四氯化碳诱导的肝损伤对大鼠免疫机能的影响
作者:王丙云 陈龙 毛鑫智 J.Gonzalez-Gallego
单位:王丙云(佛山科技学院动物医学系,广东 南海 528231);陈龙(南京师范大学生命学院, 江苏 南京 210097);毛鑫智(南京农业大学动物医学院,江苏 南京 210095);J.Gonzalez-Gallego(西班牙莱昂大学生理学系,莱昂 24071)
关键词:四氯化碳;肝,损伤;免疫性
中国病理生理杂志000728 [摘 要] 目的:研究化学性肝损伤对机体免疫机能的影响。方法:选择30只健康、1月龄、平均体重(83.20±2.11) g雌雄各半SD大鼠,经一段时间适应性饲养后,随机分成四氯化碳(CCl4)注射组和对照组。CCl4注射组大鼠按0.2 mL/100 g体重剂量每周定时注射CCl4 2次, 连续注射8周;对照组同时注射等量的橄榄油。观察CCl4诱导的肝损伤对机体免疫功能的影响。结果:注射CCl4大鼠外周血T淋巴细胞比例和白细胞介素2水平显著低于对照组,与此同时B淋巴细胞比例却显著高于对照组;注射CCl4组大鼠血浆总蛋白含量和白蛋白、α和β球蛋白比例下降,而γ球蛋白上升。结论:CCl4诱导的肝损伤能明显影响大鼠的细胞免疫和体液免疫功能,造成大鼠的免疫功能失调。
, http://www.100md.com
[中图分类号] R392.32 [文献标识码] A
[文章编号] 1000-4718(2000)07-0665-02
[MeSH] Carbon tetrachloride; Liver, injuries; Immunity
过去一直将肝脏视为消化和代谢器官,现发现肝脏是胸腺以外的T淋巴细胞的分化场所,且可通过分泌一些化学物质如胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factor-1, IGF-1)参与免疫调节,因而肝脏是一个重要免疫调节器官[1,2]。以往有关肝脏损伤与机体免疫功能的关系的研究资料主要来源于临床或实验复制的肝病的生物性肝损伤模型[3]。这些诱发肝损伤的生物性因子既能通过损伤肝脏间接影响机体免疫功能,又能作为抗原直接影响机体免疫功能,因而难以说明肝损伤与机体免疫功能之间的直接关系以及肝脏的免疫调节功能。用四氯化碳(carbon tetrachloride, CCl4)诱发的化学性肝损伤模型研究肝损伤与机体免疫功能的关系,可避免生物性肝损伤模型的这些缺陷。
, 百拇医药
材 料 和 方 法
一、实验动物
30只健康、1月龄、平均体重(83.20±2.11) g雌雄对半的SD大鼠,由南京医科大学动物实验部提供。随机分成对照组和CCl4组,每组15只,饲喂大鼠全价饲料,自由饮水。
二、 注射CCl4诱导肝损伤
将分析纯CCl4(苏州振兴化工厂提供,批号970526)用橄榄油稀释成50%浓度的注射溶液。CCl4组大鼠按0.2 mL/100 g体重腹腔注射CCl4注射液,每周2次,连续8周,共16次,对照组用不含CCl4的橄榄油,在同时间腹腔注射。
三、 血样采集和处理
, http://www.100md.com
分别在CCl4,注射后第2、4、6、8周,对每组大鼠称重,并从眶下静脉丛采血样2 mL,迅速放入含有肝素钠(1∶500)的带盖塑料管内,即刻混匀,然后离心(3 000 r/min, 20 min,4℃),取出血浆置-20℃保存待测。
四、测定指标与方法
(一) T、B淋巴细胞比例 酸性非特异性酯酶(acid-α-naphthyl-acetate esterase,ANAE)组织化学染色法[4]。
(二) 血浆总蛋白(total protein, TP) 双缩脲法(试剂盒由上海科欣生物技术研究所提供;血清蛋白比例分析-醋酸纤维薄膜电泳法。
(三) 血浆白细胞介素-2(interleukin-2,IL-2)的测定 放射免疫分析法,试剂盒由中国科学院上海原子核研究所提供。
, 百拇医药
五、数据处理
以平均值和标准差(±s)表示,用SAS软件对数据作方差分析和Students't检验,确定差异显著性。
结 果
一、CCl4诱导肝损伤后大鼠血液T、B淋巴细胞比例的变化
表1 CCl4诱导肝损伤后大鼠血液T、B淋巴细胞比例(%)变化
Tab 1 Changes of blood T-and B-lymphocytes(%) in rats injected with CCl4 (±s, n=10) Group
, 百拇医药
T-lymphocytes
B-lymphocytes
CCl4
Control
CCl4
Control
Week2
31.92±5.59* *
61.93±3.76
68.19±5.21* *
37.57±8.22
, 百拇医药
