膜环境高温对下丘脑神经元膜上钾通道电压依赖性的影响
作者：蔡春青 邹飞 朱受成
单位：(第一军医大学高温医学研究室， 广东 广州 5105150)
关键词：温度；钾通道；下丘脑；神经元
中国病理生理杂志000516
[摘 要] 目的：观察膜环境高温对下丘脑神经元延迟整流性K+通道(IK)电压依赖性的影响。方法：采用细胞贴附式的膜片钳技术。结果：高温可影响通道的电压依赖性，使电压依赖曲线发生正向移位，过高温度则使电压依赖性减弱甚或丧失。结论：IK电压依赖性的变化可能参与机体的发热和中暑发病过程。
[中图分类号] R594.1 [文献标识码] A
[文章编号] 1000-4718(2000)05-0440-03
, http://www.100md.com
Effect of membrane environment at high temperature on voltage-dependence of delayed rectifier K+ channel in hypothalamus neurons
CAI Chun-qing, ZOU Fei, ZHU Shou-cheng
(Department of Thermal Environmental Medicine, the First Military Medical University, Guangzhou 510515,China)
[Abstract] AIM：To observe the effects of high temperature on voltage-dependence of delayed rectifier K+ channel (Ik) in hypothalamus neurons.METHODS:The date recording from cell-attached patches of patch-clamp technique.RESULTS:With temperature raising, shift of voltage dependence may be mediated at different degree, while higher temperature might weaken and depressed. CONCLUSION:Shift of voltage dependence likely contributed to the body fever and heatstroke.
, 百拇医药
[MeSH] Temperature; Potassium channels; Hypothalamus; Neurons
下丘脑神经元参与体温调节，有较强的温度敏感性[1]，由于膜的兴奋性与K+通道有关，K+通道的电压依赖性能够影响神经元动作电位的时相，为此观察热应激和热损伤温度对下丘脑神经元延迟整流性钾通道(IK)电压依赖性的影响，为揭示机体发热和中暑的机制提供一些线索。
材 料 和 方 法
一、新生大鼠下丘脑神经元的急性分离
取5～10 d SD大鼠，断头取脑，在解剖显微镜下分离出下丘脑，放入盛有常温人工脑脊液的离心管中，其成份(mmol/L)为：NaCl 140，KCl 5，NaHCO3 20，NaH2PO4 1，CaCl2 2，MgSO4 2，葡萄糖 10， pH 7.4，通O2平衡30 min后移放入新配置的2.5%胰蛋白酶-人工脑脊液3 mL中，消化15 min取出，用针头划成丝状，加入2 mL DMEM液吸入离心管中，Pasteur吸管连续吹打，分散游离细胞，取上部悬液加到已涂有0.1%的多聚赖氨酸盖玻片上静置。
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二、神经元的温度处理
利用恒温灌流装置对浴槽液进行32℃、37℃、39℃和43℃温度液体的循环灌流，温度误差小于±0.5℃。40 min后对神经元进行单通道记录，浴槽液成份(mmol/L)为：NaCl 140，KCl 5，CaCl2 2，MgSO4 1，Hepes 10,TTX0.001，CdCl20.2(Sigma)，葡萄糖10，pH7.4。
三、单通道记录和资料分析
实验在倒置显微镜下进行，用微电极液压操纵器(NARISIGE)控制电极接近神经元，记录用玻璃微电极阻抗为8～12MΩ，封接阻抗大于5GΩ，电极液成份同浴槽液。采用的记录模式除说明外均为细胞贴附式，使用PCLAMP 6.0.2程序通过Digita 1200(Axon instrument CO.USA)支持的CEZ-2400型膜片钳放大器(NIHON KOHDENO，Japan)对下丘脑神经元单通道电流进行采样、分析和测量，忽略水平300 μs，数据采用方差分析处理，以
±s表示。
, 百拇医药
结 果
一、通道电流活动的特性
