急性淋巴细胞白血病患儿骨髓基质细胞的粘附行为
作者：黄耘 李树浓 李晓瑜 林穗珍 罗学群 覃肇源
单位：(中山医科大学第一附属医院儿科， 广东 广州 510080)
关键词：白血病，淋巴细胞， 急性；细胞粘附；细胞粘附分子
中国病理生理杂志000811 [摘 要] 目的和方法：用MTT方法检测了急性淋巴细胞白血病(ALL)患儿骨髓基质细胞(BMSC)对正常骨髓造血细胞和淋巴瘤Raji细胞的粘附行为，用流式细胞仪检测了BMSC表面的粘附分子ICAM-1和VCAM-1的表达。结果：急性期组ALL BMSC对骨髓造血细胞的粘附能力明显下降。长期缓解组ALL BMSC对肿瘤细胞的粘附能力明显增高。急性期组ALL BMSC表面ICAM-1表达明显降低。结论：ALL患儿BMSC对骨髓造血细胞和肿瘤细胞的粘附行为的异常，BMSC粘附行为的变化与细胞表面粘附分子的表达异常有关。
, 百拇医药 [中图分类号] R733.7 [文献标识码] A
[文章编号] 1000-4718(2000)08-0713-05
Adhesion of bone marrow stromal cell in children with acute
lymphoblastic leukemia
HUANG Yun,LI Xiao-yu，LIN Sui-zhen，LUO Xue-qun，QIN Zhao-yuan1
(Department of Pediatrics of The First Affiliated Hospital Sun Yat-sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510080,China)
, 百拇医药
LI Shu-nong
(Department of Pathophysiology, Sun Yat-sen University of Medical Science, Guangzhou 510089, China)
[Abstract] AIM and METHOD: The adhesion behavior of bone marrow stromal cells(BMSC) in children with acute lymphoblastic leukemia(ALL) to bone marrow mononuclear cells(BMMC) and Raji cells were investigated by MTT method. The expression of adhesion molecules ICAM-1 and VCAM-1 were detected by flow cytometry. RESULTS: The adhesion ability of BMSC in acute period of ALL to BMMC was lower than that of control group. The adhesion ability of BMSC in long term remission period of ALL to Raji cells higher than that of control group. The expression of ICAM-1 on the surface of BMSC in acute period of ALL is much lower than that of control group. CONCLUSIONS: The adhesion of BMSC to BMMC or tumor cells in children with ALL was abnormal. The abnormal adhesion behavior might be partially due to the changed expression of adhesion molecules on BMSC.
, 百拇医药
[MeSH] Leukemia, lymphoblastic, acute; Cell adhesion; Cell adhesion molecules
急性期骨髓造血抑制和缓解期微量残余白血病细胞所致的复发是影响白血病治疗的重要因素，但二者的发生机制还不明确，骨髓基质细胞(bone marrow stromal cell, BMSC)在其中的作用不清楚，我们检测了处于不同治疗阶段的急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia, ALL)患儿BMSC对骨髓造血细胞和肿瘤细胞的粘附能力及其表面粘附分子ICAM-1(CD54)、VCAM-1(CD106)的表达，以探讨BMSC在白血病骨髓造血抑制和微量残余白血病细胞发生中的作用，促进白血病疗效的进一步提高。
材 料 和 方 法
一、病例选择和标本采集
, http://www.100md.com
ALL患儿20例，经骨髓检查确诊并进行FAB分型、免疫学分型，用统一方案治疗及随访，其中男性14例，女性6例；年龄2.5～13岁；根据患儿所处的疾病阶段将患儿分为3组：急性期组：7例，患儿系初发或复发未治或诱导治疗中尚未缓解；缓解组：7例，患儿经诱导治疗后缓解但持续缓解不足1年；长期缓解组：6例，患儿系治疗后持续缓解1年以上。全部骨髓均采自胸骨、髂前或髂后上嵴，肝素抗凝。对照组17例，为本院胸外科肺部疾患的病人，包括肺癌(11例)、支气管扩张症(3例)、肺不张(2例)、结核球(1例)。肺癌患者骨质未受侵犯，所有对照组病人外周血象正常，骨髓取自手术中切除的肋骨。
二、骨髓基质细胞的培养
病人及对照的BMSC的培养方法及鉴定参见文献[1]。
