氧化型低密度脂蛋白诱导血管内皮细胞凋亡及Fas抗原表达
作者：胡子旺 全智华 陈颜芳 王随照 林曙光
单位：胡子旺 全智华(衡阳医学院附一医院心内科，湖南 衡阳 421001)；陈颜芳 王随照 林曙光(广东省心血管病研究所， 广东 广州 510080)
关键词：脂蛋白，低密度； 内皮，血管；细胞；基因表达
中国病理生理杂志000509
[摘 要] 目的：探讨氧化型低密度脂蛋白(OX-LDL)对血管内皮细胞凋亡的影响及其可能的调控机制。方法：以0.1 μg/L和0.3 μg/L的OX-LDL作用培养的人脐静脉血管内皮细胞(EC)4 h，采用流式细胞仪碘化丙啶染色法检测细胞凋亡；提取细胞DNA，采用琼脂糖凝胶电泳，观察凋亡细胞DNA梯形带；提取细胞RNA，采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术检测Fas抗原基因表达。结果：OX-LDL处理能诱导EC凋亡，并存在一定的剂量效应关系，DNA电泳亦显示高剂量OX-LDL处理能产生的DNA片断比低剂量时更明显，而对照组无明显DNA梯形带出现。基础状态下FEC表达Fas抗原基因甚微，OX-LDL处理诱导其表达，并存在剂量依赖关系。结论：OX-LDL诱导EC凋亡，Fas抗原基因表达上调可能是调控机制之一。
, 百拇医药
[中图分类号] Q255 [文献标识码] A
[文章编号] 1000-4718(2000)05-0415-03
Oxided low density lipoproteins induce apoptosis with enhanced expression of Fas antigen in vascular endothelial cells
HU Zi-wang, QUAN Zhi-hua
(Department of Cardiovascular Medicine, the First Hospital of Hengyang Medical College, Hengyang 421001)
CHEN Yan-fang, WANG Sui-zhan, LIN Shu-guang
, 百拇医药
(Guangdong Cardiovascular Institute,Guangzhou 510080，China)
[Abstract] AIM: To explore the effect of oxides of low density lipoprotein (OX-LDL)on apoptosis in vascular endothelial cells(EC) and its possible mechanisms. METHODS:Cultured vascular ECS were incubated with OX-LDL(0.1 μg/L or 0.3 μg/L) for 4 hours,flow cytometer with PI staining method was used to determine the rate of cellular apoptosis, gel-electrophoresis was performed to observe the DNA ladder of apoptosis,cellular RNA was isolated and reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR)was performed to determine Fas antigen expression. RESULTS:OX-LDL treatment induced apoptosis in EC dose-dependently. No DNA ladder was observed in control EC.But it presented in EC treated with low dose of OX-LDL, and was even more when treated with higher dose of OX-LDL. RT-PCR revealed Fas antigen hardly had any expression in basic condition,OX-LDL treatment induced Fas antigen in EC in a dose dependent manner. CONCLUSION: OX-LDL can induce apoptosis in EC,upregulation of Fas antigen expression maybe one of the possible mechanisms.