Week4
30.37±7.39* *
62.27±5.47
70.18±7.02* *
36.72±5.47
Week6
31.33±8.03* *
60.00±11.85
65.33±5.56* *
40.00±11.85
, 百拇医药
Week8
29.50±12.70* *
57.57±15.10
72.50±7.81* *
42.43±15.06
* *P<0.01,vs control group表2 CCl4诱导肝损伤后血浆IL-2水平变化
Tab 2 Changes of plasma IL-2 levels in rats of liver
injured by CCl4 (±s, n=10,ng/L) Group
, 百拇医药
Weeks after injection with CCl4
2
4
6
8
CCl4
3.58±1.36* *
3.13±1.01* *
2.77±0.57* *
2.65±0.54* *
, 百拇医药
Control
6.53±0.47
5.81±1.20
6.43±0.54
6.01±0.57
* *P<0.01,vs control group
表1显示,注射CCl4的大鼠血液T淋巴细胞比例显著下降,而B淋巴细胞比例明显上升。
二、 CCl4诱导肝损伤后大鼠血浆IL-2水平的变化
由表2可见,大鼠注射CCl4后,血浆IL-2水平极显著低于对照组。
, 百拇医药
三、 CCl4诱导肝损伤后血浆总蛋白和蛋白组分的变化
由表3可知,CCl4诱导肝损伤后,大鼠血浆总蛋白含量下降,但差异不显著。在血浆蛋白组分中α-球蛋白变化不大,白蛋白和β-球蛋白低于或显著低于对照组,而γ-球蛋白高于或显著高于对照组。
表3 CCl4诱导肝损伤后血浆总蛋白和蛋白组分的变化
Tab 3 Changes of plasma total protein and constituents of protein in rats after liver injured by CCl4 (±s,n=10) Indexes
Group
, 百拇医药
Weeks after injection with CCl4
2
4
6
8
Total protein
CCl4
59.06±14.76
67.94±10.59
66.68±8.50
61.30±9.57
, 百拇医药
(g/100 mL)
Control
68.37±7.99
68.05±2.08
71.52±9.91
69.69±7.81
Albumin
CCl4
48.94±15.10
48.48±8.87
49.16±6.69* *
, 百拇医药
46.70±9.29
Control
57.80±10.43
57.42±10.05
59.98±12.26
53.95±14.03
Constituentsα-Globulin
CCl4
12.54±4.80
11.29±3.44
10.95±3.63
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11.92±6.85
protein(%)
Control
10.86±3.79
10.90±6.03
11.26±5.44
15.35±8.47
β-Globulin
CCl4
9.00±4.52
7.79±4.65
, http://www.100md.com
7.57±3.86*
10.37±4.99
Control
11.53±8.53
12.16±4.09
12.28±3.25
11.40±5.49
γ-Globulin
CCl4
29.52±9.26*
33.00±9.07
, 百拇医药
32.33±4.21* *
25.74±14.16
Control
20.61±3.87
27.60±4.52
20.76±4.74
18.67±6.86
*P<0.05, * * P<0.01, vs control group讨 论
本实验给大鼠多次反复注射亚致死量的CCl4,造成属于弥漫性肝纤维化的肝脏损伤模型。大鼠注射CCl4后,腹部明显肿大。剖开腹腔可见,腹腔积有多量淡黄色腹水,肝脏颜色变淡,呈花斑状,肿胀,质地坚硬。对照组无异常变化。外周血T和B淋巴细胞比例和IL-2水平测定的结果表明,CCl4组大鼠的外周血T淋巴细胞比例和IL-2显著低于对照组,说明CCl4诱发的肝损伤能明显抑制机体的细胞免疫功能。Paronetto的实验表明[5]:原发性肝硬化(PBC)患者的外周血T淋巴细胞百分率下降。病程早期CD+4细胞减少,CD+4/CD+8比值降低,病程后期CD+8细胞减少,CD+4/CD+8比值升高,淋巴细胞对PHA刺激的反应减弱。其它类型的肝硬化患者T细胞比例也明显下降。