三、正常骨髓单个核细胞(bone marrow mononuclear cell, BMMC)的原代培养
, 百拇医药
用淋巴细胞分离液分离出正常BMMC，以2×106/mL接种于培养皿中，培养体系及条件同BMSC，培养的细胞在7 d内备用，此时悬浮细胞主要是造血细胞。
四、Raji细胞
Raji细胞是淋巴瘤细胞，作为本实验中的肿瘤细胞，由本校肿瘤医院中心实验室孙韵老师惠赠。在含20%小牛血清的1640中培养，每2～3 d换液1次。
五、骨髓基质细胞粘附率的测定
参考文献[2]，略加修改。将培养的骨髓基质细胞用0.25%胰蛋白酶+0.1% EDTA消化后，调整细胞浓度为1×105/mL，接种于96孔培养板，每孔100 μL，37℃，5% CO2孵育过夜。待基质细胞成层后，加入正常BMMC或Raji细胞，浓度依实验而定，每孔100 μL，继续孵育，孵育时间依实验而定。用PBS轻轻洗去未粘附的细胞，加入MTT(5 g/L)，每孔20 μL，再培养4 h。吸取培养上清，加入DMSO，每孔200 μL，使甲月 替颗粒溶解。在酶标仪上测定OD值，波长570 nm，参考波长630 nm。骨髓基质细胞对照组只加入骨髓基质细胞，不加其他细胞，而以培养基代替，测OD值。在向骨髓基质细胞层上加入正常BMMC或Raji细胞的同时，取等量细胞同条件另行悬浮培养，加入MTT培养4 h后，离心去上清，再加入DMSO测定细胞的总OD值。计算公式：
, 百拇医药
粘附率(%)=(所测得OD值-骨髓基质细胞OD值)/(所加入细胞的总OD值)
每实验点重复3孔。
六、骨髓基质细胞表面粘附分子的测定
将培养的BMSC用0.25%胰蛋白酶+0.1% EDTA消化后，每份标本编3支试管，一管加入20 μL对照试剂(鼠IgG1-PE)和兔抗鼠IgG-FITC 5μL另两管分别加入CD106 2μL、CD54-PE 2 μL，每管各加入细胞悬液100 μL(细胞5×105)，室温(18～25℃)中孵育30 min，然后用PBS洗两次，CD106管再加入兔抗鼠IgG-FITC 5μL孵育30 min后PBS洗两次，最后各管加入300 μL PBS用流式细胞仪(美国Coulter公司生产)检测。将激光管预热30 min后用荧光微球调整仪器，使各放大器接收信号的HCV值<2%，以对照管作为空白定标，计算10 000个细胞，记录标本的阳性细胞百分率。
, 百拇医药
七、ICAM-1和VCAM-1单克隆抗体对骨髓基质细胞粘附抑制率的测定
将培养的BMSC用0.25%胰蛋白酶+0.1% EDTA消化后，调整细胞浓度为1×105/mL，接种于96孔培养板，每孔100 μL,37℃，5% CO2孵育过夜。待基质细胞成层后，分别加入ICAM-1和VCAM-1单克隆抗体(购于美国Pharmingen公司)，10 μg/mL，继续培养1 h，然后用PBS洗去未与BMSC结合的抗体。实验分四组：对照组：不加粘附分子单克隆抗体；ICAM-1组：加入ICAM-1单克隆抗体；VCAM-1组：加入VCAM-1单克隆抗体；ICAM-1和VCAM-1组；同时加入ICAM-1和VCAM-1单克隆抗体。然后分别加入正常BMMC或Raji细胞，以下步骤与BMSC粘附率的测定相同。BMSC粘附抑制率的计算：
, 百拇医药 八、统计分析
应用t检验对实验数据进行统计学分析，数据用
±s表示。
结 果
一、ALL骨髓基质细胞的生长
对照组的BMSC于接种后1周左右开始形成集落，4周左右形成基质细胞层。而部分ALL患儿尤其是急性期组患儿BMSC生长缓慢，形成集落的时间可延长至1～2周，成层的时间也可延迟至4～5周，且形成的集落小，提示ALL患儿BMSC增殖能力差，也可能和ALL急性期骨髓单核细胞中白血病细胞比例增加而间质干细胞数量相对减少有关。
二、ALL骨髓基质细胞对骨髓造血细胞和肿瘤细胞粘附行为的变化
(一)达到最大粘附率的时间提前 BMSC对BMMC和Raji细胞的粘附率和粘附的时间有关，随着粘附时间的延长，粘附率逐步增高达高峰。对照组BMSC对正常BMMC和肿瘤细胞粘附达高峰的时间为6 h，而急性期和长期缓解期的ALL患儿可提前至2 h，即使再延长粘附时间也不能增加粘附率。见图1和图2。
, http://www.100md.com
Fig 1 The relationship between the adhesion of BMSC to normal BMMC and adhesion time
图1 BMSC对正常BMMC的粘附与粘附时间的关系
Fig 2 The relationship between the adhesion of BMSC to Raji cells and adhesion time
图2 BMSC对Raji细胞的粘附与粘附时间的关系
(二)对正常骨髓造血细胞粘附的饱和浓度降低，对Raji细胞粘附的饱和浓度增高 BMSC对BMMC和Raji细胞的粘附率和BMMC及Raji细胞的浓度有关，随着BMMC和Raji细胞的浓度增高而增高至饱和。对照组BMSC粘附正常BMMC的饱和浓度可达2.5×106/mL，部分急性期ALL患儿的饱和浓度可降至1.25×106mL，长期缓解期患儿的饱和浓度也可达2.5×106/mL，见图3。对照组BMSC粘附Raji细胞的饱和浓度为2.5×106/mL，而急性期和长期缓解期的ALL患儿饱和浓度可高达5.0×106/mL，见图4。
, http://www.100md.com
Fig 3 Adhesion of BMSC to different concentration of normal BMMC
图3 BMSC对不同浓度正常BMMC的粘附
Fig 4 Adhesion of BMSC to different concentration of Raji cell
