球囊损伤血管内皮后平滑肌细胞凋亡及相关基因表达的变化
作者：王耿 何国祥 迟路湘 庄国强
单位：(第三军医大学附属西南医院心血管内科， 重庆 400038)
关键词：肌，平滑，血管；内皮，血管；大鼠
中国病理生理杂志000806
[摘 要] 目的：探讨球囊损伤血管内皮后平滑肌细胞(SMC)凋亡的机制。方法：采用末端脱氧核苷酸转移酶介导的三磷酸脱氧尿嘧啶缺口末端标记法(TUNEL)和免疫组织化学技术检测球囊损伤内皮后血管平滑肌细胞(VSMC)凋亡及Bax、Bcl-2蛋白的变化。结果：球囊损伤内皮后第3 d，血管中层出现凋亡的SMC； 损伤后第7 d，内膜和中层SMC凋亡率最高，凋亡的SMC主要分布在内膜层；以后逐渐降低，至损伤后第28 d，仅内膜层有少量凋亡的SMC。Irbesartan显著增加SMC凋亡(P<0.01)。球囊损伤内皮后第3 d，血管中层Bax、 Bcl-2表达显著高于假手术组(P<0.01)；损伤后第7 d血管中Bax表达最高，是假手术组的3倍，以后表达减少。球囊损伤内皮后Bcl-2表达逐渐增多，至第28 d表达最高。Bax/Bcl-2也在损伤后第7 d达最高，至第28 d降至基础水平以下。Irbesartan使Bax表达增高、Bcl-2表达降低、Bax/Bcl-2升高。结论：Bax、Bcl-2参与了球囊损伤内皮后VSMC凋亡的调节。
, 百拇医药
[中图分类号] R543 [文献标识码] A
[文章编号] 1000-4718(2000)08-0694-04
The change of smooth muscle cells apoptosis and apoptosis
related-gene expression after balloon injury to vessel
WANG Geng, HE Guo-xiang, CHI Lu-xiang, ZHANG Guo-qiang
(Department of Cardiology, Southwest Hospital, the Third Military Medical University, Chongqing 400038, China)
, 百拇医药
[Abstract] AIM: To investigate the mechanism of vascular smooth muscle cells (VSMC) apoptosis after balloon injury. METHODS: VSMCs apoptosis, Bax protein and Bcl-2 protein was measured by terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end labeling (TUNEL) and immunohistochemical technique after balloon injury.RESULTS: VSMCs apoptosis occurred in vascular media at 3 days after balloon injury and reached a peak in media and intima where apoptosis was mainly present at 7 days, then decreased. At 28 days after balloon injury, only a few apoptosis cells were in intima. Irbesartan significantly increased VSMCs apoptosis (P<0.01). Expressions of Bax and Bcl-2 were significantly higher in vascular media at 3 days after balloon injury than sham(P<0.01). At 7 days, Bax expression reached a peak which was three times as that of sham, and then decreased. After balloon injury, Bcl-2 expression was generally increased and reached its peak at 28 days. The ratio of Bax to Bcl-2 (Bax/Bcl-2) also reached its peak at 7 days and was decreased under basal level at 28 days. Irbesartan increased Bax and the ratio of Bax to Bcl-2, while decreased Bcl-2. CONCLUSION: Bcl-2 and Bax contribute to the regulation of VSMC apoptosis after balloon injury.