室温下采用细胞贴附式观察18例神经元活动，将电极电压(Vp)钳制为0mV时，即当Vp等于浴槽液电位，未见通道活动；当Vp为负时，膜去极化，波形显示为向下的外向电流。该电流随去极化程度增大而幅度增高，开放时间延长，表明通道存在电压依赖性(图1)。室温下采用内面向外式，膜片内外对称性地使用120 mmol/L[K+]o和[K+]i，钳制电位(Vh)为负时观察到内向电流，为正时则出现外向电流，翻转电位(Erev)始终接近于0mV(n=5)，平均单通道电导为(84±17) pS；当[K+]o浓度为0时，只观察到外向电流，用相同浓度的Na+取代K+，电流消失；当[K+]o/[K+]i为120/50 mmol/L时，Erev为(20±5) mV(n=3)；改变双侧[Cl]和[Ca2+]通道活动未见改变。用120 mmol/L的CsCl2取代细胞外液中的KCl时，通道电流消失；向浴槽液中加入20 mmol/L的4-AP，通道电流未见改变(n=7，P>0.05)；加入20 mmol/L的TEA，通道电流变小(P<0.05)。
, 百拇医药
Fig 1 IK currents recorded from a cell-attached membrane patch of acutely isolated hypothalamus neurons from SD postnatal rats
图1 下丘脑神经元膜上的IK电流
二、高温对通道电流电压依赖性的影响
(一)开放动力学 下丘脑神经元K+通道开放时间长短差异悬殊，采用二级指数拟合得到长、短两个时间常数，长时程开放时间常数(τ02)可以较好地反映通道的活动状态。当Vp从-20mV去极化到-60mV，32℃时，在14例膜片上观察到通道的长时程开放时间常数从(17.86±4.37) ms升至(88.28±32.59) ms(P<0.01)；当温度升至39℃时，τ02从(25.01±6.52) ms升至(142.84±28.17) ms(P<0.01)，电压依赖曲线向左上方移位。在相同的去极化水平两组相比有显著性差异(P<0.05)。32℃、37℃和39℃ 3组温度下τ02电压依赖性曲线的斜率分别为17.63、20.30和23.76(图2A)，表明温度升高可使τ02的电压依赖性发生迁移，通道开放时间延长。而当温度进一步升至43℃后，通道的τ02随膜电位的去极化整体上仍表现为增高趋势，但线形相关较差，局部出现不规则变化(图2B)。
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(二)开放概率 温度升高，开放概率(Po)增加，如图2C所示，在14例膜片中观察到，温度从32℃升至39℃后，当Vp由-20mV去极化到-60mV时，Po分别由0.027±0.011和0.433±0.147(P<0.05)升至0.217±0.067(P<0.05)和0.850±0.312(P<0.05)，可见升高温度和增大去极化水平，两者均可使Po升高，且二者存在协同作用。神经元经43℃处理后，去极化水平增加，Po曲线失去线形增高趋势，表现为不规则的变化(图2D)。
Fig 2 Effects of high temperature at 32℃、37℃、39℃(A，C) and 43℃(B，D) on voltage-dependence in open-time and Po of IK(±s,n=14)
, 百拇医药
图2 不同温度对IK开放时间和开放概率电压依赖性的影响
(三)爆发样开放 对通道活动的爆发样(Burst)开放进行分析拟合，发现通道的爆发样开放也具有温度依赖性(图3)，经43℃处理后，爆发样开放在开放时程(图3A)和Po(图3B)方面明显减小(P<0.05，n=16)。
Fig 3 Effects of heat stress and heat injury on burst open open time constant(A) and Po(B) of IK(±s，n=16)
图3 热应激热损伤温度对IK爆发样开放开放时程和开放概率的影响
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讨 论
本文记录到的通道对K+具有高度的选择通透性，在开放动力学方面具有明显的电压依赖性，结合对K+通道阻断剂的反应，提示为IK。下丘脑神经元IK在电流幅度、开关时程参数、开放概率等方面具有明显的电压依赖性，这种电压依赖性与分子结构有密切的关系。IK通道在结构上呈现为四聚体，各功能区中的S4段虽疏水但富含带正电荷的氨基酸残基[2]，这些门控电荷在S4段旋转[3]时可被邻近S1和S2段的负电荷所中和，IK电压依赖曲线移动的原因与这些电荷被中和有关[4]。高温可诱发通道电压依赖性的迁移和丧失，曲线表现为向更正的方向移动，一般在温度不超过40℃时出现，Griffin也有类似报道[5]，温度升高引起膜输入阻抗R(R＝1/g,g为电导)减小，并认为这与神经元的热敏感性提高有关。神经元的热敏感性表现为单位时间内动作电位频率的变化，快速复极化有利于提高单位时间内动作电位的发放频率，IK主要功能是复极化，因此这种迁移有利于神经元温度敏感性的提高。电压依赖曲线移动的原因与构象的变化引致电荷残基数的改变有关，而43℃的高温导致的电压依赖性丧失推测与高温破坏通道的四级结构或引致其构象变化的调节因素有关。这可能是导致机体在高温环境中体温调节发生障碍从而产生中暑的原因。