图4 BMSC对不同浓度的Raji的粘附
(三)对正常骨髓造血细胞的最大粘附率下降，对肿瘤细胞的最大粘附率增高 根据结果(一)和(二)我们知道BMSC对BMMC和Raji细胞的粘附与粘附时间、BMMC和Raji细胞的浓度以及ALL的不同治疗阶段有关，因此我们对不同病期病人选择粘附高峰时间及正常BMMC、Raji细胞的饱和浓度进行BMSC粘附率的检测以尽可能反映BMSC的最大粘附率。在BMSC对正常BMMC的粘附中，正常BMMC的浓度为2.5×106/mL，对照组粘附时间取6 h，ALL病人粘附时间取2 h。在BMSC对Raji细胞的粘附中，Raji细胞的浓度对照组为2.5×106/mL, ALL病人为5.0×106/mL，粘附时间对照组为6 h，ALL病人为2 h。结果ALL急性期组对正常骨髓造血细胞的粘附率明显低于对照组，而缓解组及长期缓解组对正常骨髓造血细胞的粘附率已逐渐恢复至正常水平，长期缓解组对正常BMMC的粘附率明显高于急性期组。ALL急性期组对Raji细胞的粘附率略高于对照组，长期缓解组对Raji细胞的粘附率明显高于对照组，见表1。
, 百拇医药
表1 BMSC对正常BMMC和Raji细胞的粘附率
Tab 1 Adhesion of BMSC to normal BMMC and Raji cells(%,±s) Group
n
Adhesion to
normal BMMC
Adhesion
to Raji
Control
13
, http://www.100md.com
36.79±8.63
48.01±14.87
Acute phase ALL
7
26.02±11.55*
57.98±20.11
Remissive ALL
7
34.22±20.51
56.57±11.27
Long term remissive ALL
, http://www.100md.com
6
42.41±12.82△
67.24±19.80*
*P<0.05, vs control;△ P<0.05, vs acute phase ALL
以上结果提示ALL患儿BMSC粘附行为发生了变化，不同治疗阶段变化不同。在急性期对正常骨髓造血细胞的粘附能力下降，在缓解期对肿瘤细胞的粘附能力增强。
三、ALL BMSC表面粘附分子ICAM-1和VCAM-1的表达
(一)ALL急性期组和缓解组BMSC表面ICAM-1的表达明显低于对照组，而长期缓解组BMSC表面的ICAM-1表达和对照组相比无明显差别，但明显高于急性期组，见表2。表2 BMSC表面ICAM-1和VCAM-1的表达
, http://www.100md.com
Tab 2 Expression of ICAM-1 and VCAM-1 on
BMSC(%,±s) Group
n
ICAM-1
VCAM-1
Control
17
78.38±19.73
14.50±14.37
Acute phase ALL
, http://www.100md.com
7
26.03±17.23*
13.18±14.02
Remissive ALL
7
41.82±6.99*
16.22±12.81
Long term remissive ALL
6
59.18±22.64△
24.70±19.92
, 百拇医药
*P<0.01, vs control; △ P<0.05, vs acute phase ALL
(二)ALL各组BMSC表面的VCAM-1表达与对照组相比无明显差别，见表2。
四、ICAM-1和VCAM-1单克隆抗体对骨髓细胞粘附的阻断
ICAM-1单抗和VCAM-1单抗可以部分阻断对照组及ALL患儿的BMSC对骨髓单个核细胞的粘附，但不能阻断BMSC对Raji细胞的粘附，见表3。
表3 ICAM-1和VCAM-1单克隆抗体对BMSC粘附的抑制
Tab 3 Inhibition of ICAM-1 and VCAM-1 monoclonal
antibodies to adhesion of BMSC(%，±s) Group
, http://www.100md.com
Adhesion
to BMM
Adhesion
to Raji cells
Control
41.51±6.95
48.04±3.34
CD54
20.18±4.79
49.68±7.71
CD106
24.44±7.45
, 百拇医药
52.56±8.06
CD54+CD106
21.90±4.77
48.84±4.55
结果(三)和(四)表明ALL患儿BMSC表面的ICAM-1和VCAM-1表达也有所改变，并与疾病的发展阶段有关，且ICAM-1和VCAM-1均参与BMSC对骨髓造血细胞的粘附。讨 论
BMSC对造血细胞的自我更新、定向分化、增殖有重要的作用。对白血病病人的BMSC研究的结果表明：白血病的骨髓基质细胞在体外生长缓慢，形成的集落的能力较差[3]；对骨髓造血细胞的支持能力降低[4]；进一步发现BMSC分泌细胞因子异常[5]；粘附功能也有所变化：王江方等检测了3例ALL患者骨髓基质细胞对肿瘤细胞株的粘附能力，结果发现比正常骨髓基质细胞明显增高[2]。在本研究中ALL患儿的BMSC的粘附行为明显异常，在急性期表面对正常骨髓造血细胞的粘附下降，与疾病的不同发展阶段有关。在急性期主要表现在对正常骨髓造血细胞的粘附能力下降，在缓解期主要是对肿瘤细胞的粘附能力增加。这种粘附行为异常的原因可能是ALL BMSC表面的粘附分子等功能蛋白的表达发生了改变，而粘附行为异常的结果则导致BMSC与骨髓中的正常和异常的造血细胞的相互作用异常，因此ALL时BMSC的粘附功能也发生了明显的变化，并可能参与了疾病的发展过程。
, http://www.100md.com
