葡萄糖和镁离子在谷氨酸诱发的神经细胞损伤中的作用
作者：邢虹 何其华 袁兰 徐家令鸟 吴本王介
单位：邢虹 徐家令鸟 吴本王介(北京医科大学生物物理系)；何其华 袁兰(北京医科大学医药分析中心，北京 100083)
关键词：谷氨酸盐类；葡萄糖；镁；钙
中国病理生理杂志000608
[摘 要] 目的和方法：以激光共聚焦扫描显微镜观察了无葡萄糖和无镁离子细胞外液对中毒剂量谷氨酸引起的大脑皮质神经细胞损伤作用的影响。结果：无葡萄糖及无镁离子时均可使谷氨酸引起的神经细胞内钙振荡频率及幅度下降，但前者可使细胞内基础Ca2+降低，后者可使细胞内基础Ca2+增加。结论：无镁可加重谷氨酸引起的细胞内Ca2+超载，在一定条件下无葡萄糖可拮抗谷氨酸及无镁离子的损伤作用。
, http://www.100md.com
[中图分类号] R741.02 [文献标识码] A
[文章编号] 1000-4718(2000)06-0508-04
Effects of glucose and Mg2+ in the neurons damaged by glutamate
XING Hong, XU Jia-ling,WU Ben-jie
(Department of Biophysics,Beijing Medical University， Beijing 100083， China)
HE Qi-hua, YUAN Lan
(Analysis Center of Medicine and Pharmacy, Beijing Medical University， Beijing 100083， China)
, 百拇医药
[Abstract] AIM and METHODS: To observe the effects of glucose-free and Mg2+-free in the extracellular fluid on the changes of [Ca2+]i in the cerebro-cortical neurons damaged by 1 mmol/L glutamate using laser confocal scanning microscope. RESULTS: Both frequency and amplitude of neuronal calcium oscillation induced by glutamate were lowered in glucose-free and Mg2+-free buffers. The basic [Ca2+]i concentration was lowered in the former case , but it was elevated in the latter case. CONCLUSION: Mg2+-free aggravates [Ca2+]i overload induced by 1 mmol/L glutamate ,under certain conditions the glucose-free might resist damage role of glutamate and Mg2+-free.
, 百拇医药
[MeSH] Glutamates; Glucose;Magnesium; Calcium
脑缺血是一类严重影响人类健康的最常见的脑血管疾病, 这类疾病的脑损伤机制复杂, 其中心环节为谷氨酸中毒引起细胞内Ca2+超载。此外,局灶性缺血脑区葡萄糖供应障碍,脑缺血病人血清镁离子缺乏[1]。这些因素在脑缺血损伤中的作用并不完全清楚。本文利用激光共聚焦扫描显微镜(laser confocal scanning microscope, LCSM)观察葡萄糖和镁离子在中毒剂量谷氨酸引起大脑皮质神经细胞损伤时对细胞内Ca2+浓度变化的影响。
材 料 和 方 法
一、材料
(一)药品 Fluo-3/AM, A-23187,Pluronic F-127(美国Molecular probes公司); 5-氟-2-脱氧尿苷(5-fluoro-2-deoxyuridine,5-Fu)(瑞士Fluka公司);多聚赖氨酸(poly-L-lysine),谷氨酸单钠盐 (美国Sigma公司)。
, 百拇医药
(二)动物 出生1～2 d的Wistar新生大鼠，由本校动物实验中心提供。
(三)实验仪器 Leica TCS-NT型激光共聚焦扫描显微镜 (德国)。
二、方法
