丝裂素活化蛋白激酶亚类在急性缺血/再灌注肾损伤修复过程中的变化
作者：蔡琪 李晓玫 王海燕
单位：(北京医科大学第一医院肾内科暨肾脏病研究所，北京 100034)
关键词：信号传递；蛋白激酶类；肾；再灌注损伤
中国病理生理杂志000613
[摘 要] 目的： 研究急性缺血/再灌注肾损伤修复时丝裂素活化蛋白激酶(MAPKs)亚类细胞外信号调节激酶(ERK)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)的变化，探讨其在肾损伤修复中的意义。方法： 夹闭大鼠双侧肾蒂造成急性缺血/再灌注肾损伤模型，应用电镜观察肾组织形态学改变，免疫组化法检测肾组织增殖细胞核抗原(PCNA)表达，采用特异性底物磷酸化结合免疫沉淀法测定肾组织的ERK、JNK活性。 结果： 急性缺血后再灌注2 h肾小管上皮细胞腔面微绒毛重新出现，肾小管PCNA阳性细胞开始增加；缺血45 min使ERK活性降低，再灌注5 min ERK活性完全恢复；缺血45 min对JNK活性无影响，再灌注5 min JNK活性增加并持续到再灌注2 h。结论： MAPKs活性变化，特别是JNK活性增加参与了急性缺血/再灌注肾损伤早期细胞修复过程。
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[中图分类号] R692 [文献标识码] A
[文章编号] 1000-4718(2000)06-0527-04
Changes of subfamilies of mitogen-activated protein kinases in recovery process of acute renal ischemia/reperfusion injury
CAI Qi, LI Xiao-mei, WANG Hai-yan
(Renal Division, Department of Medicine, the First Hospital and Institute of Nephrology, Beijing Medical University, Beijing 100034， China)
, 百拇医药
[Abstract] AIM： To investigate the change and the possible role of mitogen-activated protein kinase(MAPK) subfamilies in early recovery process following acute renal ischemia/reperfusion injury. METHODS: Ischemia/reperfusion renal injury model was made by placing an atraumatic vascular clamp in renal pedicel. The morphologic change was observed by transmission electron microscope. The proliferating cell nuclear antigen(PCNA) positive renal cells were detected by immunohistochemistry. Extracellular signal-regulated kinase (ERK) and c-Jun NH2-terminal kinase(JNK) activity was assayed by specific substrate phosphorylation with immunoprecipitation. RESULTS: After acute ischemia, microvilli in renal tubular cells appeared again after 2h of reperfusion. At the same time, the PCNA-positive cells were initially increased. ERK activity decreased at 45 min of ischemia, and completely recovered at 5 min of reperfusion. JNK activity was not influenced by ischemia, but increased at 5 min of reperfusion, reaching its maximal activity at 20 min of reperfusion, and prolonged within 2h reperfusion. CONCLUSION: After renal ischemia/reperfusion injury, the early recovery of renal tubule damage was related to the changes of MAPKs in which the increase of JNK activity might be more important.