BMSC一方面通过与造血细胞直接接触，对造血细胞进行调节；另一方面通过分泌多种细胞因子如GSF、IL-3、IL-6等对造血细胞进行调节。在ALL的治疗过程中，尤其是在疾病的急性期，临床上常常出现严重的骨髓抑制，是白血病死亡的常见原因之一，一般认为是由于白血病恶性克隆及化疗药物对骨髓造血细胞的抑制所致。但在我们的研究中发现：在ALL急性期，BMSC对骨髓造血细胞的粘附率明显下降，随着病情的缓解，粘附率逐渐上升，直至恢复正常，提示ALL时BMSC粘附功能的损害可能使其对骨髓造血细胞的接触调节障碍，对造血细胞的支持作用减少，成为骨髓造血抑制的原因之一。
粘附分子是介导BMSC与造血细胞直接接触的因素之一，通过粘附分子可以传递某些信息以实现BMSC和造血细胞的相互作用。在BMSC表面表达的多种粘附分子包括ICAM-1和VCAM-1，ICAM-1可以和造血细胞上的LFA-1、Mac-1相结合，VCAM-1可以和造血细胞上的VLA-4相结合。我们检测了ALL病儿的BMSC表面的粘附分子表达，结果表明急性期组病人BMSC表达ICAM-1明显降低，与王江方等的研究结果一致，在病情缓解后ICAM-1逐渐升高至正常，但ICAM-1的恢复较BMSC对BMMC粘附率的恢复要慢，因为缓解组的粘附率已正常，而ICAM-1的水平仍明显低于对照组。VCAM-1变化不是很明确。用ICAM-1和VCAM-1单克隆抗体可以部分阻断BMSC对骨髓造血细胞的粘附，说明ICAM-1和VCAM-1参与了BMSC对骨髓造血细胞的粘附，BMSC表面粘附分子的变化可导致ALL BMSC粘附行为的变化。
, 百拇医药
在白血病的治疗过程中，影响患者长期无病生存的另一个重要原因是白血病的复发。目前认为白血病复发的根源是微小残留白血病的形成，微小残余白血病的发病机制到目前为止还不清楚。BMSC与白血病细胞直接接触后对白血病细胞有一定的支持作用[6]，甚至可以使白血病细胞的抗药性增强[7]，还可以减少白血病细胞的凋亡[8]。我们的实验结果表明，ALL BMSC对肿瘤细胞的粘附能力增强，尤其在长期缓解的病人。因此我们推测BMSC可能通过对白血病细胞的粘附增强而发挥上述的支持作用，并有可能保护和隐藏白血病细胞使其不容易被机体的免疫功能和化疗药物杀灭，从而参与了微小残余白血病的形成。在本实验中长期缓解病人BMSC对肿瘤细胞的粘附率增高与ICAM-1和VCAM-1关系不密切，因为用ICAM-1和VCAM-1单抗不能阻断BMSC对肿瘤细胞的粘附，提示除了ICAM-1和VCAM-1外，还有其他粘附分子参与了细胞之间的直接接触，还需进一步研究。
[参 考 文 献]
, http://www.100md.com
[1] 杨天木 盈. 造血细胞培养技术[M]. 西安：陕西科学技术出版社，1985. 147～160.
[2] 王江方，张学光，张 毅，等. 急性淋巴细胞性白血病及其骨髓基质细胞粘附分子表达和粘附行为的探讨[J]. 中国免疫学杂志，1996，12：290～293.
[3] Lisovsky MYa, Savchenko VG. Defect of stromal microenvironment in long term bone marrow cultures of patients with acute and chronic myelogenous leukemia[J]. Leuk Lymphoma, 1995, 19: 145～152.
[4] Sparrow RL, O'Flaberty E, Blanksby M, et al. Perturbation in the ability of bone marrow stroma from patients with acute myeloid leukemia but not chronic myeloid leukemia to support normal early hematopoietic progenitor cells[J]. Leuk Res 1997, 21:29～36.
, 百拇医药
[5] Lagneaux L, Delforge A, Bron D, et al. Comparative analysis of cytokines released by bone marrow stromal cells from normal donors and B-cell chronic lymphocytotic leukemia patients[J]. Leuk Lymphoma, 1995, 17:127～133.
[6] Peled A, Lee Bc, Sternberg D, et al. Interactions between leukemia cells and bone marrow stromal cells: stromal-supported growth vs serum dependence and the roles of TGF-beta and M-CSF[J]. Exp Hematol, 1996, 24:728～737.
, 百拇医药
[7] 马月霞，宋增璇，何一心，等. 残留白血病细胞抗药再生长的实验研究[J]. 中华血液学杂志，1997， 18：231～233.
[8] Lagneaux L, Delforge A, Bron D, et al. Chronic lymphocytotic leukemic B cells but not normal B cells are rescued from apoptosis by contact with normal bone marrow stromal cells[J]. Blood, 1998, 91:2387～2396.