(一)大鼠大脑皮质神经细胞的分离及原代培养 在胰蛋白酶消化法分离大鼠大脑皮质神经细胞后, 以1×105/mL细胞浓度将神经细胞接种到铺有多聚赖氨酸的无菌培养皿上，以DMEM培养液，在37℃、5% CO2孵箱培养48 h，然后加入20 μg/mL的5-Fu, 作用48 h以抑制胶质细胞增殖,隔天换液，培养6～10 d后神经细胞之间突触联成网状,即用以实验。
(二)利用LCSM测定细胞内Ca2+浓度的变化[2～3] 将单层培养的大鼠大脑皮质神经细胞用Hanks液漂洗2～3次,放入含有4 μmol/L Fluo-3/AM(标记Ca2+)和5 μL pluronic F-127(12.5%重量比)的1 mL Hanks液中，37℃负载30 min，用不含荧光探剂的Hanks液洗涤2～3次，充分洗掉没有进入细胞内的荧光探剂。将负载好的细胞在LCSM上检测细胞内游离Ca2+浓度。LCSM条件设置：①荧光探剂Fluo-3的激发光波长:480 nm,发射光波长:530 nm,②扫描方式:xy(光切)、xyt(时间扫描);③确定扫描密度(分辩率):512×512;④选择物镜的倍数为20倍,电子放大(ZOOM)倍数为2;⑤选择激光功率为(20±2) mw;⑥光电倍增管的增益(PMT):693;⑦扫描速度为中速扫描。设置好上述条件后,调节焦平面使荧光图像清晰。在无糖、无镁及无糖无镁条件下,加入10 μL 100 mmol/L谷氨酸(终浓度为1 mmol/L)扫描并记录结果。另设不加谷氨酸为对照组。
, 百拇医药
(三)统计方法 实验数据以均数±标准差(
±s)表示,并以t检验判断均数差异显著性。
结 果
一、谷氨酸引起大脑皮质神经细胞的钙振荡
观察了86个大脑皮质神经细胞在Hanks液中经1 mmol/L谷氨酸作用后细胞内游离Ca2+的变化，结果表明：71%的细胞内游离Ca2+ 发生振荡，其波型均为尖峰型(图1)；15%的神经细胞内游离Ca2+以迅速或缓慢方式上升，而14%的神经细胞内游离Ca2+浓度无明显变化。
Fig 1 Oscillation of intracellular Ca2+ in neurons induced by 1 mmol/L glutamate (n=86)
, 百拇医药
图1 1 mmol/L 谷氨酸引起神经细胞钙振荡
二、葡萄糖及镁离子缺乏对谷氨酸引起的大脑皮质神经细胞内Ca2+变化的影响
(一)细胞外液无糖 将负载后的大脑皮质神经细胞移至无糖Hanks液中作用10 min，然后加入1 mmol/L谷氨酸，大脑皮质神经细胞产生钙振荡，但振幅及振荡频率逐渐下降。与Hanks液组相比，细胞内Ca2+ 的浓度基础值下降了0.48倍，细胞内Ca2+浓度下降了2.52倍，(图2A1,表1,)。单纯细胞外无糖组细胞内Ca2+无变化(图2A1)。
表1 不同因素对1mmol/L谷氨酸引起细胞内
Ca2+变化的影响
, 百拇医药 Tab 1 Effects of different factors on [Ca2+]i in
neurons induced by 1mmol/L glutamate (±s) Group
[Ca2+]i (10-7 mol/L)
Control
2.05±0.85
Glu
14.48±4.62**
, 百拇医药
Mg2+-free+ Glu
27.40±10.18**##
Glucose-free+ Glu
4.11±1.88*##
Glucose-Mg2+-free+ Glu
7.17±2.73**##
*P<0.05, **P<0.01, vs control group; ##P<0.01, vs Glu group; Glu:glutamate
(二)细胞外液无Mg2+ 将负载后的大脑皮质神经细胞移至无Mg2+ Hanks液作用10 min，一组直接上机观察，细胞内Ca2+无变化(图2B1)；另一组加入1 mmol/L谷氨酸，大脑皮质神经细胞产生振荡，与Hanks液组相比细胞内Ca2+浓度的基础值上升了0.78倍，细胞内Ca2+浓度增加了0.87倍(图2B2, 表1)。
, 百拇医药
(三)细胞外液无糖、无Mg2+ 细胞外液无糖无Mg2+时加入1 mmol/L谷氨酸，大鼠大脑皮质神经细胞发生钙振荡，但振荡频率和/或振幅逐渐下降(图2C2, 表1,)。不加谷氨酸的对照组细胞内Ca2+无变化(图2C1)。
讨 论
