mL, (3.9 ±1.9) mL明显大于对照组(2.0±1.9) mL(P<0.05， P<0.01)。一氧化氮合酶定量分析各组间无明显差异(P>0.05 )。实验组胆管 Oddi括约肌细胞体积增大，细胞膜扭曲呈波浪状。细肌丝疏松，排列紊乱，密体分布不均，形态大小不一致，长轴与细肌丝纵轴成角。线粒体肿胀，嵴消失，聚集於细胞核一端。染色质浓集於细胞核边缘。结论：高胆固醇可损害胆管Oddi括约肌的舒张功能，诱发Oddi括约肌功能紊乱，导致胆管Oddi括约肌排胆阻力增加而致胆囊淤胆。
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[中图分类号] R575.7 [文献标识码] A
[文章编号] 1000-4718(2000)05-0446-05
An experimental study of hypercholesterolemia-induced disorder of Oddi's sphincter
WEI Jing-guo, DU Fan, WANG Yao-cheng, WANG Wei
(Department of Radiology, Tangdu Hospital, The Fourth Military Medical University, Xian 710038,China)
[Abstract] AIM：To investigate the functional changes and histopathological basis of Oddi's sphincter under hypercholesterolemia. METHODS:Twenty-four New Zealand rabbits were equally divided into three groups randomly. Experimental groups I and II fed with cholesterol-added forage for 4 and 8 weeks respectively before sacrificed. Images, functions and histopathological characteristics of Oddi's sphincters of experimental groups were studied and compared with control group by cholangiography, catheter manometry, and quantitative analysis of nitric oxide synthase. RESULTS:The basal pressures of proximal low-pressure segment of Oddi's sphincter of both experimental groups I and II (20.9±6.1 mmHg, 25.6±9.1 mmHg, respectively) were higher than those of control group significantly (11.7±2.8 mmHg, P<0.01, P<0.01). The basal pressures of distal high-pressure “valve” segment of both experimental groups (138.4±45.5 mmHg and 144.5±40.4 mmHg, respectively) were significantly higher than those of control group (69.3±9.8 mmHg, P<0.01 and P<0.01). The gallbladder volumes of experimental group I and II (3.4±1.0 mL and 3.9±1.9 mL) were significantly larger than those of control group (2.0±1.9 mL, P<0.05 and P< 0.01). Between groups there were no significant differences in nitric oxide synthase contents. Enlargement of the cell volume, wavy distortion of the cell membrane, loosening and disarrangement of myofilament, uneven in size and distribution of dense body, angulation of longitudinal axis between dense body and myofilament, swelling, congregated at one end of nucleolus and disappearance of cristae of plasmosomes and concentration of chromosome at nucleolus margin were observed in experimental groups under electron-microscope. CONCLUSION: The diastole function of Oddi's sphincter could be damaged by hypercholesterolemia, inducing a functional disorder of Oddi's sphincter with increased resistance in bile excretion. The result is retention of bile in the gallbladder.