[收稿日期]1999-07-19 [修回日期]1999-12-14, 百拇医药
单位：(中山医科大学第一附属医院儿科， 广东 广州 510080)
关键词：白血病，淋巴细胞， 急性；细胞粘附；细胞粘附分子
中国病理生理杂志000811 [摘 要] 目的和方法：用MTT方法检测了急性淋巴细胞白血病(ALL)患儿骨髓基质细胞(BMSC)对正常骨髓造血细胞和淋巴瘤Raji细胞的粘附行为，用流式细胞仪检测了BMSC表面的粘附分子ICAM-1和VCAM-1的表达。结果：急性期组ALL BMSC对骨髓造血细胞的粘附能力明显下降。长期缓解组ALL BMSC对肿瘤细胞的粘附能力明显增高。急性期组ALL BMSC表面ICAM-1表达明显降低。结论：ALL患儿BMSC对骨髓造血细胞和肿瘤细胞的粘附行为的异常，BMSC粘附行为的变化与细胞表面粘附分子的表达异常有关。
, 百拇医药 [中图分类号] R733.7 [文献标识码] A
[文章编号] 1000-4718(2000)08-0713-05
Adhesion of bone marrow stromal cell in children with acute
lymphoblastic leukemia
HUANG Yun,LI Xiao-yu，LIN Sui-zhen，LUO Xue-qun，QIN Zhao-yuan1
(Department of Pediatrics of The First Affiliated Hospital Sun Yat-sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510080,China)
, 百拇医药
LI Shu-nong
(Department of Pathophysiology, Sun Yat-sen University of Medical Science, Guangzhou 510089, China)
[Abstract] AIM and METHOD: The adhesion behavior of bone marrow stromal cells(BMSC) in children with acute lymphoblastic leukemia(ALL) to bone marrow mononuclear cells(BMMC) and Raji cells were investigated by MTT method. The expression of adhesion molecules ICAM-1 and VCAM-1 were detected by flow cytometry. RESULTS: The adhesion ability of BMSC in acute period of ALL to BMMC was lower than that of control group. The adhesion ability of BMSC in long term remission period of ALL to Raji cells higher than that of control group. The expression of ICAM-1 on the surface of BMSC in acute period of ALL is much lower than that of control group. CONCLUSIONS: The adhesion of BMSC to BMMC or tumor cells in children with ALL was abnormal. The abnormal adhesion behavior might be partially due to the changed expression of adhesion molecules on BMSC.
, 百拇医药
[MeSH] Leukemia, lymphoblastic, acute; Cell adhesion; Cell adhesion molecules
急性期骨髓造血抑制和缓解期微量残余白血病细胞所致的复发是影响白血病治疗的重要因素，但二者的发生机制还不明确，骨髓基质细胞(bone marrow stromal cell, BMSC)在其中的作用不清楚，我们检测了处于不同治疗阶段的急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia, ALL)患儿BMSC对骨髓造血细胞和肿瘤细胞的粘附能力及其表面粘附分子ICAM-1(CD54)、VCAM-1(CD106)的表达，以探讨BMSC在白血病骨髓造血抑制和微量残余白血病细胞发生中的作用，促进白血病疗效的进一步提高。
材 料 和 方 法
一、病例选择和标本采集
, http://www.100md.com
ALL患儿20例，经骨髓检查确诊并进行FAB分型、免疫学分型，用统一方案治疗及随访，其中男性14例，女性6例；年龄2.5～13岁；根据患儿所处的疾病阶段将患儿分为3组：急性期组：7例，患儿系初发或复发未治或诱导治疗中尚未缓解；缓解组：7例，患儿经诱导治疗后缓解但持续缓解不足1年；长期缓解组：6例，患儿系治疗后持续缓解1年以上。全部骨髓均采自胸骨、髂前或髂后上嵴，肝素抗凝。对照组17例，为本院胸外科肺部疾患的病人，包括肺癌(11例)、支气管扩张症(3例)、肺不张(2例)、结核球(1例)。肺癌患者骨质未受侵犯，所有对照组病人外周血象正常，骨髓取自手术中切除的肋骨。
二、骨髓基质细胞的培养
病人及对照的BMSC的培养方法及鉴定参见文献[1]。
三、正常骨髓单个核细胞(bone marrow mononuclear cell, BMMC)的原代培养