利用LCSM系统可以准确地显示出活细胞内被标记离子的时空动态变化，我们利用该系统研究了无糖及无镁等因素对谷氨酸引起的大鼠大脑皮质神经细胞内游离Ca2+变化的影响。细胞外液无葡萄糖对谷氨酸引起的大脑皮质神经细胞内游离Ca2+变化的影响十分复杂，无糖时细胞内ATP生成减少是这种影响的中心环节。一方面，ATP生成减少，钙泵功能下降，胞内Ca2+向胞外转运及向钙库转移的作用减弱，趋向于使细胞内游离Ca2+增加。另一方面，①受体操纵的Ca2+内流通道是被蛋白激酶K磷酸化后开放的，而蛋白激酶K是被ATP水解产物cAMP激活的，所以在ATP减少时Ca2+的内流减少；②ATP可以增强钙库的Ca2+释放，ATP减少时，细胞内钙库Ca2+的释放减少；这些机制又趋向于使细胞内游离Ca2+减少。文献认为，ATP的综合作用是使胞浆Ca2+浓度增加[4]，增加的方式为细胞内钙振荡[5]。我们的实验证明细胞外液无糖本身对细胞内Ca2+浓度并无太大影响，但可以在一定程度上减缓谷氨酸引起的神经细胞内游离Ca2+浓度的增高。说明在谷氨酸毒性作用的一定时间内，无糖可能是有益的。
, 百拇医药
Mg2+在谷氨酸引起的神经细胞钙超载机制中起到了保护神经细胞的作用。它可拮抗受体操纵的Ca2+内流，并可通过改变内质网钙泵对Ca2+的亲合性，加强内质网对Ca2+的摄取，减少胞浆内游离Ca2+浓度。已有文献证明脑缺血病人血清镁离子浓度下降，并可加重神经细胞的损伤[1]。本文证明这种损伤作用的机制可能在于无Mg2+可以加重谷氨酸引起的细胞内Ca2+超载。无Mg2+时加重了谷氨酸引起的细胞内基础Ca2+含量的增加，随之使钙库Ca2+与胞浆Ca2+之间浓度梯度下降，钙振荡幅度随之降低[6]。本文在实验中未观察到无Mg2+本身对细胞内Ca2+的影响。无Mg2+的这种加重谷氨酸毒性的作用可以被无糖抵消。当细胞外液中既不含Mg2+又不含糖时，谷氨酸引起的以振荡方式增加的细胞内Ca2+浓度逐渐下降，Ca2+振荡的频率及振幅下降。即无糖的保护作用可能比无Mg2+的损伤作用强。
, 百拇医药
Fig 2 Effects of different factors on intracellular Ca2+ relative fluorescent intensity in neurons induced by 1 mmol/L glutamate
图2 不同因素对1mmol/L谷氨酸引起细胞内Ca2+变化的影响
[基金项目] “九五”国家医学科技攻关项目 96-906-02-21
[参 考 文 献]
[1] Altura BT, Memon ZI, Zhang A,et al. Low levels of serum ionized magnesium are found in patients early after stroke which result in rapid elevation in cytosolic free calcium and spasm in cerebral vascular muscle cells[J]. Neurosci Lett, 1997, 230:1,37～40.
, 百拇医药
[2] Kao JPY, Harootunianm AT, Tsien RY. Photochemically generated cytosolic calcium pulses and their detection by Fluo-3[J]. J Biol Chem, 1989,264:8179～8184.
[3] Leinders ZT, Rand MN, Shepherd GM,et al. Calcium entry through cyclic nucleotide-gated channels in individual cilia of olfactory receptor cells: spatiotemporal dynamics[J]. J Neurosci, 1997 , 17(11): 4136～4148.
[4] Atsumi T, Sugita K, Kohno M, et al. Simultaneous measurement of Ca2+ and pH by laser cytometry using Fluo-3 and SNARF-1[J]. Cytometry, 1996, 24:99～105.
, 百拇医药
[5] Tertyshnikova S, Fein A. [Ca2+]i oscillations and[Ca2+]i waves in rat megakaryocytes[J]. Cell Calcium, 1997, 21(5):331～344.
[6] Prakash YS, Mathur S, Sieck GC. Regulation of intracellular calcium oscillations in porcine tracheal smooth muscle cells[J]. Am J Physiol, 1997, 272:C966～C975.