, 百拇医药
[MeSH] Lipoproteins, LDL; Endothelium, vascular; Cells; Gene expression
高脂血症引起动脉粥样硬化的详细机制仍不十分清楚。血管内皮细胞损伤或功能障碍在动脉硬化发病中起重要作用[1]。近年来的研究表明血管内皮及平滑肌细胞的凋亡可能参与了动脉粥样硬化的发生和发展过程，但在基因水平的调控机制有待深入研究[2，3]。本研究旨在培养的人脐静脉内皮细胞上，观察OX-LDL对其凋亡的影响及其可能的基因调控机制。
材 料 和 方 法
一、人脐静脉血管内皮细胞培养
无菌条件下取正常妊娠分娩后脐带15～20 cm，以O-Hanks液冲洗去除脐静脉中的残留血迹后，用0.1%胶原酶充盈脐静脉，二端结扎，37℃温育15～20 min，收集消化液，以含20%胎牛血清的M199培养液终止反应，100 r/min离心10 min，细胞沉淀以含20%胎牛血清的M199培养重悬，种植于培养瓶中，置二氧化碳培养箱37℃培养。细胞生长汇片后用0.25%脂蛋白酶消化传代。实验用第三代汇片细胞。
, 百拇医药
二、低密度脂蛋白的分离和OX-LDL制备
取健康成人空腹血浆；采用顺序超离法，先以3 000 r/min离心18 h除去极低密度脂蛋白，再以4 000 r/min离心24 h分离低密度蛋白。将低密度脂蛋白置含10 μmol/L Ca2+的磷酸缓冲液中37℃温育7 h氧化。氧化后在含EDTA的磷酸缓冲液中透析24 h (4℃)。测定硫代巴比妥酸反应物值以判定脂蛋白是否被氧化。硫代巴比妥酸反应物在氧化型LDL为67.3～79.4 mmol/L.g蛋白。而非氧化型LDL为1.5～4.1 mmol/L.g蛋白。
三、细胞凋亡分析
用含10%胎牛血清M199培养液将人脐静脉血管内皮培养生长至第3代汇片，继用含15%胎牛血清的DMEM培养液(对照)和含0.1 μg/L和0.3 μg/L的OX-LDL的DMEM培养液(实验)在37℃ CO2培养箱中作用4 h。胰酶消化收获细胞，300×g离心3 min，以磷酸缓冲液洗细胞1次，相同条件下离心，细胞在70%乙醇中固定3 h，再以碘化丙啶染色，FAC-Scan流式细胞仪检测细胞周期，亚二倍体峰(subG1)为细胞凋亡峰，以Sub-G1占二倍体(G1)的百分率计算细胞凋亡率。另部分细胞用于提取DNA，经琼脂糖凝胶电泳观察细胞凋亡的DNA梯形带。
, 百拇医药
四、内皮细胞Fas抗原基因表达
采用酚/氯仿抽提一步法提取对照和实验组内皮细胞RNA，采用逆转录-聚合酶链反应技术(RT-PCR)测定Fas抗原基因mRNA水平的表达。Fas抗原基因引物为：上游引物5-GACCCAGAATACCAAGTGCA-3，下游引物5-TCTGTTCTGCTGTGTCTTGG-3。以三磷酸甘油醛脱氧酸(GAPDH)基因表达为内对照，GAPDH引物为：上游引物5-GCTTTTAACTCTGGTAAAGTGG-3，下游引物为5-TCACGCCACAGTTTCCCGGAGG-3。总反应体积为50 μL，含1.85×104 Bq [α-32p]dcTP(北京福瑞公司)，1×缓冲液，2.5 U Taq DNA聚合酶，200 μmol/L dNTP和50 pmol/L引物。反应条件为94 ℃ l min-55℃ 45 s-72℃ l min，共28个循环，首次循环在94℃变性5 min，最后一次循环在72℃延伸7 min。反应完毕取15 μL产物行1.2%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下切下特异性条带，行液闪γ计数。
, 百拇医药
五、数据处理
数据用均数±标准差(
±s)表示。均数差异显著性用t检验判定。
结 果
一、OX-LDL诱导血管内皮细胞凋亡
用流式细胞术PI染色法观察细胞凋亡时，对照组内皮细胞经流式细胞术检测凋亡率极低，DNA亚二倍体细胞(sub-G1)为0.9%±0.3%，0.1 μg/L OX-LDL处理细胞4 h时DNA亚二倍体细胞为5.1%±1.2%，与对照组比较存在显著差异(P<0.01)；0.3 μg/L OX-LDL处理细胞4 h时DNA亚二倍体细胞为12.8%±1.9%，与0.1 μg/L OX-LDL处理的细胞比较亦存在显著差异(P<0.01)，见图1。
, 百拇医药
Fig 1 Apoptosis of ECs induced by OX-LDL and measured by flow cytometer with PI staining
A：control; B：incubated with 0.1 μg/L of OX-LDL; C：incubated with 0.3 μg/L of OX-LDL
图1 流式细胞仪PI染色法测定OX-LDL诱导EC凋亡
Fig 2 DNA ladder induced by OX-LDL incubation in EC DNA electrophoresis; 1-2：control; 3-4：EC treated with 0.1 μg/L OX-LDL; 5-7：EC treated with 0.3 μg/L OX-LDL; 8：DNA marker l0.8 kb