, 百拇医药
用淋巴细胞分离液分离出正常BMMC，以2×106/mL接种于培养皿中，培养体系及条件同BMSC，培养的细胞在7 d内备用，此时悬浮细胞主要是造血细胞。
四、Raji细胞
Raji细胞是淋巴瘤细胞，作为本实验中的肿瘤细胞，由本校肿瘤医院中心实验室孙韵老师惠赠。在含20%小牛血清的1640中培养，每2～3 d换液1次。
五、骨髓基质细胞粘附率的测定
参考文献[2]，略加修改。将培养的骨髓基质细胞用0.25%胰蛋白酶+0.1% EDTA消化后，调整细胞浓度为1×105/mL，接种于96孔培养板，每孔100 μL，37℃，5% CO2孵育过夜。待基质细胞成层后，加入正常BMMC或Raji细胞，浓度依实验而定，每孔100 μL，继续孵育，孵育时间依实验而定。用PBS轻轻洗去未粘附的细胞，加入MTT(5 g/L)，每孔20 μL，再培养4 h。吸取培养上清，加入DMSO，每孔200 μL，使甲月 替颗粒溶解。在酶标仪上测定OD值，波长570 nm，参考波长630 nm。骨髓基质细胞对照组只加入骨髓基质细胞，不加其他细胞，而以培养基代替，测OD值。在向骨髓基质细胞层上加入正常BMMC或Raji细胞的同时，取等量细胞同条件另行悬浮培养，加入MTT培养4 h后，离心去上清，再加入DMSO测定细胞的总OD值。计算公式：
, 百拇医药
粘附率(%)=(所测得OD值-骨髓基质细胞OD值)/(所加入细胞的总OD值)
每实验点重复3孔。
六、骨髓基质细胞表面粘附分子的测定
将培养的BMSC用0.25%胰蛋白酶+0.1% EDTA消化后，每份标本编3支试管，一管加入20 μL对照试剂(鼠IgG1-PE)和兔抗鼠IgG-FITC 5μL另两管分别加入CD106 2μL、CD54-PE 2 μL，每管各加入细胞悬液100 μL(细胞5×105)，室温(18～25℃)中孵育30 min，然后用PBS洗两次，CD106管再加入兔抗鼠IgG-FITC 5μL孵育30 min后PBS洗两次，最后各管加入300 μL PBS用流式细胞仪(美国Coulter公司生产)检测。将激光管预热30 min后用荧光微球调整仪器，使各放大器接收信号的HCV值<2%，以对照管作为空白定标，计算10 000个细胞，记录标本的阳性细胞百分率。
, 百拇医药
七、ICAM-1和VCAM-1单克隆抗体对骨髓基质细胞粘附抑制率的测定
将培养的BMSC用0.25%胰蛋白酶+0.1% EDTA消化后，调整细胞浓度为1×105/mL，接种于96孔培养板，每孔100 μL,37℃，5% CO2孵育过夜。待基质细胞成层后，分别加入ICAM-1和VCAM-1单克隆抗体(购于美国Pharmingen公司)，10 μg/mL，继续培养1 h，然后用PBS洗去未与BMSC结合的抗体。实验分四组：对照组：不加粘附分子单克隆抗体；ICAM-1组：加入ICAM-1单克隆抗体；VCAM-1组：加入VCAM-1单克隆抗体；ICAM-1和VCAM-1组；同时加入ICAM-1和VCAM-1单克隆抗体。然后分别加入正常BMMC或Raji细胞，以下步骤与BMSC粘附率的测定相同。BMSC粘附抑制率的计算：
, 百拇医药 八、统计分析
应用t检验对实验数据进行统计学分析，数据用
±s表示。结 果
一、ALL骨髓基质细胞的生长
对照组的BMSC于接种后1周左右开始形成集落，4周左右形成基质细胞层。而部分ALL患儿尤其是急性期组患儿BMSC生长缓慢，形成集落的时间可延长至1～2周，成层的时间也可延迟至4～5周，且形成的集落小，提示ALL患儿BMSC增殖能力差，也可能和ALL急性期骨髓单核细胞中白血病细胞比例增加而间质干细胞数量相对减少有关。
二、ALL骨髓基质细胞对骨髓造血细胞和肿瘤细胞粘附行为的变化
(一)达到最大粘附率的时间提前 BMSC对BMMC和Raji细胞的粘附率和粘附的时间有关，随着粘附时间的延长，粘附率逐步增高达高峰。对照组BMSC对正常BMMC和肿瘤细胞粘附达高峰的时间为6 h，而急性期和长期缓解期的ALL患儿可提前至2 h，即使再延长粘附时间也不能增加粘附率。见图1和图2。
, http://www.100md.com
Fig 1 The relationship between the adhesion of BMSC to normal BMMC and adhesion time
图1 BMSC对正常BMMC的粘附与粘附时间的关系
Fig 2 The relationship between the adhesion of BMSC to Raji cells and adhesion time
图2 BMSC对Raji细胞的粘附与粘附时间的关系
(二)对正常骨髓造血细胞粘附的饱和浓度降低，对Raji细胞粘附的饱和浓度增高 BMSC对BMMC和Raji细胞的粘附率和BMMC及Raji细胞的浓度有关，随着BMMC和Raji细胞的浓度增高而增高至饱和。对照组BMSC粘附正常BMMC的饱和浓度可达2.5×106/mL，部分急性期ALL患儿的饱和浓度可降至1.25×106mL，长期缓解期患儿的饱和浓度也可达2.5×106/mL，见图3。对照组BMSC粘附Raji细胞的饱和浓度为2.5×106/mL，而急性期和长期缓解期的ALL患儿饱和浓度可高达5.0×106/mL，见图4。
, http://www.100md.com
Fig 3 Adhesion of BMSC to different concentration of normal BMMC
图3 BMSC对不同浓度正常BMMC的粘附
Fig 4 Adhesion of BMSC to different concentration of Raji cell
图4 BMSC对不同浓度的Raji的粘附