本实验与其结果基本一致。一些实验证明:肝在损伤时可释放大量的甲胎蛋白,进而抑制T淋巴细胞介导的免疫反应。本实验结果还表明,注射CCl4组大鼠的血浆总蛋白、白蛋白、α-球蛋白、β-球蛋白均下降或显著下降,而γ-球蛋白则显著上升。说明CCl4诱导的肝损伤能导致血浆蛋白比例紊乱[6]。肝脏是唯一合成白蛋白的器官,α-球蛋白、β-球蛋白主要也是由肝脏合成,肝脏损伤后必然会影响这几种血浆蛋白的含量。有实验证明,肝硬化患者的血浆白蛋白下降,γ-球蛋白显著升高,α-球蛋白和β-球蛋白变化不大。我们的实验结果也与其基本相符。本实验结果显示,CCl4诱导肝损伤会导致血液B淋巴细胞比例的上升,提示γ-球蛋白的升高同B淋巴细胞的增殖有关。
, 百拇医药
[参 考 文 献]
[1] 黎 光. 肝脏内非胸腺来源的T淋巴细胞及其免疫学、生物学功能[J]. 国外医学-免疫学分册,1998, 219(1):41~42.
[2] Ross,Clark. The somatogenic hormone and insulin-like grouth1; stimulator of lymphoiesis and immune function[J]. Endoc Rev,1997,18(2):157~173.
[3] 陈士葆摘译. 肝硬化患者T细胞功能损伤和自然杀伤性活性减少及其在发生肝细胞癌症中的意义[J]. 国外医学消化系疾病分册,1981,2:114~115.
[4] 王承浩,唐玉新,王亚鸣.T淋巴细胞的酸性非特异性酯酶标记及其定位[J]. 江西农业大学学报,1984,1:1~4.
[5] Paronetto F. Cell immune in liver disease[J]. Hum Pathol,1986,(1792):168~171.
[6] Nolan J P.Intestinal endotoxins as mediators of hepatic injury-An idea whose time has come again[J]. Hepatology,1989,10(5):887~889.
[收稿日期]1999-07-06
[修回日期]1999-11-24, 百拇医药
单位:王丙云(佛山科技学院动物医学系,广东 南海 528231);陈龙(南京师范大学生命学院, 江苏 南京 210097);毛鑫智(南京农业大学动物医学院,江苏 南京 210095);J.Gonzalez-Gallego(西班牙莱昂大学生理学系,莱昂 24071)
关键词:四氯化碳;肝,损伤;免疫性
中国病理生理杂志000728 [摘 要] 目的:研究化学性肝损伤对机体免疫机能的影响。方法:选择30只健康、1月龄、平均体重(83.20±2.11) g雌雄各半SD大鼠,经一段时间适应性饲养后,随机分成四氯化碳(CCl4)注射组和对照组。CCl4注射组大鼠按0.2 mL/100 g体重剂量每周定时注射CCl4 2次, 连续注射8周;对照组同时注射等量的橄榄油。观察CCl4诱导的肝损伤对机体免疫功能的影响。结果:注射CCl4大鼠外周血T淋巴细胞比例和白细胞介素2水平显著低于对照组,与此同时B淋巴细胞比例却显著高于对照组;注射CCl4组大鼠血浆总蛋白含量和白蛋白、α和β球蛋白比例下降,而γ球蛋白上升。结论:CCl4诱导的肝损伤能明显影响大鼠的细胞免疫和体液免疫功能,造成大鼠的免疫功能失调。
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[中图分类号] R392.32 [文献标识码] A
[文章编号] 1000-4718(2000)07-0665-02
[MeSH] Carbon tetrachloride; Liver, injuries; Immunity
过去一直将肝脏视为消化和代谢器官,现发现肝脏是胸腺以外的T淋巴细胞的分化场所,且可通过分泌一些化学物质如胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factor-1, IGF-1)参与免疫调节,因而肝脏是一个重要免疫调节器官[1,2]。以往有关肝脏损伤与机体免疫功能的关系的研究资料主要来源于临床或实验复制的肝病的生物性肝损伤模型[3]。这些诱发肝损伤的生物性因子既能通过损伤肝脏间接影响机体免疫功能,又能作为抗原直接影响机体免疫功能,因而难以说明肝损伤与机体免疫功能之间的直接关系以及肝脏的免疫调节功能。用四氯化碳(carbon tetrachloride, CCl4)诱发的化学性肝损伤模型研究肝损伤与机体免疫功能的关系,可避免生物性肝损伤模型的这些缺陷。
, 百拇医药
材 料 和 方 法
一、实验动物