, 百拇医药
[MeSH] Signal transduction; Protein kinases; Kidney; Reperfusion injury
缺血或肾毒性物质作用于肾脏，常可引起肾小管损伤，导致急性肾小管坏死。由于肾小管上皮细胞具有较强的修复能力，其修复与再生决定着损伤后肾组织结构的重建及肾功能的恢复，是决定病人临床预后的关键因素。因此，有关其损伤修复过程及机制的研究近年来日益受到重视。丝裂素活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPKs)是细胞内一类重要的信号转导酶类，研究表明，MAPKs至少有3个亚类，即细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun NH2-terminal kinase，JNK)和p38，它们分别在细胞增殖、凋亡或分化等方面传递调控信号。有关缺血/再灌注肾损伤过程中MAPKs变化及意义的报道很少。本研究采用急性缺血性肾损伤模型，对缺血再灌注损伤修复早期MAPKs亚类ERK和JNK的变化进行研究，并对其与损伤修复的关系进行初步探讨。
, 百拇医药
材 料 和 方 法
一、材料与试剂
(一)主要试剂 β-磷酸甘油、蛋白酶抑制剂、髓碱性蛋白(myelin basic protein，MBP)、交联谷胱甘肽的琼脂糖(GSH-agarose)、P-81滤纸均购自Sigma公司；GST-c-Jun(1～79)重组表达质粒菌种由美国科罗拉多大学Raphael A. Nemenoff教授惠赠；[γ-32P]-ATP购自北京亚辉生物工程公司；增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)小鼠单克隆抗体、标记生物素的兔抗小鼠抗体、标记辣根过氧化物酶的亲和素均为DAKO公司产品。
(二)实验动物 雄性Wistar大鼠，200～300 g，购自本校动物中心，随机分为假手术组、单纯缺血45 min组和缺血/再灌注不同时间组，每实验组5只大鼠。
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二、急性缺血/再灌注肾损伤模型复制
实验动物先以乙醚吸入，而后给予2%戊巴比妥钠30 mg/kg腹腔注射麻醉，行腹正中切口，暴露双侧肾脏，以无创动脉夹夹闭双侧肾蒂45 min，然后放开两侧动脉夹，观察肾脏颜色变化，确认肾脏血流恢复，分别于再灌注0、5、20、60 min、2 h、6 h留取肾组织标本，酶测定标本在液氮中速冻后转-80℃贮存直到使用，组织学标本按常规方法保存。
三、 观察指标及方法
(一)肾组织形态学改变 常规制片，光镜和电镜观察。
(二)肾小管上皮细胞增殖情况 PCNA免疫组化染色法。制备4 μm石蜡切片，脱蜡、梯度酒精水化、0.3% H2O2-甲醇封闭内源性过氧化物酶、微波修复抗原，2%牛血清白蛋白封闭后依次与小鼠PCNA单克隆抗体、生物素化兔抗鼠IgG、标记辣根过氧化物酶的亲和素反应，DAB-H2O2显色，苏木素复染，树脂封片，光镜下观察并记数PCNA阳性的肾小管上皮细胞数，以每1 000个肾小管细胞中PCNA阳性细胞数为该样品的增殖指数。
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(三)ERK活性测定 按本实验室方法[1]。取100 mg肾皮质加液氮后研成粉末，加入ERK裂解液匀浆并行超声粉碎2次，每次5 s，12 000 r/min离心10 min，留取上清，即为ERK粗提液。以1 mg/mL MBP为酶作用底物进行酶活性测定。
(四)JNK活性的测定 按本实验室方法[2]，特异反应底物GST-c-Jun(1～79)-GSH-agarose由本室自行制备。用JNK裂解液制备JNK粗提液，其过程同ERK粗提液的制备。 JNK粗提酶蛋白200μg经免疫沉淀后以10%GST-c-Jun(1～79)-GSH-agarose 为反应底物，在30℃条件下进行磷酸化反应20 min，终止反应后样品行10%聚丙烯酰胺凝胶电泳，考马斯亮兰染色、脱色、干胶、曝光后，剪下相应条带，进行液闪计数。
四、统计方法
由GraphPad InState统计软件完成，参数采用均数±标准差(
±s)表示，差异显著性检验采用方差分析。
, 百拇医药
Fig 1 The changes of the renal ultrastructure after ischemia/reperfusion
A: microvilli in tubular cells in control(×14 000); B: swollen, broken and split microvilli at 45 min of ischemia (×14 000);
C:reappearing microvilli at 2h of reperfusion (×14 000); D: at 6 h of reperfusion (×8 000)