[收稿日期] 1999-05-04 [修回日期] 1999-12-22
, 百拇医药
单位：邢虹 徐家令鸟 吴本王介(北京医科大学生物物理系)；何其华 袁兰(北京医科大学医药分析中心，北京 100083)
关键词：谷氨酸盐类；葡萄糖；镁；钙
中国病理生理杂志000608
[摘 要] 目的和方法：以激光共聚焦扫描显微镜观察了无葡萄糖和无镁离子细胞外液对中毒剂量谷氨酸引起的大脑皮质神经细胞损伤作用的影响。结果：无葡萄糖及无镁离子时均可使谷氨酸引起的神经细胞内钙振荡频率及幅度下降，但前者可使细胞内基础Ca2+降低，后者可使细胞内基础Ca2+增加。结论：无镁可加重谷氨酸引起的细胞内Ca2+超载，在一定条件下无葡萄糖可拮抗谷氨酸及无镁离子的损伤作用。
, http://www.100md.com
[中图分类号] R741.02 [文献标识码] A
[文章编号] 1000-4718(2000)06-0508-04
Effects of glucose and Mg2+ in the neurons damaged by glutamate
XING Hong, XU Jia-ling,WU Ben-jie
(Department of Biophysics,Beijing Medical University， Beijing 100083， China)
HE Qi-hua, YUAN Lan
(Analysis Center of Medicine and Pharmacy, Beijing Medical University， Beijing 100083， China)
, 百拇医药
[Abstract] AIM and METHODS: To observe the effects of glucose-free and Mg2+-free in the extracellular fluid on the changes of [Ca2+]i in the cerebro-cortical neurons damaged by 1 mmol/L glutamate using laser confocal scanning microscope. RESULTS: Both frequency and amplitude of neuronal calcium oscillation induced by glutamate were lowered in glucose-free and Mg2+-free buffers. The basic [Ca2+]i concentration was lowered in the former case , but it was elevated in the latter case. CONCLUSION: Mg2+-free aggravates [Ca2+]i overload induced by 1 mmol/L glutamate ,under certain conditions the glucose-free might resist damage role of glutamate and Mg2+-free.
, 百拇医药
[MeSH] Glutamates; Glucose;Magnesium; Calcium
脑缺血是一类严重影响人类健康的最常见的脑血管疾病, 这类疾病的脑损伤机制复杂, 其中心环节为谷氨酸中毒引起细胞内Ca2+超载。此外,局灶性缺血脑区葡萄糖供应障碍,脑缺血病人血清镁离子缺乏[1]。这些因素在脑缺血损伤中的作用并不完全清楚。本文利用激光共聚焦扫描显微镜(laser confocal scanning microscope, LCSM)观察葡萄糖和镁离子在中毒剂量谷氨酸引起大脑皮质神经细胞损伤时对细胞内Ca2+浓度变化的影响。
材 料 和 方 法
一、材料
(一)药品 Fluo-3/AM, A-23187,Pluronic F-127(美国Molecular probes公司); 5-氟-2-脱氧尿苷(5-fluoro-2-deoxyuridine,5-Fu)(瑞士Fluka公司);多聚赖氨酸(poly-L-lysine),谷氨酸单钠盐 (美国Sigma公司)。
, 百拇医药
(二)动物 出生1～2 d的Wistar新生大鼠，由本校动物实验中心提供。
(三)实验仪器 Leica TCS-NT型激光共聚焦扫描显微镜 (德国)。
二、方法
(一)大鼠大脑皮质神经细胞的分离及原代培养 在胰蛋白酶消化法分离大鼠大脑皮质神经细胞后, 以1×105/mL细胞浓度将神经细胞接种到铺有多聚赖氨酸的无菌培养皿上，以DMEM培养液，在37℃、5% CO2孵箱培养48 h，然后加入20 μg/mL的5-Fu, 作用48 h以抑制胶质细胞增殖,隔天换液，培养6～10 d后神经细胞之间突触联成网状,即用以实验。