, 百拇医药
[MeSH] Muscle, smooth, vascular; Endothelium, vascular; Rats
近年在经皮腔内冠状动脉成形术(percutaneous transluminal coronary angioplasty, PTCA)、外周动脉血管成形术或安装支架后形成的再狭窄(restenosis, RS)病灶中均发现凋亡细胞和凋亡小体，其中血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell, VSMC)凋亡出现的频率较高，其凋亡小体的密度与内膜细胞数量呈负相关[1]。说明VSMC凋亡不足可能是RS形成的重要机制之一。而RS时VSMC凋亡的机制目前仍不清楚。本实验采用球囊损伤大鼠髂动脉内皮模型，应用病理学、免疫组织化学技术和药物干预，对内膜增生过程中组织Bcl-2、Bax和VSMC凋亡的变化进行检测，探讨RS时VSMC凋亡的作用机制。
材 料 和 方 法
, 百拇医药
一、主要试剂
鼠抗人α-平滑肌肌动蛋白(α-actin)单克隆抗体(福建迈新生物技术公司)，免疫组化SP试剂盒(北京中山公司进口分装)兔抗人Bcl-2多克隆抗体(美国Santa Curz公司)，兔抗人Bax多克隆抗体(美国Santa Cruz公司)，TUNEL试剂盒(德国宝灵曼公司)，非肽类血管紧张素Ⅰ型受体(angiotensin Ⅱ subtype 1 receptor, AT1R)拮抗剂irbeasartan(法国Sanofi研究所Dr. Chapiron惠赠)
二、动物模型复制及分组
动物模型参考Clowes等的方法复制[2]。雄性Wistar大鼠48只，体重480～520 g，1%戊巴比妥钠40 mg/kg腹腔注射麻醉，经右侧股动脉远端逆行插入2F球囊导管(Medtronic公司，美国)至腹主动脉下端，向球囊内注入生理盐水，回拉有轻度阻力，反复牵拉导管3次，使右侧髂总动脉内皮剥脱(预实验中用伊文思蓝染色及HE染色均证实血管内皮已被剥脱)。假手术组动物除不插入球囊导管外，其余步骤同上。将动物随机分为：假手术组、手术后3 d、7 d、14 d、 28 d组、手术+irbesartan(30 mg*kg-1*d-1)组，每组8只动物，手术+irbesartan组于术前6 d开始灌胃给药，术后14 d取材。
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三、方法
(一)α-actin、 Bax和Bcl-2免疫组化观察 动物麻醉后，迅速打开腹腔，分离、剪下右侧髂总动脉，置于4%多聚甲醛中固定24 h，常规脱水、浸蜡、包埋，5 μm连续切片，免疫组化采用SP法，Bax和Bcl-2免疫组化过程中用微波修复抗原，DAB显色，苏木素复染，同时作不加一抗而其它条件均相同的阴性对照。鼠抗人平滑肌肌动蛋白单克隆抗体的工作浓度为1∶20，兔抗人Bax多克隆抗体的工作浓度为1∶200，兔抗人Bcl-2多克隆抗体的工作浓度为1∶50。镜下计数着色细胞数和未着色细胞数，计算阳性细胞占同类细胞数的百分比，每只动物观察3张切片，间隔约15 mm，3个数值求均数。
(二)凋亡细胞检测 取制备好的石蜡切片作TUNEL染色，标本DAB显色，苏木素复染。同时作不加末端脱氧核苷酸转移酶而其它条件均相同的阴性对照。镜下计数着色细胞数和未着色细胞数，计算阳性细胞占同类细胞数的百分率，每只动物观察3张切片，间隔约15 mm，3个数值求均数。
, 百拇医药
四、统计分析
所测数据用均数±标准差(
±s)表示。实验数据进行方差分析。
结 果
一、VSMC的鉴定及球囊损伤血管内皮后VSMC凋亡的变化
(一)VSMC的鉴定 免疫组化染色显示，血管中层大部分细胞和增殖的内膜层所有细胞胞浆内SMα-actin染色均呈黄色片状阳性着色，阴性对照未见着色。
表1 球囊损伤血管内皮后血管壁中的TUNEL阳性细胞率(%)
Tab 1 The percentage of TUNEL-positive cells in vascular wall
, 百拇医药
after balloon injury (±s, n=8)
Media (%)
Intima(%)
Sham
0
0
3 d
7.71±1.37
7 d
9.76±1.60△
41.02±3.70
, 百拇医药
14 d
8.05±0.50▲
17.94±1.52▲▲
28 d
0
5.05±0.32☆
Irbesartan
10.09±1.52☆