图1 缺血/再灌注后肾组织超微结构的改变
结 果
一、急性缺血/再灌注对肾小管上皮细胞超微结构的影响
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单纯缺血时光镜下见到肾组织病理改变不明显，再灌注1 h后可见肾小管上皮细胞颗粒样变性，伴有肾间质水肿。电镜下，正常肾小管上皮细胞可见排列整齐的微绒毛，基底膜侧分布较多线粒体，缺血45 min时，肾小管上皮细胞的微绒毛肿胀、断裂、脱落，线粒体明显肿胀、嵴空泡变性、消失。再灌注2 h，较多肾小管细胞的微绒毛重新出现，至再灌注6 h，微绒毛完全恢复正常(图1)。
二、急性缺血/再灌注对肾小管上皮细胞增殖的影响
正常肾组织内可见少量散在的PCNA阳性细胞，主要为肾小管上皮细胞。缺血45 min时，细胞的增殖指数无明显变化。再灌注后增殖指数逐渐增高，至再灌注2 h，肾组织中PCNA阳性的肾小管细胞数明显增加(见表1)。
表1 缺血/再灌注不同时间肾组织增殖指数的变化
Tab 1 Change of proliferation index in kidney after
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ischemia/reperfusion(±s, n=5) Ischemia/reperfusion time
Proliferation index
Control
0.0026±0.0001
Ischemia 45 min
0.0020±0.0007
Reperfusion 5 min
0.0047±0.0009
Reperfusion 20 min
, 百拇医药
0.0055±0.0010
Reperfusion 1 h
0.0050±0.0011
Reperfusion 2 h
0.0093±0.0021*
Reperfusion 6 h
0.0090±0.0010*
* P<0.05, vs control
三、急性缺血/再灌注时肾组织ERK活性的变化
正常情况下，ERK具有一定的基础活性，缺血45 min后ERK活性较正常低(0.58±0.02 vs 1.00，P<0.01)，再灌注5 min又升高至正常(1.10±0.06 vs 1.00，P>0.05)，再灌注20 min至6 h与正常基础水平相比也无明显差异(图2)。
, 百拇医药
四、急性缺血/再灌注时肾组织JNK活性的变化
正常大鼠肾组织具有一定的JNK基础活性，单纯缺血45 min对JNK活性无影响。再灌注5 min JNK活性迅速增加(2.74±0.60 vs 1.00，P>0.05)，再灌注20 min达高峰(13.21±2.18 vs 1.00，P<0.05)，再灌注1 h仍明显高与正常(9.54±1.68 vs 1.00，P<0.05)，至再灌注6 h，与正常基础水平相比无明显差异(图3)。
Fig 2 Change of ERK activity in kidney after ischemia/reperfusion (±s， n=5)
1. control; 2. ischemia 45 min; 3.reperfusion 5 min; 4. reperfusion 20 min; 5. reperfusion 1 h; 6. reperfusion 2 h; 7. reperfusion 6 h, * P<0.01, vs control
, 百拇医药
图2 缺血/再灌注后肾组织ERK活性变化
Fig 3 Change of JNK activity in kidney after ischemia/reperfusion (±s，n=5)
1. control; 2. ischemia 45 min; 3.reperfusion 5 min; 4. reperfusion 20 min; 5. reperfusion 1 h; 6. reperfusion 2 h; 7. reperfusion 6 h, * P<0.05, vs control
图3 缺血/再灌注后肾组织JNK活性变化
讨 论
, 百拇医药 急性缺血/再灌注肾损伤时，肾小管上皮细胞具有较强的修复损伤能力。我们对此研究发现，大鼠急性缺血/再灌注肾损伤后肾小管上皮细胞早期修复特点为细胞微绒毛修复和细胞增殖，即再灌注2 h较多肾小管上皮细胞的微绒毛开始修复，再灌注6 h完全修复；再灌注2 h PCNA阳性细胞开始增加，表明缺血/再灌注损伤后肾小管上皮细胞的损伤修复可迅速发生。