(二)利用LCSM测定细胞内Ca2+浓度的变化[2～3] 将单层培养的大鼠大脑皮质神经细胞用Hanks液漂洗2～3次,放入含有4 μmol/L Fluo-3/AM(标记Ca2+)和5 μL pluronic F-127(12.5%重量比)的1 mL Hanks液中，37℃负载30 min，用不含荧光探剂的Hanks液洗涤2～3次，充分洗掉没有进入细胞内的荧光探剂。将负载好的细胞在LCSM上检测细胞内游离Ca2+浓度。LCSM条件设置：①荧光探剂Fluo-3的激发光波长:480 nm,发射光波长:530 nm,②扫描方式:xy(光切)、xyt(时间扫描);③确定扫描密度(分辩率):512×512;④选择物镜的倍数为20倍,电子放大(ZOOM)倍数为2;⑤选择激光功率为(20±2) mw;⑥光电倍增管的增益(PMT):693;⑦扫描速度为中速扫描。设置好上述条件后,调节焦平面使荧光图像清晰。在无糖、无镁及无糖无镁条件下,加入10 μL 100 mmol/L谷氨酸(终浓度为1 mmol/L)扫描并记录结果。另设不加谷氨酸为对照组。
, 百拇医药
(三)统计方法 实验数据以均数±标准差(
±s)表示,并以t检验判断均数差异显著性。结 果
一、谷氨酸引起大脑皮质神经细胞的钙振荡
观察了86个大脑皮质神经细胞在Hanks液中经1 mmol/L谷氨酸作用后细胞内游离Ca2+的变化，结果表明：71%的细胞内游离Ca2+ 发生振荡，其波型均为尖峰型(图1)；15%的神经细胞内游离Ca2+以迅速或缓慢方式上升，而14%的神经细胞内游离Ca2+浓度无明显变化。
Fig 1 Oscillation of intracellular Ca2+ in neurons induced by 1 mmol/L glutamate (n=86)
, 百拇医药
图1 1 mmol/L 谷氨酸引起神经细胞钙振荡
二、葡萄糖及镁离子缺乏对谷氨酸引起的大脑皮质神经细胞内Ca2+变化的影响
(一)细胞外液无糖 将负载后的大脑皮质神经细胞移至无糖Hanks液中作用10 min，然后加入1 mmol/L谷氨酸，大脑皮质神经细胞产生钙振荡，但振幅及振荡频率逐渐下降。与Hanks液组相比，细胞内Ca2+ 的浓度基础值下降了0.48倍，细胞内Ca2+浓度下降了2.52倍，(图2A1,表1,)。单纯细胞外无糖组细胞内Ca2+无变化(图2A1)。
表1 不同因素对1mmol/L谷氨酸引起细胞内
Ca2+变化的影响
, 百拇医药 Tab 1 Effects of different factors on [Ca2+]i in
neurons induced by 1mmol/L glutamate (
±s) Group[Ca2+]i (10-7 mol/L)
Control
2.05±0.85
Glu
14.48±4.62**
, 百拇医药
Mg2+-free+ Glu
27.40±10.18**##
Glucose-free+ Glu
4.11±1.88*##
Glucose-Mg2+-free+ Glu
7.17±2.73**##
*P<0.05, **P<0.01, vs control group; ##P<0.01, vs Glu group; Glu:glutamate
(二)细胞外液无Mg2+ 将负载后的大脑皮质神经细胞移至无Mg2+ Hanks液作用10 min，一组直接上机观察，细胞内Ca2+无变化(图2B1)；另一组加入1 mmol/L谷氨酸，大脑皮质神经细胞产生振荡，与Hanks液组相比细胞内Ca2+浓度的基础值上升了0.78倍，细胞内Ca2+浓度增加了0.87倍(图2B2, 表1)。
, 百拇医药
(三)细胞外液无糖、无Mg2+ 细胞外液无糖无Mg2+时加入1 mmol/L谷氨酸，大鼠大脑皮质神经细胞发生钙振荡，但振荡频率和/或振幅逐渐下降(图2C2, 表1,)。不加谷氨酸的对照组细胞内Ca2+无变化(图2C1)。
讨 论
利用LCSM系统可以准确地显示出活细胞内被标记离子的时空动态变化，我们利用该系统研究了无糖及无镁等因素对谷氨酸引起的大鼠大脑皮质神经细胞内游离Ca2+变化的影响。细胞外液无葡萄糖对谷氨酸引起的大脑皮质神经细胞内游离Ca2+变化的影响十分复杂，无糖时细胞内ATP生成减少是这种影响的中心环节。一方面，ATP生成减少，钙泵功能下降，胞内Ca2+向胞外转运及向钙库转移的作用减弱，趋向于使细胞内游离Ca2+增加。另一方面，①受体操纵的Ca2+内流通道是被蛋白激酶K磷酸化后开放的，而蛋白激酶K是被ATP水解产物cAMP激活的，所以在ATP减少时Ca2+的内流减少；②ATP可以增强钙库的Ca2+释放，ATP减少时，细胞内钙库Ca2+的释放减少；这些机制又趋向于使细胞内游离Ca2+减少。文献认为，ATP的综合作用是使胞浆Ca2+浓度增加[4]，增加的方式为细胞内钙振荡[5]。我们的实验证明细胞外液无糖本身对细胞内Ca2+浓度并无太大影响，但可以在一定程度上减缓谷氨酸引起的神经细胞内游离Ca2+浓度的增高。说明在谷氨酸毒性作用的一定时间内，无糖可能是有益的。