, 百拇医药
[基金项目] 国家自然科学基金(No. 39970810)和军队基金(No. 98M071)资助
[参 考 文 献]
[1] Boulant JA, Dean JB. Temperature receptors in the central nervous system[J]. Annu Rev Physiol, 1986, 48:639～654.
[2] Kelner KL. Ion channels:opening the gate[J]. Science, 1996,271:615.
[3] Papazian DM, Timple LC, Jan YN, et al. Alteration of voltage-dependence of shake potassium channels by mutation in the S4 sequence[J]. Nature, 1992,349:305～310.
, 百拇医药
[4] Liman ER, Hess P. Voltage-sensing residues in the S4 region of a mammalian K+ channel [J]. Nature, 1991, 353:752～756.
[5] Griffin JD, Boulant JA. Temperature effects on membrane potential and input resistance in rat hypothalamic neurons[J]. J Physiol, 1995,488:407～418.
[收稿日期]1999-03-16 [修回日期]1999-06-29
, 百拇医药
单位：(第一军医大学高温医学研究室， 广东 广州 5105150)
关键词：温度；钾通道；下丘脑；神经元
中国病理生理杂志000516
[摘 要] 目的：观察膜环境高温对下丘脑神经元延迟整流性K+通道(IK)电压依赖性的影响。方法：采用细胞贴附式的膜片钳技术。结果：高温可影响通道的电压依赖性，使电压依赖曲线发生正向移位，过高温度则使电压依赖性减弱甚或丧失。结论：IK电压依赖性的变化可能参与机体的发热和中暑发病过程。
[中图分类号] R594.1 [文献标识码] A
[文章编号] 1000-4718(2000)05-0440-03
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Effect of membrane environment at high temperature on voltage-dependence of delayed rectifier K+ channel in hypothalamus neurons
CAI Chun-qing, ZOU Fei, ZHU Shou-cheng
(Department of Thermal Environmental Medicine, the First Military Medical University, Guangzhou 510515,China)
[Abstract] AIM：To observe the effects of high temperature on voltage-dependence of delayed rectifier K+ channel (Ik) in hypothalamus neurons.METHODS:The date recording from cell-attached patches of patch-clamp technique.RESULTS:With temperature raising, shift of voltage dependence may be mediated at different degree, while higher temperature might weaken and depressed. CONCLUSION:Shift of voltage dependence likely contributed to the body fever and heatstroke.