, 百拇医药
图2 OX-LDL处理内皮细胞引起的DNA梯形图
DNA电泳显示对照组无明显DNA梯形带现象，而在OX-LDL处理后均可见到典型的细胞凋亡的DNA梯形图形，见图2。
二、OX-LDL处理对内皮细胞Fas抗原基因表达的影响
对照组内皮细胞Fas抗原mRNA转录表达极低，用OX-LDL处理4 h后细胞表达Fas抗原基因上调，并呈剂量依赖关系(表1)。
表1 OX-LDL处理对血管内皮细胞Fas抗原基因表达的影响
Tab 1 The effect of OX-LDL treatment on Fas antigen gene
expression in human endothelial cells (±s) Group
, http://www.100md.com
n
Fas antigen
GAPDH
Control
6
120±41
1 553±146
OX-LDL1
5
1 577±166**
1 670±165
OX-LDL2
, 百拇医药
5
2 314±203##
1 702±187
** P<0.01, vs control; ## P<0.01, vs OX-LDL1;OX-LDL1：incubation with 0.1 μg/L of OX-LDL； OX-LDL2：incubation with 0.3 μg/L of OX-LDL讨 论
氧化型低密度脂蛋白能作用于血管内皮细胞，引起内皮功能异常，在动脉粥样硬化发病中起重要作用[3，4]。正常血管内皮为单层细胞，细胞增殖和凋亡维持细胞正常更新和功能，因此，血管内皮细胞凋亡可能参与了动脉硬化的发生和发展过程。最近的研究表明，内皮细胞失去粘附可诱发凋亡[5]，肿瘤坏死因子可诱导培养内皮出现凋亡[6]。本研究在体外培养人脐静脉内皮细胞，观察到OX-LDL能诱导血管内皮凋亡，DNA电泳出现典型的梯形条带，且存在一定的剂量依赖关系。提示OX-LDL诱导EC凋亡可能在动脉硬化中具有重要的病理生理意义。
, 百拇医药
Fas抗原是属于肿瘤坏死因子受体家族，是一种细胞表面膜蛋白，是细胞凋亡基因之一，可介导心肌等细胞凋亡[7，8]。为进一步探讨OX─LDL调控EC凋亡的机制。检测了OX-LDL处理EC后Fas抗原基因的表达，结果显示OX-LDL能剂量依赖性诱导EC的Fas抗原mRNA水平表达，并与其调控EC凋亡相关联。因而提示Fas抗原基因表达可能是OX-LDL调控EC凋亡的机制之一。其确切机制和意义有待深入研究。
[参 考 文 献]
[1] Ross R. The pathogenesis of atherosclerosis a perspective for the 1900s[J]. Nature, 1993, 362:80～82.
[2] Geng ys Peter L. Evidence for apoptosis in advanced human atheroma[J]. Am J Pathol, 1995,147(2): 251～252.
, http://www.100md.com
[3] 陈颜芳,林曙光,余细勇，等.家兔腹主动脉球囊导管损伤后血管平滑肌细胞凋亡和一氧化氮合酶基因表达[J]. 中国动脉硬化杂志,1997,5(2):130～132.
[4] Tanner FC, Nou G, Boulanger CM, et al. Oxided low density lipoproteins inhibit relaxation of porcine coronary arteries[J]. Circulation, 1991, 83:2012～2013.
[5] 林曙光,陈颜芳,伍淑英，等. L-精氨酸抑制内皮细胞粘附分子-1表达与氧化型低密度脂蛋白促单核细胞粘附作用下降有关[J]. 中国动脉硬化杂志，1996，4(3):176～178.
[6] Re F, Zaneti A, Sironi M, et al. Inhibition of anchorage-dependent cell spreading tiggers apoptosis in cultured human endothelial cells[J]. J Cell Biol, 1994,124:537～539.
, http://www.100md.com
[7] Karsan A yee E,Harlan JM. Endothelial cell death induced by tumor necrosis factor-α is inhibited by the Bcl-2 family member A1[J]. J Biol Chem, 1996,271: 2720～2723.
[8] Tanaka M, Ito H, Adachi S, et al. Hypoxia induces apoptosis with enhance, expression of Fas antigen messenger RNA in cultured neonatal rat cadiomyocytes[J]. Circ Res, 1994,75:426～428.