多种器官缺血/再灌注损伤后，组织细胞的MAPKs活性均可发生明显变化，但是，其生物学意义仍有争议[3～5]。我们观察到缺血45 min肾组织ERK活性降低，再灌注5 min ERK活性迅速升高至正常；而单纯缺血对肾组织JNK活性无影响，再灌注后JNK活性早期明显增高，并持续时间较长，与随后观察到的肾小管上皮细胞超微结构恢复及增殖反应相一致，提示急性缺血/再灌注肾损伤后的细胞修复可能主要与细胞内JNK活性改变有关。JNK的激活可促进氧化应激时热休克蛋白(heat shock protein，HSP)的表达[6]，而HSP可促进应激反应中损伤蛋白的修复，增加应激条件下细胞的存活。缺血/再灌注肾损伤时，HSP被迅速诱导[7]。因此，JNK通路可能通过诱导HSP促进肾损伤修复。JNK信号通路主要传递应激信号，与细胞应激反应有关，但是， JNK信号通路已被证实也可传递增殖信号[8]。本实验中再灌注后ERK活性并无明显增加，但是，再灌注后ERK活性的迅速恢复在细胞的损伤修复中可能仍起一定的作用。体外实验证实，ERK激活可促进氧化应激时细胞的存活[9]，而细胞的存活是其能够进入细胞周期分裂增殖的前提。因此，ERK活性恢复可能对于维持细胞的损伤修复能力是必需的。
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急性缺血/再灌注肾损伤后MAPKs活性的变化可能是影响肾脏修复的细胞内机制之一，其中JNK的激活可能通过HSP的诱导及调节与细胞增殖有关的基因表达，促进损伤的早期修复，而ERK活性的变化可能决定着损伤后细胞的生存状态。缺血/再灌注后MAPKs活性变化的确切生物学意义还有待于相应信号酶特异性阻断剂的使用或相应基因敲除动物实验的进一步证实。
(衷心感谢本所病理研究室鄂洁在病理制片中和本院电镜室在电镜标本制作及摄片中的帮助)
[基金项目]教育部博士点基金(9501029)和跨世纪优秀人才基金资助项目(39910210474-231-C04)
[参 考 文 献]
[1] 李晓玫，Schrier RW，Nemenoff RA. 前列腺素E2对肾小球系膜细胞分裂原活化蛋白激酶的抑制作用[J]. 中华医学杂志, 1995,75：207～210.
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[2] 蔡 琪，李晓玫. c-Jun氨基末端激酶活性测定[J]. 北京医科大学学报, 1999， 3：283～284.
[3] Campos-Gonzalez R, Kindy MS. Tyrosine phosphorylation of microtubule-associated protein kinase after transient ischemia in the gerbil brain[J]. J Neurochem, 1992, 59: 1955～1958.
[4] Hu BR, Wieloch T. Tyrosine phosphorylation and activation of mitogen-activated protein kinase in the rat brain following transient cerebral ischemia[J]. J Neurochem, 1994, 62: 1357～1367.
, 百拇医药
[5] Bogoyevitch MA, Gillespie BJ, Ketterman AJ, et al. Stimulation of the stress-activated mitogen-activated protein kinase subfamilies in perfused heart[J]. Circ Res, 1996, 79: 162～174.
[6] Lee YJ, Corry PM. Metabolic oxidative stress-induced HSP70 gene expression is mediated through SAPK pathway[J]. J Biol Chem, 1998, 273: 29857～29863.
[7] Morita K, Wakui H, Komatsuda A, et al. Induction of heat-shock proteins HSP70 and HSP90 in rat kidneys after ischemia[J]. Renal Fail, 1995, 17: 405～419.
, 百拇医药
[8] Diehl AM, Yang SQ, Wolfgang D, et al. Tumor necrosis factor-α induces c-Jun during the regeneration response to liver injury[J]. Am J Physiol, 1994, 267: G552～561.
[9] Guyton KI, Liu Y, Gorospe M. Activation of mitogen-activated protein kinase by H2O2. Role in cell survival following oxidant injury[J]. J Biol Chem, 1996, 271: 4138～4142.