30只健康、1月龄、平均体重(83.20±2.11) g雌雄对半的SD大鼠,由南京医科大学动物实验部提供。随机分成对照组和CCl4组,每组15只,饲喂大鼠全价饲料,自由饮水。
二、 注射CCl4诱导肝损伤
将分析纯CCl4(苏州振兴化工厂提供,批号970526)用橄榄油稀释成50%浓度的注射溶液。CCl4组大鼠按0.2 mL/100 g体重腹腔注射CCl4注射液,每周2次,连续8周,共16次,对照组用不含CCl4的橄榄油,在同时间腹腔注射。
三、 血样采集和处理
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分别在CCl4,注射后第2、4、6、8周,对每组大鼠称重,并从眶下静脉丛采血样2 mL,迅速放入含有肝素钠(1∶500)的带盖塑料管内,即刻混匀,然后离心(3 000 r/min, 20 min,4℃),取出血浆置-20℃保存待测。
四、测定指标与方法
(一) T、B淋巴细胞比例 酸性非特异性酯酶(acid-α-naphthyl-acetate esterase,ANAE)组织化学染色法[4]。
(二) 血浆总蛋白(total protein, TP) 双缩脲法(试剂盒由上海科欣生物技术研究所提供;血清蛋白比例分析-醋酸纤维薄膜电泳法。
(三) 血浆白细胞介素-2(interleukin-2,IL-2)的测定 放射免疫分析法,试剂盒由中国科学院上海原子核研究所提供。
, 百拇医药
五、数据处理
以平均值和标准差(±s)表示,用SAS软件对数据作方差分析和Students't检验,确定差异显著性。
结 果
一、CCl4诱导肝损伤后大鼠血液T、B淋巴细胞比例的变化
表1 CCl4诱导肝损伤后大鼠血液T、B淋巴细胞比例(%)变化
Tab 1 Changes of blood T-and B-lymphocytes(%) in rats injected with CCl4 (±s, n=10) Group
, 百拇医药
T-lymphocytes
B-lymphocytes
CCl4
Control
CCl4
Control
Week2
31.92±5.59* *
61.93±3.76
68.19±5.21* *
37.57±8.22
, 百拇医药
Week4
30.37±7.39* *
62.27±5.47
70.18±7.02* *
36.72±5.47
Week6
31.33±8.03* *
60.00±11.85
65.33±5.56* *
40.00±11.85
, 百拇医药
Week8
29.50±12.70* *
57.57±15.10
72.50±7.81* *
42.43±15.06
* *P<0.01,vs control group表2 CCl4诱导肝损伤后血浆IL-2水平变化
Tab 2 Changes of plasma IL-2 levels in rats of liver
injured by CCl4 (±s, n=10,ng/L) Group
, 百拇医药
Weeks after injection with CCl4
2
4
6
8
CCl4
3.58±1.36* *
3.13±1.01* *
2.77±0.57* *
2.65±0.54* *
, 百拇医药
Control
6.53±0.47
5.81±1.20
6.43±0.54
6.01±0.57
* *P<0.01,vs control group
表1显示,注射CCl4的大鼠血液T淋巴细胞比例显著下降,而B淋巴细胞比例明显上升。
二、 CCl4诱导肝损伤后大鼠血浆IL-2水平的变化
由表2可见,大鼠注射CCl4后,血浆IL-2水平极显著低于对照组。
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三、 CCl4诱导肝损伤后血浆总蛋白和蛋白组分的变化
由表3可知,CCl4诱导肝损伤后,大鼠血浆总蛋白含量下降,但差异不显著。在血浆蛋白组分中α-球蛋白变化不大,白蛋白和β-球蛋白低于或显著低于对照组,而γ-球蛋白高于或显著高于对照组。
表3 CCl4诱导肝损伤后血浆总蛋白和蛋白组分的变化
Tab 3 Changes of plasma total protein and constituents of protein in rats after liver injured by CCl4 (±s,n=10) Indexes
Group
, 百拇医药
Weeks after injection with CCl4
2
4
6
8
Total protein
CCl4
59.06±14.76
67.94±10.59
66.68±8.50
61.30±9.57
, 百拇医药
(g/100 mL)