[收稿日期] 1999-04-27 [修回日期] 1999-10-07
, http://www.100md.com
单位：胡子旺 全智华(衡阳医学院附一医院心内科，湖南 衡阳 421001)；陈颜芳 王随照 林曙光(广东省心血管病研究所， 广东 广州 510080)
关键词：脂蛋白，低密度； 内皮，血管；细胞；基因表达
中国病理生理杂志000509
[摘 要] 目的：探讨氧化型低密度脂蛋白(OX-LDL)对血管内皮细胞凋亡的影响及其可能的调控机制。方法：以0.1 μg/L和0.3 μg/L的OX-LDL作用培养的人脐静脉血管内皮细胞(EC)4 h，采用流式细胞仪碘化丙啶染色法检测细胞凋亡；提取细胞DNA，采用琼脂糖凝胶电泳，观察凋亡细胞DNA梯形带；提取细胞RNA，采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术检测Fas抗原基因表达。结果：OX-LDL处理能诱导EC凋亡，并存在一定的剂量效应关系，DNA电泳亦显示高剂量OX-LDL处理能产生的DNA片断比低剂量时更明显，而对照组无明显DNA梯形带出现。基础状态下FEC表达Fas抗原基因甚微，OX-LDL处理诱导其表达，并存在剂量依赖关系。结论：OX-LDL诱导EC凋亡，Fas抗原基因表达上调可能是调控机制之一。
, 百拇医药
[中图分类号] Q255 [文献标识码] A
[文章编号] 1000-4718(2000)05-0415-03
Oxided low density lipoproteins induce apoptosis with enhanced expression of Fas antigen in vascular endothelial cells
HU Zi-wang, QUAN Zhi-hua
(Department of Cardiovascular Medicine, the First Hospital of Hengyang Medical College, Hengyang 421001)
CHEN Yan-fang, WANG Sui-zhan, LIN Shu-guang
, 百拇医药
(Guangdong Cardiovascular Institute,Guangzhou 510080，China)
[Abstract] AIM: To explore the effect of oxides of low density lipoprotein (OX-LDL)on apoptosis in vascular endothelial cells(EC) and its possible mechanisms. METHODS:Cultured vascular ECS were incubated with OX-LDL(0.1 μg/L or 0.3 μg/L) for 4 hours,flow cytometer with PI staining method was used to determine the rate of cellular apoptosis, gel-electrophoresis was performed to observe the DNA ladder of apoptosis,cellular RNA was isolated and reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR)was performed to determine Fas antigen expression. RESULTS:OX-LDL treatment induced apoptosis in EC dose-dependently. No DNA ladder was observed in control EC.But it presented in EC treated with low dose of OX-LDL, and was even more when treated with higher dose of OX-LDL. RT-PCR revealed Fas antigen hardly had any expression in basic condition,OX-LDL treatment induced Fas antigen in EC in a dose dependent manner. CONCLUSION: OX-LDL can induce apoptosis in EC,upregulation of Fas antigen expression maybe one of the possible mechanisms.