[收稿日期]1999-07-27 [修回日期]1999-12-14
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单位：(北京医科大学第一医院肾内科暨肾脏病研究所，北京 100034)
关键词：信号传递；蛋白激酶类；肾；再灌注损伤
中国病理生理杂志000613
[摘 要] 目的： 研究急性缺血/再灌注肾损伤修复时丝裂素活化蛋白激酶(MAPKs)亚类细胞外信号调节激酶(ERK)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)的变化，探讨其在肾损伤修复中的意义。方法： 夹闭大鼠双侧肾蒂造成急性缺血/再灌注肾损伤模型，应用电镜观察肾组织形态学改变，免疫组化法检测肾组织增殖细胞核抗原(PCNA)表达，采用特异性底物磷酸化结合免疫沉淀法测定肾组织的ERK、JNK活性。 结果： 急性缺血后再灌注2 h肾小管上皮细胞腔面微绒毛重新出现，肾小管PCNA阳性细胞开始增加；缺血45 min使ERK活性降低，再灌注5 min ERK活性完全恢复；缺血45 min对JNK活性无影响，再灌注5 min JNK活性增加并持续到再灌注2 h。结论： MAPKs活性变化，特别是JNK活性增加参与了急性缺血/再灌注肾损伤早期细胞修复过程。
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[中图分类号] R692 [文献标识码] A
[文章编号] 1000-4718(2000)06-0527-04
Changes of subfamilies of mitogen-activated protein kinases in recovery process of acute renal ischemia/reperfusion injury
CAI Qi, LI Xiao-mei, WANG Hai-yan
(Renal Division, Department of Medicine, the First Hospital and Institute of Nephrology, Beijing Medical University, Beijing 100034， China)
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[Abstract] AIM： To investigate the change and the possible role of mitogen-activated protein kinase(MAPK) subfamilies in early recovery process following acute renal ischemia/reperfusion injury. METHODS: Ischemia/reperfusion renal injury model was made by placing an atraumatic vascular clamp in renal pedicel. The morphologic change was observed by transmission electron microscope. The proliferating cell nuclear antigen(PCNA) positive renal cells were detected by immunohistochemistry. Extracellular signal-regulated kinase (ERK) and c-Jun NH2-terminal kinase(JNK) activity was assayed by specific substrate phosphorylation with immunoprecipitation. RESULTS: After acute ischemia, microvilli in renal tubular cells appeared again after 2h of reperfusion. At the same time, the PCNA-positive cells were initially increased. ERK activity decreased at 45 min of ischemia, and completely recovered at 5 min of reperfusion. JNK activity was not influenced by ischemia, but increased at 5 min of reperfusion, reaching its maximal activity at 20 min of reperfusion, and prolonged within 2h reperfusion. CONCLUSION: After renal ischemia/reperfusion injury, the early recovery of renal tubule damage was related to the changes of MAPKs in which the increase of JNK activity might be more important.
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[MeSH] Signal transduction; Protein kinases; Kidney; Reperfusion injury