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[MeSH] Cholesterol; Oddi's sphincter; Microscope, electron
胆管Oddi括约肌功能紊乱(sphincter of Oddi dysfunction, SOD)的报告始见于胆囊切除术后的病人。由于病因不明，在排除炎症、结石、狭窄等器质性病变后，又将其称为胆囊术后综合征。随着经内镜逆行插管测压技术的应用，目前认为SOD最重要的改变为胆管Oddi括约肌(sphincter of Oddi, SO)基础压升高，并将其做为SOD诊断的金标准[1]。根据进一步研究，有作者[1、2]推测SOD不仅仅发生于胆囊切除术后的病人，认为在胆囊切除前可能就已经存在SOD。虽然1997年Szilvassy等[3]发现并首先报道临床证实的1例高胆固醇及高甘油三脂血症伴有SO功能异常的病例，但到目前为止尚无动物模型及组织形态学观察证实这一观点。
胆囊胆汁淤积是胆囊结石形成的重要先决条件。根据解剖结构特征，胆管SO是胆囊及肝胆汁排泄的唯一通道，显然胆囊胆汁淤积与胆管SO功能状态有着直接关系。为了探讨在胆囊胆固醇结石形成前胆管SO的运动功能特征，我们用兔复制高胆固醇血症模型，观察高胆固醇血症作用下胆管SO影像功能变化及组织形态改变与胆囊淤胆间的关系。
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材 料 和 方 法
一、动物模型复制及判断标准
纯种新西兰兔24只，3～4个月龄，体重2.0～2.5 kg，购自本校动物实验中心。随机分为3组，每组8只。对照组：标准饲料；实验Ⅰ组：标准饲料+胆固醇喂养4周；实验Ⅱ组：标准饲料+胆固醇喂养8周。胆固醇(长沙生物化学制药厂，纯度98%，磷脂含量0.1%)每日1.0 g混入饲料中，喂6 d后停饲1 d。
实验开始前测定兔血清总胆固醇含量，以血清胆固醇<3 mmol/L为正常标准，血清胆固醇>3 mmol/L即弃去该兔。血清总胆固醇>10 mmol/L定为高胆固醇血症标准[4]。
二、检测指标
(一)Oddi括约肌压力测定 用Cooker公司生产的5F血管造影导管自行改制成测压导管。导管长度90 cm，外径1.6 mm。将尖端封闭，距尖端10 mm处开一直径0.4 mm侧孔。测压仪器：RM-6200C四导生理记录仪(成都仪器厂)，PT-16M压力传感器(上海高联传感技术公司)，WZS-50微量灌注泵(浙江医科大学医学仪器厂)。灌注水流速度恒定于0.25 mL/min，测压系统测压前校准。
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术前禁食14～18 h，氯氨酮(陕西省医药研究所) 30 mg/kg肌注麻醉，以后每0.5 h追加半量。取上腹正中切口开腹，切开十二脂肠，经十二指肠乳头将测压导管逆行插入胆总管。描记胆总管压力曲线，稳定5 min后开始测压。每次向外牵拉约2.0 mm直至测压孔完全进入十二指肠，分段描记压力曲线，记录SO各处基础压，收缩波幅。压力曲线以十二指肠压力“零”基线。经导管注入30%泛影葡胺，待肝外胆管全部显影后以25幅/S电影拍摄SO段排胆时的形态特征。
(二)一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, NOS)的NADPH染色及图像分析 每组随机取3例做NADPH染色。测压后立即切取SO组织，置于4%多聚甲醛PBS溶液中，在4℃下放置16～18 h，随即在10%蔗糖溶液中低温保存。恒冷箱(-25℃)冰冻切片(30μm厚)，封固于载玻片上，然后按下列顺序染色：1 mmol/L NADPH(还原型)，0.2 mmol/L硝基四唑氮蓝染色，0.1 mmol/L Tris HCl(pH7.2)，0.2% Triton X-100在37℃下孵育30 min[5]，切片。采用同济医科大学清平影像工程公司多媒体彩色病理图文分析系统进行分析。每张切片随机在平滑肌部位确定4处做图像分析。亮度调节至平均光密度为100，存入图像，域分割，自动测量单位面积中的NADPH的总数量、总面积、平均玄长和平均空间距，逐一储存数据并进行统计学分析。
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(三)新西兰兔于喂胆固醇前、中和术晨取耳静脉血测定血清总胆固醇含量。
(四)SO测压结束后切下胆囊，测量胆汁量，作为禁食状态下的胆囊容积。
(五)组织学检查 每组随机选取2例做光镜观察的标本用10%福尔马林固定，HE染色。3例透射电镜观察标本制作：测压后立即取下SO组织，用锋利刀片切成1 mm小块，迅速浸入3%戊二醛溶液中，此过程在1 min内完成。在4℃下预固定2～4 h。按常规进行固定、脱水、包埋、超薄切片，铅/铀双染，JEM-2000EX透射电镜观察。
三、统计方法
实验数据用
±s表示，组间采用t检验进行统计处理。
结 果
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一、对照组及实验Ⅰ组、 Ⅱ组喂饲前血清总胆固醇均正常(<3 mmol/L)，各组间均无明显差别。喂饲胆固醇后，实验Ⅰ组、Ⅱ组血清胆固醇分别为(30.61±3.32) mmol/L和(29.03±2.59)mmol/L，明显高于对照组及喂饲胆固醇前实验组血清胆固醇含量(P<0.01)，实验Ⅰ组、Ⅱ组间无明显差别(P>0.05)。