, 百拇医药
[MeSH] Lipoproteins, LDL; Endothelium, vascular; Cells; Gene expression
高脂血症引起动脉粥样硬化的详细机制仍不十分清楚。血管内皮细胞损伤或功能障碍在动脉硬化发病中起重要作用[1]。近年来的研究表明血管内皮及平滑肌细胞的凋亡可能参与了动脉粥样硬化的发生和发展过程，但在基因水平的调控机制有待深入研究[2，3]。本研究旨在培养的人脐静脉内皮细胞上，观察OX-LDL对其凋亡的影响及其可能的基因调控机制。
材 料 和 方 法
一、人脐静脉血管内皮细胞培养
无菌条件下取正常妊娠分娩后脐带15～20 cm，以O-Hanks液冲洗去除脐静脉中的残留血迹后，用0.1%胶原酶充盈脐静脉，二端结扎，37℃温育15～20 min，收集消化液，以含20%胎牛血清的M199培养液终止反应，100 r/min离心10 min，细胞沉淀以含20%胎牛血清的M199培养重悬，种植于培养瓶中，置二氧化碳培养箱37℃培养。细胞生长汇片后用0.25%脂蛋白酶消化传代。实验用第三代汇片细胞。
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二、低密度脂蛋白的分离和OX-LDL制备
取健康成人空腹血浆；采用顺序超离法，先以3 000 r/min离心18 h除去极低密度脂蛋白，再以4 000 r/min离心24 h分离低密度蛋白。将低密度脂蛋白置含10 μmol/L Ca2+的磷酸缓冲液中37℃温育7 h氧化。氧化后在含EDTA的磷酸缓冲液中透析24 h (4℃)。测定硫代巴比妥酸反应物值以判定脂蛋白是否被氧化。硫代巴比妥酸反应物在氧化型LDL为67.3～79.4 mmol/L.g蛋白。而非氧化型LDL为1.5～4.1 mmol/L.g蛋白。
三、细胞凋亡分析
用含10%胎牛血清M199培养液将人脐静脉血管内皮培养生长至第3代汇片，继用含15%胎牛血清的DMEM培养液(对照)和含0.1 μg/L和0.3 μg/L的OX-LDL的DMEM培养液(实验)在37℃ CO2培养箱中作用4 h。胰酶消化收获细胞，300×g离心3 min，以磷酸缓冲液洗细胞1次，相同条件下离心，细胞在70%乙醇中固定3 h，再以碘化丙啶染色，FAC-Scan流式细胞仪检测细胞周期，亚二倍体峰(subG1)为细胞凋亡峰，以Sub-G1占二倍体(G1)的百分率计算细胞凋亡率。另部分细胞用于提取DNA，经琼脂糖凝胶电泳观察细胞凋亡的DNA梯形带。
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四、内皮细胞Fas抗原基因表达
采用酚/氯仿抽提一步法提取对照和实验组内皮细胞RNA，采用逆转录-聚合酶链反应技术(RT-PCR)测定Fas抗原基因mRNA水平的表达。Fas抗原基因引物为：上游引物5-GACCCAGAATACCAAGTGCA-3，下游引物5-TCTGTTCTGCTGTGTCTTGG-3。以三磷酸甘油醛脱氧酸(GAPDH)基因表达为内对照，GAPDH引物为：上游引物5-GCTTTTAACTCTGGTAAAGTGG-3，下游引物为5-TCACGCCACAGTTTCCCGGAGG-3。总反应体积为50 μL，含1.85×104 Bq [α-32p]dcTP(北京福瑞公司)，1×缓冲液，2.5 U Taq DNA聚合酶，200 μmol/L dNTP和50 pmol/L引物。反应条件为94 ℃ l min-55℃ 45 s-72℃ l min，共28个循环，首次循环在94℃变性5 min，最后一次循环在72℃延伸7 min。反应完毕取15 μL产物行1.2%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下切下特异性条带，行液闪γ计数。
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五、数据处理
数据用均数±标准差(
±s)表示。均数差异显著性用t检验判定。结 果
一、OX-LDL诱导血管内皮细胞凋亡
用流式细胞术PI染色法观察细胞凋亡时，对照组内皮细胞经流式细胞术检测凋亡率极低，DNA亚二倍体细胞(sub-G1)为0.9%±0.3%，0.1 μg/L OX-LDL处理细胞4 h时DNA亚二倍体细胞为5.1%±1.2%，与对照组比较存在显著差异(P<0.01)；0.3 μg/L OX-LDL处理细胞4 h时DNA亚二倍体细胞为12.8%±1.9%，与0.1 μg/L OX-LDL处理的细胞比较亦存在显著差异(P<0.01)，见图1。
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Fig 1 Apoptosis of ECs induced by OX-LDL and measured by flow cytometer with PI staining
A：control; B：incubated with 0.1 μg/L of OX-LDL; C：incubated with 0.3 μg/L of OX-LDL
图1 流式细胞仪PI染色法测定OX-LDL诱导EC凋亡
Fig 2 DNA ladder induced by OX-LDL incubation in EC DNA electrophoresis; 1-2：control; 3-4：EC treated with 0.1 μg/L OX-LDL; 5-7：EC treated with 0.3 μg/L OX-LDL; 8：DNA marker l0.8 kb