缺血或肾毒性物质作用于肾脏，常可引起肾小管损伤，导致急性肾小管坏死。由于肾小管上皮细胞具有较强的修复能力，其修复与再生决定着损伤后肾组织结构的重建及肾功能的恢复，是决定病人临床预后的关键因素。因此，有关其损伤修复过程及机制的研究近年来日益受到重视。丝裂素活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPKs)是细胞内一类重要的信号转导酶类，研究表明，MAPKs至少有3个亚类，即细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun NH2-terminal kinase，JNK)和p38，它们分别在细胞增殖、凋亡或分化等方面传递调控信号。有关缺血/再灌注肾损伤过程中MAPKs变化及意义的报道很少。本研究采用急性缺血性肾损伤模型，对缺血再灌注损伤修复早期MAPKs亚类ERK和JNK的变化进行研究，并对其与损伤修复的关系进行初步探讨。
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材 料 和 方 法
一、材料与试剂
(一)主要试剂 β-磷酸甘油、蛋白酶抑制剂、髓碱性蛋白(myelin basic protein，MBP)、交联谷胱甘肽的琼脂糖(GSH-agarose)、P-81滤纸均购自Sigma公司；GST-c-Jun(1～79)重组表达质粒菌种由美国科罗拉多大学Raphael A. Nemenoff教授惠赠；[γ-32P]-ATP购自北京亚辉生物工程公司；增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)小鼠单克隆抗体、标记生物素的兔抗小鼠抗体、标记辣根过氧化物酶的亲和素均为DAKO公司产品。
(二)实验动物 雄性Wistar大鼠，200～300 g，购自本校动物中心，随机分为假手术组、单纯缺血45 min组和缺血/再灌注不同时间组，每实验组5只大鼠。
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二、急性缺血/再灌注肾损伤模型复制
实验动物先以乙醚吸入，而后给予2%戊巴比妥钠30 mg/kg腹腔注射麻醉，行腹正中切口，暴露双侧肾脏，以无创动脉夹夹闭双侧肾蒂45 min，然后放开两侧动脉夹，观察肾脏颜色变化，确认肾脏血流恢复，分别于再灌注0、5、20、60 min、2 h、6 h留取肾组织标本，酶测定标本在液氮中速冻后转-80℃贮存直到使用，组织学标本按常规方法保存。
三、 观察指标及方法
(一)肾组织形态学改变 常规制片，光镜和电镜观察。
(二)肾小管上皮细胞增殖情况 PCNA免疫组化染色法。制备4 μm石蜡切片，脱蜡、梯度酒精水化、0.3% H2O2-甲醇封闭内源性过氧化物酶、微波修复抗原，2%牛血清白蛋白封闭后依次与小鼠PCNA单克隆抗体、生物素化兔抗鼠IgG、标记辣根过氧化物酶的亲和素反应，DAB-H2O2显色，苏木素复染，树脂封片，光镜下观察并记数PCNA阳性的肾小管上皮细胞数，以每1 000个肾小管细胞中PCNA阳性细胞数为该样品的增殖指数。
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(三)ERK活性测定 按本实验室方法[1]。取100 mg肾皮质加液氮后研成粉末，加入ERK裂解液匀浆并行超声粉碎2次，每次5 s，12 000 r/min离心10 min，留取上清，即为ERK粗提液。以1 mg/mL MBP为酶作用底物进行酶活性测定。
(四)JNK活性的测定 按本实验室方法[2]，特异反应底物GST-c-Jun(1～79)-GSH-agarose由本室自行制备。用JNK裂解液制备JNK粗提液，其过程同ERK粗提液的制备。 JNK粗提酶蛋白200μg经免疫沉淀后以10%GST-c-Jun(1～79)-GSH-agarose 为反应底物，在30℃条件下进行磷酸化反应20 min，终止反应后样品行10%聚丙烯酰胺凝胶电泳，考马斯亮兰染色、脱色、干胶、曝光后，剪下相应条带，进行液闪计数。
四、统计方法
由GraphPad InState统计软件完成，参数采用均数±标准差(
±s)表示，差异显著性检验采用方差分析。, 百拇医药
Fig 1 The changes of the renal ultrastructure after ischemia/reperfusion
A: microvilli in tubular cells in control(×14 000); B: swollen, broken and split microvilli at 45 min of ischemia (×14 000);
C:reappearing microvilli at 2h of reperfusion (×14 000); D: at 6 h of reperfusion (×8 000)
图1 缺血/再灌注后肾组织超微结构的改变
结 果
一、急性缺血/再灌注对肾小管上皮细胞超微结构的影响
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单纯缺血时光镜下见到肾组织病理改变不明显，再灌注1 h后可见肾小管上皮细胞颗粒样变性，伴有肾间质水肿。电镜下，正常肾小管上皮细胞可见排列整齐的微绒毛，基底膜侧分布较多线粒体，缺血45 min时，肾小管上皮细胞的微绒毛肿胀、断裂、脱落，线粒体明显肿胀、嵴空泡变性、消失。再灌注2 h，较多肾小管细胞的微绒毛重新出现，至再灌注6 h，微绒毛完全恢复正常(图1)。
二、急性缺血/再灌注对肾小管上皮细胞增殖的影响
正常肾组织内可见少量散在的PCNA阳性细胞，主要为肾小管上皮细胞。缺血45 min时，细胞的增殖指数无明显变化。再灌注后增殖指数逐渐增高，至再灌注2 h，肾组织中PCNA阳性的肾小管细胞数明显增加(见表1)。
表1 缺血/再灌注不同时间肾组织增殖指数的变化
Tab 1 Change of proliferation index in kidney after
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ischemia/reperfusion(