二、胆囊容积
实验Ⅰ组、Ⅱ组及对照组胆囊容积分别为(3.4±1.0) mL、(3.9±1.9) mL和(2.0±1.9) mL，实验Ⅰ组、Ⅱ组胆囊容积明显大于对照组(P<0.05，P<0.01)，实验Ⅰ组、Ⅱ组之间无明显差别(P>0.05)。
三、排胆时SO段形态特征
对照组SO段在排胆时管腔粗细不均，伴随其舒、缩蠕动，胆汁呈“挤乳”样进入十二指肠。实验Ⅰ、Ⅱ组在整个排胆期SO管腔痉挛如“线”状，管径未见明显变化。
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四、测压结果
表1 兔SO压力测定结果
Tab 1 Manometry of rabbit’s SO(mmHg,±s,n=8)
SO proximal segment
SO high pressure zone
Basal
pressure
amplitude of phasic
contractions
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Basal
pressure
amplitude of phasic
contractions
Control
11.7±2.8
18.1±5.9
69.3±9.8
8.7±3.6
GroupⅠ
20.9±6.1*
, 百拇医药 6.4±4.5*
138.4±45.5*
4.2±2.2*
GroupⅡ
25.6±9.1*
6.7±4.8*
144.5±40.4*
3.4±2.2*
*P<0.01，vs control
(一)胆管SO测压结果(表1) SO壁外低压段基础压及SO时相性收缩波幅实验Ⅰ组、Ⅱ组之间无明显差别(P>0.05)。SO高压带的基础压及在高压带基础上的时相性收缩波幅实验Ⅰ组、Ⅱ组之间无明显差别(P>0.05)。
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(二)兔胆管SO压力曲线 对照组测压曲线显示SO末端存在一高压带(high pressure zone, HPZ)，特征为压力较恒定，基础压高，收缩波幅相对不明显。SO近侧段有一低压区，基础压明显低于HPZ，时相性收缩幅度较大，此段为SO的壁外低压段(图1)。实验组SO近侧低压区基础压升高，HPZ时相收缩不规则，幅度变小，几乎呈“直线”样改变(图2)。
Fig 1(a) Pressure curve of control rabbit's common bile duct and sphincter of Oddi and duodenum
CBD： common duct bile
图1 (a) 对照组兔总胆管，Oddi括约肌及十二指肠压力曲线
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Fig 1 (b) Enlarged pressure curve of control rabbit's sphincter
of Oddi
图1(b) 对照组兔Oddi括约肌放大压力曲线
Fig 2(a) Pressure curve of group Ⅰ rabbit's common bile duct and sphincter of Oddi and duodenum
图2(a) 实验Ⅰ组兔总胆管，Oddi括约肌、十二指肠压力曲线
Fig 2(b) Enlarged pressure curve of group Ⅰ rabbit's sphincter of Oddi
, 百拇医药
图2(b) 实验Ⅰ组兔Oddi括约肌放大压力曲线
Fig 3 In control group, SO myofilaments were parallel with cell's longitudinal axis and with a uniform density. The shape of dense body was similar and distributed evenly. Their longitudinal axis paralleled with myofilaments. There was structure-normal mitochondrion scatted at the top of nuclear. The crests were distinguishable
图3 对照组SO细肌丝与细胞长轴平行，排列整齐，密度均匀，密体形态大致相同，分布匀称，长轴与细肌丝排列方向一致。细胞核端见少数结构正常线粒体，嵴可辨认
, 百拇医药
五、NADPH染色的图像分析
NADPH染色后，分别计算NADPH着色总数、总面积、面数密度、面积百分数、平均玄长、平均空间距，对照组、实验Ⅰ组、实验Ⅱ组各组之间无显著差异(P>0.05，参考面积为13 550.6 μm)。
Fig 4 In experimental group, swelling of SO cells, loosening of myofilaments, irregularity in arrangement and blurry structure were shown. The dense body were distributed unevenly and with an irregular shape and size. Their axes were not parallel with the axes of myofilaments
, 百拇医药
图4 实验组SO细胞肿胀，细肌丝疏松，排列紊乱致细肌丝结构不清.密体分布不均，形态大小及其长轴与细肌丝排列方向成角