(三)对正常骨髓造血细胞的最大粘附率下降，对肿瘤细胞的最大粘附率增高 根据结果(一)和(二)我们知道BMSC对BMMC和Raji细胞的粘附与粘附时间、BMMC和Raji细胞的浓度以及ALL的不同治疗阶段有关，因此我们对不同病期病人选择粘附高峰时间及正常BMMC、Raji细胞的饱和浓度进行BMSC粘附率的检测以尽可能反映BMSC的最大粘附率。在BMSC对正常BMMC的粘附中，正常BMMC的浓度为2.5×106/mL，对照组粘附时间取6 h，ALL病人粘附时间取2 h。在BMSC对Raji细胞的粘附中，Raji细胞的浓度对照组为2.5×106/mL, ALL病人为5.0×106/mL，粘附时间对照组为6 h，ALL病人为2 h。结果ALL急性期组对正常骨髓造血细胞的粘附率明显低于对照组，而缓解组及长期缓解组对正常骨髓造血细胞的粘附率已逐渐恢复至正常水平，长期缓解组对正常BMMC的粘附率明显高于急性期组。ALL急性期组对Raji细胞的粘附率略高于对照组，长期缓解组对Raji细胞的粘附率明显高于对照组，见表1。
, 百拇医药
表1 BMSC对正常BMMC和Raji细胞的粘附率
Tab 1 Adhesion of BMSC to normal BMMC and Raji cells(%,
±s) Groupn
Adhesion to
normal BMMC
Adhesion
to Raji
Control
13
, http://www.100md.com
36.79±8.63
48.01±14.87
Acute phase ALL
7
26.02±11.55*
57.98±20.11
Remissive ALL
7
34.22±20.51
56.57±11.27
Long term remissive ALL
, http://www.100md.com
6
42.41±12.82△
67.24±19.80*
*P<0.05, vs control;△ P<0.05, vs acute phase ALL
以上结果提示ALL患儿BMSC粘附行为发生了变化，不同治疗阶段变化不同。在急性期对正常骨髓造血细胞的粘附能力下降，在缓解期对肿瘤细胞的粘附能力增强。
三、ALL BMSC表面粘附分子ICAM-1和VCAM-1的表达
(一)ALL急性期组和缓解组BMSC表面ICAM-1的表达明显低于对照组，而长期缓解组BMSC表面的ICAM-1表达和对照组相比无明显差别，但明显高于急性期组，见表2。表2 BMSC表面ICAM-1和VCAM-1的表达
, http://www.100md.com
Tab 2 Expression of ICAM-1 and VCAM-1 on
BMSC(%,
±s) Groupn
ICAM-1
VCAM-1
Control
17
78.38±19.73
14.50±14.37
Acute phase ALL
, http://www.100md.com
7
26.03±17.23*
13.18±14.02
Remissive ALL
7
41.82±6.99*
16.22±12.81
Long term remissive ALL
6
59.18±22.64△
24.70±19.92
, 百拇医药
*P<0.01, vs control; △ P<0.05, vs acute phase ALL
(二)ALL各组BMSC表面的VCAM-1表达与对照组相比无明显差别，见表2。
四、ICAM-1和VCAM-1单克隆抗体对骨髓细胞粘附的阻断
ICAM-1单抗和VCAM-1单抗可以部分阻断对照组及ALL患儿的BMSC对骨髓单个核细胞的粘附，但不能阻断BMSC对Raji细胞的粘附，见表3。
表3 ICAM-1和VCAM-1单克隆抗体对BMSC粘附的抑制
Tab 3 Inhibition of ICAM-1 and VCAM-1 monoclonal
antibodies to adhesion of BMSC(%，
±s) Group, http://www.100md.com
Adhesion
to BMM
Adhesion
to Raji cells
Control
41.51±6.95
48.04±3.34
CD54
20.18±4.79
49.68±7.71
CD106
24.44±7.45
, 百拇医药
52.56±8.06
CD54+CD106
21.90±4.77
48.84±4.55
结果(三)和(四)表明ALL患儿BMSC表面的ICAM-1和VCAM-1表达也有所改变，并与疾病的发展阶段有关，且ICAM-1和VCAM-1均参与BMSC对骨髓造血细胞的粘附。讨 论
BMSC对造血细胞的自我更新、定向分化、增殖有重要的作用。对白血病病人的BMSC研究的结果表明：白血病的骨髓基质细胞在体外生长缓慢，形成的集落的能力较差[3]；对骨髓造血细胞的支持能力降低[4]；进一步发现BMSC分泌细胞因子异常[5]；粘附功能也有所变化：王江方等检测了3例ALL患者骨髓基质细胞对肿瘤细胞株的粘附能力，结果发现比正常骨髓基质细胞明显增高[2]。在本研究中ALL患儿的BMSC的粘附行为明显异常，在急性期表面对正常骨髓造血细胞的粘附下降，与疾病的不同发展阶段有关。在急性期主要表现在对正常骨髓造血细胞的粘附能力下降，在缓解期主要是对肿瘤细胞的粘附能力增加。这种粘附行为异常的原因可能是ALL BMSC表面的粘附分子等功能蛋白的表达发生了改变，而粘附行为异常的结果则导致BMSC与骨髓中的正常和异常的造血细胞的相互作用异常，因此ALL时BMSC的粘附功能也发生了明显的变化，并可能参与了疾病的发展过程。
, http://www.100md.com