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[MeSH] Temperature; Potassium channels; Hypothalamus; Neurons
下丘脑神经元参与体温调节，有较强的温度敏感性[1]，由于膜的兴奋性与K+通道有关，K+通道的电压依赖性能够影响神经元动作电位的时相，为此观察热应激和热损伤温度对下丘脑神经元延迟整流性钾通道(IK)电压依赖性的影响，为揭示机体发热和中暑的机制提供一些线索。
材 料 和 方 法
一、新生大鼠下丘脑神经元的急性分离
取5～10 d SD大鼠，断头取脑，在解剖显微镜下分离出下丘脑，放入盛有常温人工脑脊液的离心管中，其成份(mmol/L)为：NaCl 140，KCl 5，NaHCO3 20，NaH2PO4 1，CaCl2 2，MgSO4 2，葡萄糖 10， pH 7.4，通O2平衡30 min后移放入新配置的2.5%胰蛋白酶-人工脑脊液3 mL中，消化15 min取出，用针头划成丝状，加入2 mL DMEM液吸入离心管中，Pasteur吸管连续吹打，分散游离细胞，取上部悬液加到已涂有0.1%的多聚赖氨酸盖玻片上静置。
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二、神经元的温度处理
利用恒温灌流装置对浴槽液进行32℃、37℃、39℃和43℃温度液体的循环灌流，温度误差小于±0.5℃。40 min后对神经元进行单通道记录，浴槽液成份(mmol/L)为：NaCl 140，KCl 5，CaCl2 2，MgSO4 1，Hepes 10,TTX0.001，CdCl20.2(Sigma)，葡萄糖10，pH7.4。
三、单通道记录和资料分析
实验在倒置显微镜下进行，用微电极液压操纵器(NARISIGE)控制电极接近神经元，记录用玻璃微电极阻抗为8～12MΩ，封接阻抗大于5GΩ，电极液成份同浴槽液。采用的记录模式除说明外均为细胞贴附式，使用PCLAMP 6.0.2程序通过Digita 1200(Axon instrument CO.USA)支持的CEZ-2400型膜片钳放大器(NIHON KOHDENO，Japan)对下丘脑神经元单通道电流进行采样、分析和测量，忽略水平300 μs，数据采用方差分析处理，以
±s表示。, 百拇医药
结 果
一、通道电流活动的特性
室温下采用细胞贴附式观察18例神经元活动，将电极电压(Vp)钳制为0mV时，即当Vp等于浴槽液电位，未见通道活动；当Vp为负时，膜去极化，波形显示为向下的外向电流。该电流随去极化程度增大而幅度增高，开放时间延长，表明通道存在电压依赖性(图1)。室温下采用内面向外式，膜片内外对称性地使用120 mmol/L[K+]o和[K+]i，钳制电位(Vh)为负时观察到内向电流，为正时则出现外向电流，翻转电位(Erev)始终接近于0mV(n=5)，平均单通道电导为(84±17) pS；当[K+]o浓度为0时，只观察到外向电流，用相同浓度的Na+取代K+，电流消失；当[K+]o/[K+]i为120/50 mmol/L时，Erev为(20±5) mV(n=3)；改变双侧[Cl]和[Ca2+]通道活动未见改变。用120 mmol/L的CsCl2取代细胞外液中的KCl时，通道电流消失；向浴槽液中加入20 mmol/L的4-AP，通道电流未见改变(n=7，P>0.05)；加入20 mmol/L的TEA，通道电流变小(P<0.05)。
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Fig 1 IK currents recorded from a cell-attached membrane patch of acutely isolated hypothalamus neurons from SD postnatal rats
图1 下丘脑神经元膜上的IK电流
二、高温对通道电流电压依赖性的影响
(一)开放动力学 下丘脑神经元K+通道开放时间长短差异悬殊，采用二级指数拟合得到长、短两个时间常数，长时程开放时间常数(τ02)可以较好地反映通道的活动状态。当Vp从-20mV去极化到-60mV，32℃时，在14例膜片上观察到通道的长时程开放时间常数从(17.86±4.37) ms升至(88.28±32.59) ms(P<0.01)；当温度升至39℃时，τ02从(25.01±6.52) ms升至(142.84±28.17) ms(P<0.01)，电压依赖曲线向左上方移位。在相同的去极化水平两组相比有显著性差异(P<0.05)。32℃、37℃和39℃ 3组温度下τ02电压依赖性曲线的斜率分别为17.63、20.30和23.76(图2A)，表明温度升高可使τ02的电压依赖性发生迁移，通道开放时间延长。而当温度进一步升至43℃后，通道的τ02随膜电位的去极化整体上仍表现为增高趋势，但线形相关较差，局部出现不规则变化(图2B)。