Fig 5 In experimental group, mitochondrion in SO cell congregated at one end and nuclear with vacuolization and concentration of chromatin congregated at brim of nuclear
图5 实验组SO细胞线粒体聚集细胞核一端，空泡变性，染色质浓集于细胞核边缘
六、病理组织检查结果
(一)光镜下观察所见 各组SO平滑肌排列规整，未见明显炎细胞浸润和胶原纤维、弹力纤维增多。
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(二)电镜观察所见 实验组SO细胞体积增大，细肌丝疏松，密体分布不均，形态不规则，排列与细肌丝长轴成角。细胞核、细胞器所占的比例增大。线粒体肿胀，空泡化，嵴消失，且集聚在细胞核一端。部分细胞核不规则，有凹陷，核膜间隙增宽，染色质浓集于细胞核边缘(图4～6)。
讨 论
SOD始见于胆囊切除后的病人，其主要特征为一过性右上腹痛，胆总管扩张及造影剂排空迟缓等，其中胆管SO基础压升高是诊断SOD的金标准。虽然对SOD的研究已有众多报道，但到目前为止尚无SOD模型，因而对其发生机制及组织学改变尚不清楚。Thune等[6]认为胆囊切除损伤了神经传导通路是SOD发生的基本原因。但是Choudbry等[2]报道，胆囊完整存在时胆管SO基础压亦可升高，据此他认为在胆囊切除前就已存在SOD。Steinberg等[7]和Meshknpour等[8]认为由于目前无胆囊完整存在的SOD动物模型，因此难以确定是否存在原发SOD。上述研究似乎提示除神经损伤为可能原因以外，尚有其它未知的因素可能诱发SOD。显然，深入研究SOD组织、形态学改变对阐明SOD发生机理有重要作用。
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传统观念认为，胆汁中胆固醇过度饱和是胆囊胆固醇结石形成的基本原因，胆囊收缩功能减低是结石形成的重要诱因，而胆囊收缩功能的减弱与胆固醇增高有着直接关系，但在结石形成过程中，高胆固醇血症是否会导致胆管SO的功能异常未见报道。Lange等[9]在研究胆囊成石与胆囊张力变化间的关系时发现，胆囊成石早期胆囊张力不仅未下降，反而升高，组织学观察显示胆囊肌层肥厚。实验研究表明[10]，胆管SO切开虽不能防止胆固醇结晶在胆囊内析出，却可防止胆囊结石形成，似乎说明胆囊淤胆及成石与胆管SO功能损害有关。Toouli等[11，12]根据与十二指肠壁间的解剖关系，将胆管SO分为壁外型和壁内型两种类型。对SO的功能解剖研究表明，草原犬胆管SO属於十二指肠壁外型，它可分为近侧低压段和远端高压的“阀门”段。我们的研究表明[13]，低压段具有主动舒张、收缩功能，是禁食状态下胆汁排出的主要动力源，而高压的“阀门”段除了具有防止十二指肠液返流的功能外，通过本身固有存在的蠕动收缩运动，在胆汁排出的过程中对胆流起着加速作用。由此可见SO的近侧低压段可能是保持胆管内压稳定的重要动力调节因素。我们的系列研究证实，在高胆固醇的作用下实验组胆囊胆汁呈淤积状态，但胆囊胆汁淤积并非胆囊壁肌层纤维化所致[14]。本结果说明，在高胆固醇血症作用下确可导致胆管SO的舒张功能的损害，使胆管SO低压段和高压“阀门”段均处于挛缩状态，导致SO低压段排胆动力减弱和排胆阻力增加，这可能是导致胆囊胆汁淤积的重要动力因素。
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关于高胆固醇血症引起胆管SOD的机制及其细胞超微结构的改变尚不清楚。Thune等报道[5]，一氧化氮(nitric oxide, NO)是平滑肌松弛的最终神经递质。Szilvassy等[3]的研究提示，胆管SO舒张功能受损与高脂血症破坏了释放NO的本底物质-戊基亚硝酸盐有关。本结果表明，实验组与对照组NOS数量无明显差别(P>0.05)，似乎也提示高胆固醇对胆管SO功能的损害作用与NO或NOS无直接关系。由于胆固醇是细胞膜的重要组成部分，体外细胞培养研究证实高胆固醇作用下有可能改变SO细胞膜的生物学特征，进而导致细胞内超微结构的变化而引起SO功能异常[15]。本实验观察结果显示，在高胆固醇作用下SO细胞骨架的空间结构发生异常改变，同时伴有明显的线粒体变性及分布异常(图5，6)，从组织病理学角度证实了原发SOD存在的可能性及SOD是一种功能性疾病的观点。
[参 考 文 献]
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[摘 要] 目的：探讨高胆固醇血症胆管 Oddi括约肌功能改变特征及病理组织基础。方法：纯种新西兰兔24只，随机分为3组，喂饲胆固醇饲料制作高胆固醇血症模型。采用胆管造影，单腔管测压，一氧化氮合酶定量分析等方法，研究胆管 Oddi括约肌影像、功能及病理组织学的特征。结果：高胆固醇血症胆管Oddi括约肌近侧低压段基础压力实验Ⅰ组和Ⅱ组(20.9±6.1) mmHg，(25.6±9.1) mmHg显著高于对照组(11.7±2.8) mmHg，(P<0.01， P<0.01)， 远端高压“阀门”段的基础压力实验Ⅰ、Ⅱ组(138.4±45.5) mmHg，(144.5± 40.4) mmHg与对照组(69.3±9.8) mmHg比较，差异非常显著(P<0.01，P<0.01)。胆囊容积增大，实验Ⅰ、Ⅱ组(3.4 ±1.0) mL, (3.9 ±1.9) mL明显大于对照组(2.0±1.9) mL(P<0.05， P<0.01)。一氧化氮合酶定量分析各组间无明显差异(P>0.05 )。实验组胆管 Oddi括约肌细胞体积增大，细胞膜扭曲呈波浪状。细肌丝疏松，排列紊乱，密体分布不均，形态大小不一致，长轴与细肌丝纵轴成角。线粒体肿胀，嵴消失，聚集於细胞核一端。染色质浓集於细胞核边缘。结论：高胆固醇可损害胆管Oddi括约肌的舒张功能，诱发Oddi括约肌功能紊乱，导致胆管Oddi括约肌排胆阻力增加而致胆囊淤胆。