Control
68.37±7.99
68.05±2.08
71.52±9.91
69.69±7.81
Albumin
CCl4
48.94±15.10
48.48±8.87
49.16±6.69* *
, 百拇医药
46.70±9.29
Control
57.80±10.43
57.42±10.05
59.98±12.26
53.95±14.03
Constituentsα-Globulin
CCl4
12.54±4.80
11.29±3.44
10.95±3.63
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11.92±6.85
protein(%)
Control
10.86±3.79
10.90±6.03
11.26±5.44
15.35±8.47
β-Globulin
CCl4
9.00±4.52
7.79±4.65
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7.57±3.86*
10.37±4.99
Control
11.53±8.53
12.16±4.09
12.28±3.25
11.40±5.49
γ-Globulin
CCl4
29.52±9.26*
33.00±9.07
, 百拇医药
32.33±4.21* *
25.74±14.16
Control
20.61±3.87
27.60±4.52
20.76±4.74
18.67±6.86
*P<0.05, * * P<0.01, vs control group讨 论
本实验给大鼠多次反复注射亚致死量的CCl4,造成属于弥漫性肝纤维化的肝脏损伤模型。大鼠注射CCl4后,腹部明显肿大。剖开腹腔可见,腹腔积有多量淡黄色腹水,肝脏颜色变淡,呈花斑状,肿胀,质地坚硬。对照组无异常变化。外周血T和B淋巴细胞比例和IL-2水平测定的结果表明,CCl4组大鼠的外周血T淋巴细胞比例和IL-2显著低于对照组,说明CCl4诱发的肝损伤能明显抑制机体的细胞免疫功能。Paronetto的实验表明[5]:原发性肝硬化(PBC)患者的外周血T淋巴细胞百分率下降。病程早期CD+4细胞减少,CD+4/CD+8比值降低,病程后期CD+8细胞减少,CD+4/CD+8比值升高,淋巴细胞对PHA刺激的反应减弱。其它类型的肝硬化患者T细胞比例也明显下降。本实验与其结果基本一致。一些实验证明:肝在损伤时可释放大量的甲胎蛋白,进而抑制T淋巴细胞介导的免疫反应。本实验结果还表明,注射CCl4组大鼠的血浆总蛋白、白蛋白、α-球蛋白、β-球蛋白均下降或显著下降,而γ-球蛋白则显著上升。说明CCl4诱导的肝损伤能导致血浆蛋白比例紊乱[6]。肝脏是唯一合成白蛋白的器官,α-球蛋白、β-球蛋白主要也是由肝脏合成,肝脏损伤后必然会影响这几种血浆蛋白的含量。有实验证明,肝硬化患者的血浆白蛋白下降,γ-球蛋白显著升高,α-球蛋白和β-球蛋白变化不大。我们的实验结果也与其基本相符。本实验结果显示,CCl4诱导肝损伤会导致血液B淋巴细胞比例的上升,提示γ-球蛋白的升高同B淋巴细胞的增殖有关。
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[参 考 文 献]
[1] 黎 光. 肝脏内非胸腺来源的T淋巴细胞及其免疫学、生物学功能[J]. 国外医学-免疫学分册,1998, 219(1):41~42.
[2] Ross,Clark. The somatogenic hormone and insulin-like grouth1; stimulator of lymphoiesis and immune function[J]. Endoc Rev,1997,18(2):157~173.
[3] 陈士葆摘译. 肝硬化患者T细胞功能损伤和自然杀伤性活性减少及其在发生肝细胞癌症中的意义[J]. 国外医学消化系疾病分册,1981,2:114~115.
[4] 王承浩,唐玉新,王亚鸣.T淋巴细胞的酸性非特异性酯酶标记及其定位[J]. 江西农业大学学报,1984,1:1~4.
[5] Paronetto F. Cell immune in liver disease[J]. Hum Pathol,1986,(1792):168~171.
[6] Nolan J P.Intestinal endotoxins as mediators of hepatic injury-An idea whose time has come again[J]. Hepatology,1989,10(5):887~889.
[收稿日期]1999-07-06
[修回日期]1999-11-24, 百拇医药