±s, n=5) Ischemia/reperfusion timeProliferation index
Control
0.0026±0.0001
Ischemia 45 min
0.0020±0.0007
Reperfusion 5 min
0.0047±0.0009
Reperfusion 20 min
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0.0055±0.0010
Reperfusion 1 h
0.0050±0.0011
Reperfusion 2 h
0.0093±0.0021*
Reperfusion 6 h
0.0090±0.0010*
* P<0.05, vs control
三、急性缺血/再灌注时肾组织ERK活性的变化
正常情况下，ERK具有一定的基础活性，缺血45 min后ERK活性较正常低(0.58±0.02 vs 1.00，P<0.01)，再灌注5 min又升高至正常(1.10±0.06 vs 1.00，P>0.05)，再灌注20 min至6 h与正常基础水平相比也无明显差异(图2)。
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四、急性缺血/再灌注时肾组织JNK活性的变化
正常大鼠肾组织具有一定的JNK基础活性，单纯缺血45 min对JNK活性无影响。再灌注5 min JNK活性迅速增加(2.74±0.60 vs 1.00，P>0.05)，再灌注20 min达高峰(13.21±2.18 vs 1.00，P<0.05)，再灌注1 h仍明显高与正常(9.54±1.68 vs 1.00，P<0.05)，至再灌注6 h，与正常基础水平相比无明显差异(图3)。
Fig 2 Change of ERK activity in kidney after ischemia/reperfusion (±s， n=5)
1. control; 2. ischemia 45 min; 3.reperfusion 5 min; 4. reperfusion 20 min; 5. reperfusion 1 h; 6. reperfusion 2 h; 7. reperfusion 6 h, * P<0.01, vs control
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图2 缺血/再灌注后肾组织ERK活性变化
Fig 3 Change of JNK activity in kidney after ischemia/reperfusion (±s，n=5)
1. control; 2. ischemia 45 min; 3.reperfusion 5 min; 4. reperfusion 20 min; 5. reperfusion 1 h; 6. reperfusion 2 h; 7. reperfusion 6 h, * P<0.05, vs control
图3 缺血/再灌注后肾组织JNK活性变化
讨 论
, 百拇医药 急性缺血/再灌注肾损伤时，肾小管上皮细胞具有较强的修复损伤能力。我们对此研究发现，大鼠急性缺血/再灌注肾损伤后肾小管上皮细胞早期修复特点为细胞微绒毛修复和细胞增殖，即再灌注2 h较多肾小管上皮细胞的微绒毛开始修复，再灌注6 h完全修复；再灌注2 h PCNA阳性细胞开始增加，表明缺血/再灌注损伤后肾小管上皮细胞的损伤修复可迅速发生。
多种器官缺血/再灌注损伤后，组织细胞的MAPKs活性均可发生明显变化，但是，其生物学意义仍有争议[3～5]。我们观察到缺血45 min肾组织ERK活性降低，再灌注5 min ERK活性迅速升高至正常；而单纯缺血对肾组织JNK活性无影响，再灌注后JNK活性早期明显增高，并持续时间较长，与随后观察到的肾小管上皮细胞超微结构恢复及增殖反应相一致，提示急性缺血/再灌注肾损伤后的细胞修复可能主要与细胞内JNK活性改变有关。JNK的激活可促进氧化应激时热休克蛋白(heat shock protein，HSP)的表达[6]，而HSP可促进应激反应中损伤蛋白的修复，增加应激条件下细胞的存活。缺血/再灌注肾损伤时，HSP被迅速诱导[7]。因此，JNK通路可能通过诱导HSP促进肾损伤修复。JNK信号通路主要传递应激信号，与细胞应激反应有关，但是， JNK信号通路已被证实也可传递增殖信号[8]。本实验中再灌注后ERK活性并无明显增加，但是，再灌注后ERK活性的迅速恢复在细胞的损伤修复中可能仍起一定的作用。体外实验证实，ERK激活可促进氧化应激时细胞的存活[9]，而细胞的存活是其能够进入细胞周期分裂增殖的前提。因此，ERK活性恢复可能对于维持细胞的损伤修复能力是必需的。
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急性缺血/再灌注肾损伤后MAPKs活性的变化可能是影响肾脏修复的细胞内机制之一，其中JNK的激活可能通过HSP的诱导及调节与细胞增殖有关的基因表达，促进损伤的早期修复，而ERK活性的变化可能决定着损伤后细胞的生存状态。缺血/再灌注后MAPKs活性变化的确切生物学意义还有待于相应信号酶特异性阻断剂的使用或相应基因敲除动物实验的进一步证实。
(衷心感谢本所病理研究室鄂洁在病理制片中和本院电镜室在电镜标本制作及摄片中的帮助)
[基金项目]教育部博士点基金(9501029)和跨世纪优秀人才基金资助项目(39910210474-231-C04)
[参 考 文 献]
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[收稿日期]1999-07-27 [修回日期]1999-12-14
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