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[中图分类号] R575.7 [文献标识码] A
[文章编号] 1000-4718(2000)05-0446-05
An experimental study of hypercholesterolemia-induced disorder of Oddi's sphincter
WEI Jing-guo, DU Fan, WANG Yao-cheng, WANG Wei
(Department of Radiology, Tangdu Hospital, The Fourth Military Medical University, Xian 710038,China)
[Abstract] AIM：To investigate the functional changes and histopathological basis of Oddi's sphincter under hypercholesterolemia. METHODS:Twenty-four New Zealand rabbits were equally divided into three groups randomly. Experimental groups I and II fed with cholesterol-added forage for 4 and 8 weeks respectively before sacrificed. Images, functions and histopathological characteristics of Oddi's sphincters of experimental groups were studied and compared with control group by cholangiography, catheter manometry, and quantitative analysis of nitric oxide synthase. RESULTS:The basal pressures of proximal low-pressure segment of Oddi's sphincter of both experimental groups I and II (20.9±6.1 mmHg, 25.6±9.1 mmHg, respectively) were higher than those of control group significantly (11.7±2.8 mmHg, P<0.01, P<0.01). The basal pressures of distal high-pressure “valve” segment of both experimental groups (138.4±45.5 mmHg and 144.5±40.4 mmHg, respectively) were significantly higher than those of control group (69.3±9.8 mmHg, P<0.01 and P<0.01). The gallbladder volumes of experimental group I and II (3.4±1.0 mL and 3.9±1.9 mL) were significantly larger than those of control group (2.0±1.9 mL, P<0.05 and P< 0.01). Between groups there were no significant differences in nitric oxide synthase contents. Enlargement of the cell volume, wavy distortion of the cell membrane, loosening and disarrangement of myofilament, uneven in size and distribution of dense body, angulation of longitudinal axis between dense body and myofilament, swelling, congregated at one end of nucleolus and disappearance of cristae of plasmosomes and concentration of chromosome at nucleolus margin were observed in experimental groups under electron-microscope. CONCLUSION: The diastole function of Oddi's sphincter could be damaged by hypercholesterolemia, inducing a functional disorder of Oddi's sphincter with increased resistance in bile excretion. The result is retention of bile in the gallbladder.