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图2 OX-LDL处理内皮细胞引起的DNA梯形图
DNA电泳显示对照组无明显DNA梯形带现象，而在OX-LDL处理后均可见到典型的细胞凋亡的DNA梯形图形，见图2。
二、OX-LDL处理对内皮细胞Fas抗原基因表达的影响
对照组内皮细胞Fas抗原mRNA转录表达极低，用OX-LDL处理4 h后细胞表达Fas抗原基因上调，并呈剂量依赖关系(表1)。
表1 OX-LDL处理对血管内皮细胞Fas抗原基因表达的影响
Tab 1 The effect of OX-LDL treatment on Fas antigen gene
expression in human endothelial cells (
±s) Group, http://www.100md.com
n
Fas antigen
GAPDH
Control
6
120±41
1 553±146
OX-LDL1
5
1 577±166**
1 670±165
OX-LDL2
, 百拇医药
5
2 314±203##
1 702±187
** P<0.01, vs control; ## P<0.01, vs OX-LDL1;OX-LDL1：incubation with 0.1 μg/L of OX-LDL； OX-LDL2：incubation with 0.3 μg/L of OX-LDL讨 论
氧化型低密度脂蛋白能作用于血管内皮细胞，引起内皮功能异常，在动脉粥样硬化发病中起重要作用[3，4]。正常血管内皮为单层细胞，细胞增殖和凋亡维持细胞正常更新和功能，因此，血管内皮细胞凋亡可能参与了动脉硬化的发生和发展过程。最近的研究表明，内皮细胞失去粘附可诱发凋亡[5]，肿瘤坏死因子可诱导培养内皮出现凋亡[6]。本研究在体外培养人脐静脉内皮细胞，观察到OX-LDL能诱导血管内皮凋亡，DNA电泳出现典型的梯形条带，且存在一定的剂量依赖关系。提示OX-LDL诱导EC凋亡可能在动脉硬化中具有重要的病理生理意义。
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Fas抗原是属于肿瘤坏死因子受体家族，是一种细胞表面膜蛋白，是细胞凋亡基因之一，可介导心肌等细胞凋亡[7，8]。为进一步探讨OX─LDL调控EC凋亡的机制。检测了OX-LDL处理EC后Fas抗原基因的表达，结果显示OX-LDL能剂量依赖性诱导EC的Fas抗原mRNA水平表达，并与其调控EC凋亡相关联。因而提示Fas抗原基因表达可能是OX-LDL调控EC凋亡的机制之一。其确切机制和意义有待深入研究。
[参 考 文 献]
[1] Ross R. The pathogenesis of atherosclerosis a perspective for the 1900s[J]. Nature, 1993, 362:80～82.
[2] Geng ys Peter L. Evidence for apoptosis in advanced human atheroma[J]. Am J Pathol, 1995,147(2): 251～252.
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[3] 陈颜芳,林曙光,余细勇，等.家兔腹主动脉球囊导管损伤后血管平滑肌细胞凋亡和一氧化氮合酶基因表达[J]. 中国动脉硬化杂志,1997,5(2):130～132.
[4] Tanner FC, Nou G, Boulanger CM, et al. Oxided low density lipoproteins inhibit relaxation of porcine coronary arteries[J]. Circulation, 1991, 83:2012～2013.
[5] 林曙光,陈颜芳,伍淑英，等. L-精氨酸抑制内皮细胞粘附分子-1表达与氧化型低密度脂蛋白促单核细胞粘附作用下降有关[J]. 中国动脉硬化杂志，1996，4(3):176～178.
[6] Re F, Zaneti A, Sironi M, et al. Inhibition of anchorage-dependent cell spreading tiggers apoptosis in cultured human endothelial cells[J]. J Cell Biol, 1994,124:537～539.
, http://www.100md.com
[7] Karsan A yee E,Harlan JM. Endothelial cell death induced by tumor necrosis factor-α is inhibited by the Bcl-2 family member A1[J]. J Biol Chem, 1996,271: 2720～2723.
[8] Tanaka M, Ito H, Adachi S, et al. Hypoxia induces apoptosis with enhance, expression of Fas antigen messenger RNA in cultured neonatal rat cadiomyocytes[J]. Circ Res, 1994,75:426～428.
[收稿日期] 1999-04-27 [修回日期] 1999-10-07
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