53.23±5.02☆
△P<0.05, vs 3 d; ▲P<0.05, ▲▲P<0.01, vs 7 d; ☆P<0.01, vs 14 d
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(二)VSMC凋亡的变化规律 假手术组血管TUNEL染色未见阳性着色；球囊损伤后第3 d，血管中层可见胞核呈棕黄色阳性着色的VSMC散在分布，尚未形成新生内膜；损伤后第7 d(图1，见加页Ⅰ)，血管中层TUNEL阳性细胞数增多，新生内膜形成，内膜层可见大量TUNEL阳性细胞；损伤后第14 d，血管中层和内膜层TUNEL阳性细胞率低于损伤后第7 d，尤以内膜层明显(P<0.01)；损伤后第28 d，仅见少量TUNEL阳性细胞位于血管内膜。irbesartan组血管内膜VSMC凋亡率显著高于手术后14 d组(P<0.01，见表1)。
二、球囊损伤后血管壁Bax和Bcl-2蛋白的变化规律
假手术组血管中层可见Bax免疫组化阳性细胞，胞浆中有棕黄色片状或颗粒状着色，有的细胞核膜也有阳性着色；球囊损伤血管内皮后第3 d，血管中层Bax阳性细胞率显著高于假手术组(P<0.01)；损伤后第7 d(图2，见加页Ⅰ)，血管中层和内膜层Bax阳性细胞率均达最高；损伤后第14 d和28 d，Bax表达阳性细胞率在血管中层和内膜层都较低；Bax在血管中层和内膜层的阳性表达率无显著差异(P>0.05)。
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假手术组血管中层可见细胞浆内颗粒状或片状棕黄色Bcl-2免疫组化阳性着色，有的细胞可见核膜呈棕黄色；球囊损伤血管内皮后第3 d血管中层Bcl-2阳性细胞率显著高于假手术组(P<0.01)；损伤后第7 d、14 d、 28 d，血管壁Bcl-2表达逐渐增多，至第28 d表达最多(图3，见加页Ⅰ)。Bcl-2在血管中层和内膜层的表达无显著差异(P>0.05)。
球囊损伤内皮后第3 d血管中层Bax/Bcl-2显著高于假手术组(P<0.01)； 损伤后第7 d，该比率达最高；损伤后第14 d和28 d血管内膜和中层Bax/Bcl-2较少。
手术+irbesartan组Bax及Bax/Bcl-2表达均显著高于手术后14 d组(P<0.01)(图4，见加页Ⅰ)，而Bcl-2表达显著低于手术后14 d组(P<0.01，见表2)。
表2 球囊损伤血管内皮后血管壁中Bax、Bcl-2表达的变化
, 百拇医药
Tab 2 The change of Bax and Bcl-2 protein in vascular wall after balloon injury (±s, n=8)
Bax(%)
Bcl-2(%)
Bax/Bcl-2
Media
Intima
Media
Intima
Media
, 百拇医药
Intima
Sham
19.9±2.8
0
21.7±1.8
0
0.9±0.2
0
3 d
34.4±3.1*
29.5±2.1*
1.2±0.1*
, 百拇医药
7 d
59.4±5.2△△
62.3±5.1
32.3±2.9△
33.97±3.1
1.9±0.2△△
1.85±0.2
14 d
50.7±3.6▲
51.9±3.1▲
40.2±2.6▲
, 百拇医药
40.9±3.8▲
1.3±0.1▲
1.3±0.0▲
28 d
37.3±3.6☆
38.6±4.1☆
66.3±4.4☆
67.7±4.7☆
0.57±0.1☆
0.6±0.1☆
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Irbesartan
67.0±4.1☆
67.8±4.7☆
29.1±1.4☆
29.4±1.6☆
2.3±0.1☆
2.3±0.1☆
*P<0.01, vs sham; △P<0.05, △△P<0.01, vs 3 d; ▲P<0.01, vs 7 d; ☆P<0.01, vs 14 d讨 论
SMα-actin是VSMC的特异性抗体，它不与成纤维细胞、单核细胞等反应，本实验通过免疫组化染色发现，所有的内膜细胞和大多数中层细胞SMα-actin均呈阳性反应，因此可确定所有内膜细胞和大多数中层细胞均为VSMC。