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胆管Oddi括约肌功能紊乱(sphincter of Oddi dysfunction, SOD)的报告始见于胆囊切除术后的病人。由于病因不明，在排除炎症、结石、狭窄等器质性病变后，又将其称为胆囊术后综合征。随着经内镜逆行插管测压技术的应用，目前认为SOD最重要的改变为胆管Oddi括约肌(sphincter of Oddi, SO)基础压升高，并将其做为SOD诊断的金标准[1]。根据进一步研究，有作者[1、2]推测SOD不仅仅发生于胆囊切除术后的病人，认为在胆囊切除前可能就已经存在SOD。虽然1997年Szilvassy等[3]发现并首先报道临床证实的1例高胆固醇及高甘油三脂血症伴有SO功能异常的病例，但到目前为止尚无动物模型及组织形态学观察证实这一观点。
胆囊胆汁淤积是胆囊结石形成的重要先决条件。根据解剖结构特征，胆管SO是胆囊及肝胆汁排泄的唯一通道，显然胆囊胆汁淤积与胆管SO功能状态有着直接关系。为了探讨在胆囊胆固醇结石形成前胆管SO的运动功能特征，我们用兔复制高胆固醇血症模型，观察高胆固醇血症作用下胆管SO影像功能变化及组织形态改变与胆囊淤胆间的关系。
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材 料 和 方 法
一、动物模型复制及判断标准
纯种新西兰兔24只，3～4个月龄，体重2.0～2.5 kg，购自本校动物实验中心。随机分为3组，每组8只。对照组：标准饲料；实验Ⅰ组：标准饲料+胆固醇喂养4周；实验Ⅱ组：标准饲料+胆固醇喂养8周。胆固醇(长沙生物化学制药厂，纯度98%，磷脂含量0.1%)每日1.0 g混入饲料中，喂6 d后停饲1 d。
实验开始前测定兔血清总胆固醇含量，以血清胆固醇<3 mmol/L为正常标准，血清胆固醇>3 mmol/L即弃去该兔。血清总胆固醇>10 mmol/L定为高胆固醇血症标准[4]。
二、检测指标
(一)Oddi括约肌压力测定 用Cooker公司生产的5F血管造影导管自行改制成测压导管。导管长度90 cm，外径1.6 mm。将尖端封闭，距尖端10 mm处开一直径0.4 mm侧孔。测压仪器：RM-6200C四导生理记录仪(成都仪器厂)，PT-16M压力传感器(上海高联传感技术公司)，WZS-50微量灌注泵(浙江医科大学医学仪器厂)。灌注水流速度恒定于0.25 mL/min，测压系统测压前校准。
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术前禁食14～18 h，氯氨酮(陕西省医药研究所) 30 mg/kg肌注麻醉，以后每0.5 h追加半量。取上腹正中切口开腹，切开十二脂肠，经十二指肠乳头将测压导管逆行插入胆总管。描记胆总管压力曲线，稳定5 min后开始测压。每次向外牵拉约2.0 mm直至测压孔完全进入十二指肠，分段描记压力曲线，记录SO各处基础压，收缩波幅。压力曲线以十二指肠压力“零”基线。经导管注入30%泛影葡胺，待肝外胆管全部显影后以25幅/S电影拍摄SO段排胆时的形态特征。
(二)一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, NOS)的NADPH染色及图像分析 每组随机取3例做NADPH染色。测压后立即切取SO组织，置于4%多聚甲醛PBS溶液中，在4℃下放置16～18 h，随即在10%蔗糖溶液中低温保存。恒冷箱(-25℃)冰冻切片(30μm厚)，封固于载玻片上，然后按下列顺序染色：1 mmol/L NADPH(还原型)，0.2 mmol/L硝基四唑氮蓝染色，0.1 mmol/L Tris HCl(pH7.2)，0.2% Triton X-100在37℃下孵育30 min[5]，切片。采用同济医科大学清平影像工程公司多媒体彩色病理图文分析系统进行分析。每张切片随机在平滑肌部位确定4处做图像分析。亮度调节至平均光密度为100，存入图像，域分割，自动测量单位面积中的NADPH的总数量、总面积、平均玄长和平均空间距，逐一储存数据并进行统计学分析。
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(三)新西兰兔于喂胆固醇前、中和术晨取耳静脉血测定血清总胆固醇含量。
(四)SO测压结束后切下胆囊，测量胆汁量，作为禁食状态下的胆囊容积。
(五)组织学检查 每组随机选取2例做光镜观察的标本用10%福尔马林固定，HE染色。3例透射电镜观察标本制作：测压后立即取下SO组织，用锋利刀片切成1 mm小块，迅速浸入3%戊二醛溶液中，此过程在1 min内完成。在4℃下预固定2～4 h。按常规进行固定、脱水、包埋、超薄切片，铅/铀双染，JEM-2000EX透射电镜观察。
三、统计方法
实验数据用
±s表示，组间采用t检验进行统计处理。结 果
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一、对照组及实验Ⅰ组、 Ⅱ组喂饲前血清总胆固醇均正常(<3 mmol/L)，各组间均无明显差别。喂饲胆固醇后，实验Ⅰ组、Ⅱ组血清胆固醇分别为(30.61±3.32) mmol/L和(29.03±2.59)mmol/L，明显高于对照组及喂饲胆固醇前实验组血清胆固醇含量(P<0.01)，实验Ⅰ组、Ⅱ组间无明显差别(P>0.05)。