BMSC一方面通过与造血细胞直接接触，对造血细胞进行调节；另一方面通过分泌多种细胞因子如GSF、IL-3、IL-6等对造血细胞进行调节。在ALL的治疗过程中，尤其是在疾病的急性期，临床上常常出现严重的骨髓抑制，是白血病死亡的常见原因之一，一般认为是由于白血病恶性克隆及化疗药物对骨髓造血细胞的抑制所致。但在我们的研究中发现：在ALL急性期，BMSC对骨髓造血细胞的粘附率明显下降，随着病情的缓解，粘附率逐渐上升，直至恢复正常，提示ALL时BMSC粘附功能的损害可能使其对骨髓造血细胞的接触调节障碍，对造血细胞的支持作用减少，成为骨髓造血抑制的原因之一。
粘附分子是介导BMSC与造血细胞直接接触的因素之一，通过粘附分子可以传递某些信息以实现BMSC和造血细胞的相互作用。在BMSC表面表达的多种粘附分子包括ICAM-1和VCAM-1，ICAM-1可以和造血细胞上的LFA-1、Mac-1相结合，VCAM-1可以和造血细胞上的VLA-4相结合。我们检测了ALL病儿的BMSC表面的粘附分子表达，结果表明急性期组病人BMSC表达ICAM-1明显降低，与王江方等的研究结果一致，在病情缓解后ICAM-1逐渐升高至正常，但ICAM-1的恢复较BMSC对BMMC粘附率的恢复要慢，因为缓解组的粘附率已正常，而ICAM-1的水平仍明显低于对照组。VCAM-1变化不是很明确。用ICAM-1和VCAM-1单克隆抗体可以部分阻断BMSC对骨髓造血细胞的粘附，说明ICAM-1和VCAM-1参与了BMSC对骨髓造血细胞的粘附，BMSC表面粘附分子的变化可导致ALL BMSC粘附行为的变化。
, 百拇医药
在白血病的治疗过程中，影响患者长期无病生存的另一个重要原因是白血病的复发。目前认为白血病复发的根源是微小残留白血病的形成，微小残余白血病的发病机制到目前为止还不清楚。BMSC与白血病细胞直接接触后对白血病细胞有一定的支持作用[6]，甚至可以使白血病细胞的抗药性增强[7]，还可以减少白血病细胞的凋亡[8]。我们的实验结果表明，ALL BMSC对肿瘤细胞的粘附能力增强，尤其在长期缓解的病人。因此我们推测BMSC可能通过对白血病细胞的粘附增强而发挥上述的支持作用，并有可能保护和隐藏白血病细胞使其不容易被机体的免疫功能和化疗药物杀灭，从而参与了微小残余白血病的形成。在本实验中长期缓解病人BMSC对肿瘤细胞的粘附率增高与ICAM-1和VCAM-1关系不密切，因为用ICAM-1和VCAM-1单抗不能阻断BMSC对肿瘤细胞的粘附，提示除了ICAM-1和VCAM-1外，还有其他粘附分子参与了细胞之间的直接接触，还需进一步研究。
[参 考 文 献]
, http://www.100md.com
[1] 杨天木 盈. 造血细胞培养技术[M]. 西安：陕西科学技术出版社，1985. 147～160.
[2] 王江方，张学光，张 毅，等. 急性淋巴细胞性白血病及其骨髓基质细胞粘附分子表达和粘附行为的探讨[J]. 中国免疫学杂志，1996，12：290～293.
[3] Lisovsky MYa, Savchenko VG. Defect of stromal microenvironment in long term bone marrow cultures of patients with acute and chronic myelogenous leukemia[J]. Leuk Lymphoma, 1995, 19: 145～152.
[4] Sparrow RL, O'Flaberty E, Blanksby M, et al. Perturbation in the ability of bone marrow stroma from patients with acute myeloid leukemia but not chronic myeloid leukemia to support normal early hematopoietic progenitor cells[J]. Leuk Res 1997, 21:29～36.
, 百拇医药
[5] Lagneaux L, Delforge A, Bron D, et al. Comparative analysis of cytokines released by bone marrow stromal cells from normal donors and B-cell chronic lymphocytotic leukemia patients[J]. Leuk Lymphoma, 1995, 17:127～133.
[6] Peled A, Lee Bc, Sternberg D, et al. Interactions between leukemia cells and bone marrow stromal cells: stromal-supported growth vs serum dependence and the roles of TGF-beta and M-CSF[J]. Exp Hematol, 1996, 24:728～737.
, 百拇医药
[7] 马月霞，宋增璇，何一心，等. 残留白血病细胞抗药再生长的实验研究[J]. 中华血液学杂志，1997， 18：231～233.
[8] Lagneaux L, Delforge A, Bron D, et al. Chronic lymphocytotic leukemic B cells but not normal B cells are rescued from apoptosis by contact with normal bone marrow stromal cells[J]. Blood, 1998, 91:2387～2396.
[收稿日期]1999-07-19 [修回日期]1999-12-14, 百拇医药