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(二)开放概率 温度升高，开放概率(Po)增加，如图2C所示，在14例膜片中观察到，温度从32℃升至39℃后，当Vp由-20mV去极化到-60mV时，Po分别由0.027±0.011和0.433±0.147(P<0.05)升至0.217±0.067(P<0.05)和0.850±0.312(P<0.05)，可见升高温度和增大去极化水平，两者均可使Po升高，且二者存在协同作用。神经元经43℃处理后，去极化水平增加，Po曲线失去线形增高趋势，表现为不规则的变化(图2D)。
Fig 2 Effects of high temperature at 32℃、37℃、39℃(A，C) and 43℃(B，D) on voltage-dependence in open-time and Po of IK(
±s,n=14), 百拇医药
图2 不同温度对IK开放时间和开放概率电压依赖性的影响
(三)爆发样开放 对通道活动的爆发样(Burst)开放进行分析拟合，发现通道的爆发样开放也具有温度依赖性(图3)，经43℃处理后，爆发样开放在开放时程(图3A)和Po(图3B)方面明显减小(P<0.05，n=16)。
Fig 3 Effects of heat stress and heat injury on burst open open time constant(A) and Po(B) of IK(
±s，n=16)图3 热应激热损伤温度对IK爆发样开放开放时程和开放概率的影响
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讨 论
本文记录到的通道对K+具有高度的选择通透性，在开放动力学方面具有明显的电压依赖性，结合对K+通道阻断剂的反应，提示为IK。下丘脑神经元IK在电流幅度、开关时程参数、开放概率等方面具有明显的电压依赖性，这种电压依赖性与分子结构有密切的关系。IK通道在结构上呈现为四聚体，各功能区中的S4段虽疏水但富含带正电荷的氨基酸残基[2]，这些门控电荷在S4段旋转[3]时可被邻近S1和S2段的负电荷所中和，IK电压依赖曲线移动的原因与这些电荷被中和有关[4]。高温可诱发通道电压依赖性的迁移和丧失，曲线表现为向更正的方向移动，一般在温度不超过40℃时出现，Griffin也有类似报道[5]，温度升高引起膜输入阻抗R(R＝1/g,g为电导)减小，并认为这与神经元的热敏感性提高有关。神经元的热敏感性表现为单位时间内动作电位频率的变化，快速复极化有利于提高单位时间内动作电位的发放频率，IK主要功能是复极化，因此这种迁移有利于神经元温度敏感性的提高。电压依赖曲线移动的原因与构象的变化引致电荷残基数的改变有关，而43℃的高温导致的电压依赖性丧失推测与高温破坏通道的四级结构或引致其构象变化的调节因素有关。这可能是导致机体在高温环境中体温调节发生障碍从而产生中暑的原因。
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[基金项目] 国家自然科学基金(No. 39970810)和军队基金(No. 98M071)资助
[参 考 文 献]
[1] Boulant JA, Dean JB. Temperature receptors in the central nervous system[J]. Annu Rev Physiol, 1986, 48:639～654.
[2] Kelner KL. Ion channels:opening the gate[J]. Science, 1996,271:615.
[3] Papazian DM, Timple LC, Jan YN, et al. Alteration of voltage-dependence of shake potassium channels by mutation in the S4 sequence[J]. Nature, 1992,349:305～310.
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[4] Liman ER, Hess P. Voltage-sensing residues in the S4 region of a mammalian K+ channel [J]. Nature, 1991, 353:752～756.
[5] Griffin JD, Boulant JA. Temperature effects on membrane potential and input resistance in rat hypothalamic neurons[J]. J Physiol, 1995,488:407～418.
[收稿日期]1999-03-16 [修回日期]1999-06-29
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