二、胆囊容积
实验Ⅰ组、Ⅱ组及对照组胆囊容积分别为(3.4±1.0) mL、(3.9±1.9) mL和(2.0±1.9) mL，实验Ⅰ组、Ⅱ组胆囊容积明显大于对照组(P<0.05，P<0.01)，实验Ⅰ组、Ⅱ组之间无明显差别(P>0.05)。
三、排胆时SO段形态特征
对照组SO段在排胆时管腔粗细不均，伴随其舒、缩蠕动，胆汁呈“挤乳”样进入十二指肠。实验Ⅰ、Ⅱ组在整个排胆期SO管腔痉挛如“线”状，管径未见明显变化。
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四、测压结果
表1 兔SO压力测定结果
Tab 1 Manometry of rabbit’s SO(mmHg,
±s,n=8)SO proximal segment
SO high pressure zone
Basal
pressure
amplitude of phasic
contractions
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Basal
pressure
amplitude of phasic
contractions
Control
11.7±2.8
18.1±5.9
69.3±9.8
8.7±3.6
GroupⅠ
20.9±6.1*
, 百拇医药 6.4±4.5*
138.4±45.5*
4.2±2.2*
GroupⅡ
25.6±9.1*
6.7±4.8*
144.5±40.4*
3.4±2.2*
*P<0.01，vs control
(一)胆管SO测压结果(表1) SO壁外低压段基础压及SO时相性收缩波幅实验Ⅰ组、Ⅱ组之间无明显差别(P>0.05)。SO高压带的基础压及在高压带基础上的时相性收缩波幅实验Ⅰ组、Ⅱ组之间无明显差别(P>0.05)。
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(二)兔胆管SO压力曲线 对照组测压曲线显示SO末端存在一高压带(high pressure zone, HPZ)，特征为压力较恒定，基础压高，收缩波幅相对不明显。SO近侧段有一低压区，基础压明显低于HPZ，时相性收缩幅度较大，此段为SO的壁外低压段(图1)。实验组SO近侧低压区基础压升高，HPZ时相收缩不规则，幅度变小，几乎呈“直线”样改变(图2)。
Fig 1(a) Pressure curve of control rabbit's common bile duct and sphincter of Oddi and duodenum
CBD： common duct bile
图1 (a) 对照组兔总胆管，Oddi括约肌及十二指肠压力曲线
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Fig 1 (b) Enlarged pressure curve of control rabbit's sphincter
of Oddi
图1(b) 对照组兔Oddi括约肌放大压力曲线
Fig 2(a) Pressure curve of group Ⅰ rabbit's common bile duct and sphincter of Oddi and duodenum
图2(a) 实验Ⅰ组兔总胆管，Oddi括约肌、十二指肠压力曲线
Fig 2(b) Enlarged pressure curve of group Ⅰ rabbit's sphincter of Oddi
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图2(b) 实验Ⅰ组兔Oddi括约肌放大压力曲线
Fig 3 In control group, SO myofilaments were parallel with cell's longitudinal axis and with a uniform density. The shape of dense body was similar and distributed evenly. Their longitudinal axis paralleled with myofilaments. There was structure-normal mitochondrion scatted at the top of nuclear. The crests were distinguishable
图3 对照组SO细肌丝与细胞长轴平行，排列整齐，密度均匀，密体形态大致相同，分布匀称，长轴与细肌丝排列方向一致。细胞核端见少数结构正常线粒体，嵴可辨认
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五、NADPH染色的图像分析
NADPH染色后，分别计算NADPH着色总数、总面积、面数密度、面积百分数、平均玄长、平均空间距，对照组、实验Ⅰ组、实验Ⅱ组各组之间无显著差异(P>0.05，参考面积为13 550.6 μm)。