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细胞凋亡是一个主动的可调控的过程，是受一系列基因即凋亡相关基因调控的。bcl-2和Bax基因是两个重要的凋亡相关基因，前者抑制细胞凋亡，后者促进细胞凋亡。它们分别表达的Bcl-2和Bax蛋白均为Bcl-2家族成员，二者的氨基酸序列有21%的同源性[3]。Bennett等[4]发现Bcl-2的过度表达抑制去血清条件下转染c-myc和EIA基因所致的大鼠VSMC凋亡；Aoki等[5]发现去血清诱导的人主动脉VSMC凋亡伴Bax蛋白表达增多。人冠状动脉粥样硬化斑块VSMC凋亡较多的脂质条纹区Bax表达也增加[6]。说明Bcl-2和Bax也参与了VSMC凋亡的调控。
本实验发现Bcl-2蛋白在正常血管中层VSMC核膜及胞浆表达明显，球囊损伤内皮后第3 d，Bcl-2蛋白在中层VSMC的表达逐渐开始增多，损伤后第7 d出现的新生内膜中也有Bcl-2蛋白表达，并随时间推移表达增加：损伤后第4周，内膜和中层的Bcl-2蛋白表达均达高峰。损伤7 d后，随血管损伤后时间推延，新生内膜和血管中层Bcl-2蛋白表达逐渐升高而VSMC凋亡率下降，应用AT1R拮抗剂后Bcl-2表达减少，VSMC凋亡增加，说明Bcl-2蛋白抑制血管损伤后血管内膜和中层VSMC凋亡。Bcl-2抑制细胞凋亡的机制不清，可能的途径有：①Bcl-2蛋白位于核膜、部分内质网膜和线粒体膜[7]，它通过抑制内质网和线粒体钙的释放而抑制细胞凋亡[8]。许多引起细胞凋亡生化和形态学改变的酶如核酸内切酶、钙离子依赖的中性蛋白酶(calpoin)、谷氨酰胺转移酶等是Ca2+依赖性的，它们使DNA断裂，破坏细胞骨架，使胞浆内蛋白质交联、降解，使细胞发生凋亡；Ca2+还使细胞膜上磷脂酰丝氨酸(PS)暴露，吞噬细胞通过PS识别和吞噬凋亡细胞[9]。细胞浆中Ca2+减少使这些酶不能被激活，从而保护细胞结构，中止凋亡过程，这与一些文章推论的Bcl-2阻断引起细胞凋亡的最后环节相符[7]。②通过抗氧化途径抑制细胞凋亡。已有实验证明被氧化的低密度脂蛋白通过脂质过氧化介导VSMC凋亡，过氧化氢通过产生羟自由基(OH*)介导VSMC凋亡[10，11]。Bcl-2可抑制氧自由基对脂质的氧化作用[12]。③抑制ICE基因，c-myc基因引起的细胞凋亡[13]。
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本实验表明球囊损伤内皮后，Bax蛋白在血管中层和新生内膜VSMC中表达增加，损伤后7 d达高峰，以后逐渐降低，与球囊损伤后VSMC凋亡的趋势一致，应用AT1R拮抗剂后Bax表达增加，血管内膜和中层VSMC凋亡也增多，说明Bax促进球囊损伤后VSMC凋亡。Bax促进细胞凋亡的机制可能有两个途径[9]，①促进Ca2+从内质网释放，进入胞核，激活核酸内切酶，使DNA断裂。②促进线粒体释放细胞色素C，使线粒体功能丧失。
本实验表明球囊损伤后第3 d和第7 d，血管中层VSMC表达Bcl-2蛋白持续升高，但中层VSMC凋亡继续增多，在第7 d达高峰，似乎与Bcl-2在内膜中抑制VSMC凋亡的实验结果不符。但是我们也观察到在此期间中层VSMC表达Bax和Bcl-2的比率是升高的。已有实验证明Bcl-2家族成员之间相互作用形成同源二聚体或异源二聚体，Bax的同源二聚体促进细胞凋亡，Bcl-2的同源二聚体抑制细胞凋亡，Bax与Bcl-2形成的异源二聚体对凋亡无作用。Bax高则Bax同源二聚体增多，细胞趋向于凋亡，Bcl-2高则Bcl-2同源二聚体升高，细胞趋向于存活。所以Bax与Bcl-2表达的比率才是决定细胞是否凋亡的关键。尽管本实验中球囊损伤内皮后第3 d和第7 d血管中层VSMC表达Bcl-2增多，但Bax与Bcl-2的比率也是升高的，所以中层VSMC凋亡仍继续增加。另外，我们注意到，尽管新生内膜与中层Bax与Bcl-2表达无显著差异，但新生内膜中VSMC凋亡率却高于血管中层，其中具体原因不清，可能与其它一些凋亡相关基因在血管中层和新生内膜中表达不一有关。
, 百拇医药
[参 考 文 献]
[1] Bauriedel G, Schluckebier S, Hutter R, et al. Apoptosis in restenosis versus stable-angina atherosclerosis: implications for the pathogenesis of restenosis[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 1998, 18: 1132～1139.