, 百拇医药
Mg2+在谷氨酸引起的神经细胞钙超载机制中起到了保护神经细胞的作用。它可拮抗受体操纵的Ca2+内流，并可通过改变内质网钙泵对Ca2+的亲合性，加强内质网对Ca2+的摄取，减少胞浆内游离Ca2+浓度。已有文献证明脑缺血病人血清镁离子浓度下降，并可加重神经细胞的损伤[1]。本文证明这种损伤作用的机制可能在于无Mg2+可以加重谷氨酸引起的细胞内Ca2+超载。无Mg2+时加重了谷氨酸引起的细胞内基础Ca2+含量的增加，随之使钙库Ca2+与胞浆Ca2+之间浓度梯度下降，钙振荡幅度随之降低[6]。本文在实验中未观察到无Mg2+本身对细胞内Ca2+的影响。无Mg2+的这种加重谷氨酸毒性的作用可以被无糖抵消。当细胞外液中既不含Mg2+又不含糖时，谷氨酸引起的以振荡方式增加的细胞内Ca2+浓度逐渐下降，Ca2+振荡的频率及振幅下降。即无糖的保护作用可能比无Mg2+的损伤作用强。
, 百拇医药
Fig 2 Effects of different factors on intracellular Ca2+ relative fluorescent intensity in neurons induced by 1 mmol/L glutamate
图2 不同因素对1mmol/L谷氨酸引起细胞内Ca2+变化的影响
[基金项目] “九五”国家医学科技攻关项目 96-906-02-21
[参 考 文 献]
[1] Altura BT, Memon ZI, Zhang A,et al. Low levels of serum ionized magnesium are found in patients early after stroke which result in rapid elevation in cytosolic free calcium and spasm in cerebral vascular muscle cells[J]. Neurosci Lett, 1997, 230:1,37～40.
, 百拇医药
[2] Kao JPY, Harootunianm AT, Tsien RY. Photochemically generated cytosolic calcium pulses and their detection by Fluo-3[J]. J Biol Chem, 1989,264:8179～8184.
[3] Leinders ZT, Rand MN, Shepherd GM,et al. Calcium entry through cyclic nucleotide-gated channels in individual cilia of olfactory receptor cells: spatiotemporal dynamics[J]. J Neurosci, 1997 , 17(11): 4136～4148.
[4] Atsumi T, Sugita K, Kohno M, et al. Simultaneous measurement of Ca2+ and pH by laser cytometry using Fluo-3 and SNARF-1[J]. Cytometry, 1996, 24:99～105.
, 百拇医药
[5] Tertyshnikova S, Fein A. [Ca2+]i oscillations and[Ca2+]i waves in rat megakaryocytes[J]. Cell Calcium, 1997, 21(5):331～344.
[6] Prakash YS, Mathur S, Sieck GC. Regulation of intracellular calcium oscillations in porcine tracheal smooth muscle cells[J]. Am J Physiol, 1997, 272:C966～C975.
[收稿日期] 1999-05-04 [修回日期] 1999-12-22
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