Fig 4 In experimental group, swelling of SO cells, loosening of myofilaments, irregularity in arrangement and blurry structure were shown. The dense body were distributed unevenly and with an irregular shape and size. Their axes were not parallel with the axes of myofilaments
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图4 实验组SO细胞肿胀，细肌丝疏松，排列紊乱致细肌丝结构不清.密体分布不均，形态大小及其长轴与细肌丝排列方向成角
Fig 5 In experimental group, mitochondrion in SO cell congregated at one end and nuclear with vacuolization and concentration of chromatin congregated at brim of nuclear
图5 实验组SO细胞线粒体聚集细胞核一端，空泡变性，染色质浓集于细胞核边缘
六、病理组织检查结果
(一)光镜下观察所见 各组SO平滑肌排列规整，未见明显炎细胞浸润和胶原纤维、弹力纤维增多。
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(二)电镜观察所见 实验组SO细胞体积增大，细肌丝疏松，密体分布不均，形态不规则，排列与细肌丝长轴成角。细胞核、细胞器所占的比例增大。线粒体肿胀，空泡化，嵴消失，且集聚在细胞核一端。部分细胞核不规则，有凹陷，核膜间隙增宽，染色质浓集于细胞核边缘(图4～6)。
讨 论
SOD始见于胆囊切除后的病人，其主要特征为一过性右上腹痛，胆总管扩张及造影剂排空迟缓等，其中胆管SO基础压升高是诊断SOD的金标准。虽然对SOD的研究已有众多报道，但到目前为止尚无SOD模型，因而对其发生机制及组织学改变尚不清楚。Thune等[6]认为胆囊切除损伤了神经传导通路是SOD发生的基本原因。但是Choudbry等[2]报道，胆囊完整存在时胆管SO基础压亦可升高，据此他认为在胆囊切除前就已存在SOD。Steinberg等[7]和Meshknpour等[8]认为由于目前无胆囊完整存在的SOD动物模型，因此难以确定是否存在原发SOD。上述研究似乎提示除神经损伤为可能原因以外，尚有其它未知的因素可能诱发SOD。显然，深入研究SOD组织、形态学改变对阐明SOD发生机理有重要作用。
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传统观念认为，胆汁中胆固醇过度饱和是胆囊胆固醇结石形成的基本原因，胆囊收缩功能减低是结石形成的重要诱因，而胆囊收缩功能的减弱与胆固醇增高有着直接关系，但在结石形成过程中，高胆固醇血症是否会导致胆管SO的功能异常未见报道。Lange等[9]在研究胆囊成石与胆囊张力变化间的关系时发现，胆囊成石早期胆囊张力不仅未下降，反而升高，组织学观察显示胆囊肌层肥厚。实验研究表明[10]，胆管SO切开虽不能防止胆固醇结晶在胆囊内析出，却可防止胆囊结石形成，似乎说明胆囊淤胆及成石与胆管SO功能损害有关。Toouli等[11，12]根据与十二指肠壁间的解剖关系，将胆管SO分为壁外型和壁内型两种类型。对SO的功能解剖研究表明，草原犬胆管SO属於十二指肠壁外型，它可分为近侧低压段和远端高压的“阀门”段。我们的研究表明[13]，低压段具有主动舒张、收缩功能，是禁食状态下胆汁排出的主要动力源，而高压的“阀门”段除了具有防止十二指肠液返流的功能外，通过本身固有存在的蠕动收缩运动，在胆汁排出的过程中对胆流起着加速作用。由此可见SO的近侧低压段可能是保持胆管内压稳定的重要动力调节因素。我们的系列研究证实，在高胆固醇的作用下实验组胆囊胆汁呈淤积状态，但胆囊胆汁淤积并非胆囊壁肌层纤维化所致[14]。本结果说明，在高胆固醇血症作用下确可导致胆管SO的舒张功能的损害，使胆管SO低压段和高压“阀门”段均处于挛缩状态，导致SO低压段排胆动力减弱和排胆阻力增加，这可能是导致胆囊胆汁淤积的重要动力因素。
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关于高胆固醇血症引起胆管SOD的机制及其细胞超微结构的改变尚不清楚。Thune等报道[5]，一氧化氮(nitric oxide, NO)是平滑肌松弛的最终神经递质。Szilvassy等[3]的研究提示，胆管SO舒张功能受损与高脂血症破坏了释放NO的本底物质-戊基亚硝酸盐有关。本结果表明，实验组与对照组NOS数量无明显差别(P>0.05)，似乎也提示高胆固醇对胆管SO功能的损害作用与NO或NOS无直接关系。由于胆固醇是细胞膜的重要组成部分，体外细胞培养研究证实高胆固醇作用下有可能改变SO细胞膜的生物学特征，进而导致细胞内超微结构的变化而引起SO功能异常[15]。本实验观察结果显示，在高胆固醇作用下SO细胞骨架的空间结构发生异常改变，同时伴有明显的线粒体变性及分布异常(图5，6)，从组织病理学角度证实了原发SOD存在的可能性及SOD是一种功能性疾病的观点。
[参 考 文 献]
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