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, 百拇医药
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, 百拇医药
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[收稿日期]1999-07-20 [修回日期]1999-12-03, 百拇医药
单位：(第三军医大学附属西南医院心血管内科， 重庆 400038)
关键词：肌，平滑，血管；内皮，血管；大鼠
中国病理生理杂志000806
[摘 要] 目的：探讨球囊损伤血管内皮后平滑肌细胞(SMC)凋亡的机制。方法：采用末端脱氧核苷酸转移酶介导的三磷酸脱氧尿嘧啶缺口末端标记法(TUNEL)和免疫组织化学技术检测球囊损伤内皮后血管平滑肌细胞(VSMC)凋亡及Bax、Bcl-2蛋白的变化。结果：球囊损伤内皮后第3 d，血管中层出现凋亡的SMC； 损伤后第7 d，内膜和中层SMC凋亡率最高，凋亡的SMC主要分布在内膜层；以后逐渐降低，至损伤后第28 d，仅内膜层有少量凋亡的SMC。Irbesartan显著增加SMC凋亡(P<0.01)。球囊损伤内皮后第3 d，血管中层Bax、 Bcl-2表达显著高于假手术组(P<0.01)；损伤后第7 d血管中Bax表达最高，是假手术组的3倍，以后表达减少。球囊损伤内皮后Bcl-2表达逐渐增多，至第28 d表达最高。Bax/Bcl-2也在损伤后第7 d达最高，至第28 d降至基础水平以下。Irbesartan使Bax表达增高、Bcl-2表达降低、Bax/Bcl-2升高。结论：Bax、Bcl-2参与了球囊损伤内皮后VSMC凋亡的调节。
, 百拇医药
[中图分类号] R543 [文献标识码] A
[文章编号] 1000-4718(2000)08-0694-04
The change of smooth muscle cells apoptosis and apoptosis
related-gene expression after balloon injury to vessel
WANG Geng, HE Guo-xiang, CHI Lu-xiang, ZHANG Guo-qiang
(Department of Cardiology, Southwest Hospital, the Third Military Medical University, Chongqing 400038, China)
, 百拇医药
[Abstract] AIM: To investigate the mechanism of vascular smooth muscle cells (VSMC) apoptosis after balloon injury. METHODS: VSMCs apoptosis, Bax protein and Bcl-2 protein was measured by terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end labeling (TUNEL) and immunohistochemical technique after balloon injury.RESULTS: VSMCs apoptosis occurred in vascular media at 3 days after balloon injury and reached a peak in media and intima where apoptosis was mainly present at 7 days, then decreased. At 28 days after balloon injury, only a few apoptosis cells were in intima. Irbesartan significantly increased VSMCs apoptosis (P<0.01). Expressions of Bax and Bcl-2 were significantly higher in vascular media at 3 days after balloon injury than sham(P<0.01). At 7 days, Bax expression reached a peak which was three times as that of sham, and then decreased. After balloon injury, Bcl-2 expression was generally increased and reached its peak at 28 days. The ratio of Bax to Bcl-2 (Bax/Bcl-2) also reached its peak at 7 days and was decreased under basal level at 28 days. Irbesartan increased Bax and the ratio of Bax to Bcl-2, while decreased Bcl-2. CONCLUSION: Bcl-2 and Bax contribute to the regulation of VSMC apoptosis after balloon injury.
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[MeSH] Muscle, smooth, vascular; Endothelium, vascular; Rats
近年在经皮腔内冠状动脉成形术(percutaneous transluminal coronary angioplasty, PTCA)、外周动脉血管成形术或安装支架后形成的再狭窄(restenosis, RS)病灶中均发现凋亡细胞和凋亡小体，其中血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell, VSMC)凋亡出现的频率较高，其凋亡小体的密度与内膜细胞数量呈负相关[1]。说明VSMC凋亡不足可能是RS形成的重要机制之一。而RS时VSMC凋亡的机制目前仍不清楚。本实验采用球囊损伤大鼠髂动脉内皮模型，应用病理学、免疫组织化学技术和药物干预，对内膜增生过程中组织Bcl-2、Bax和VSMC凋亡的变化进行检测，探讨RS时VSMC凋亡的作用机制。
材 料 和 方 法
, 百拇医药
一、主要试剂
鼠抗人α-平滑肌肌动蛋白(α-actin)单克隆抗体(福建迈新生物技术公司)，免疫组化SP试剂盒(北京中山公司进口分装)兔抗人Bcl-2多克隆抗体(美国Santa Curz公司)，兔抗人Bax多克隆抗体(美国Santa Cruz公司)，TUNEL试剂盒(德国宝灵曼公司)，非肽类血管紧张素Ⅰ型受体(angiotensin Ⅱ subtype 1 receptor, AT1R)拮抗剂irbeasartan(法国Sanofi研究所Dr. Chapiron惠赠)
二、动物模型复制及分组
动物模型参考Clowes等的方法复制[2]。雄性Wistar大鼠48只，体重480～520 g，1%戊巴比妥钠40 mg/kg腹腔注射麻醉，经右侧股动脉远端逆行插入2F球囊导管(Medtronic公司，美国)至腹主动脉下端，向球囊内注入生理盐水，回拉有轻度阻力，反复牵拉导管3次，使右侧髂总动脉内皮剥脱(预实验中用伊文思蓝染色及HE染色均证实血管内皮已被剥脱)。假手术组动物除不插入球囊导管外，其余步骤同上。将动物随机分为：假手术组、手术后3 d、7 d、14 d、 28 d组、手术+irbesartan(30 mg*kg-1*d-1)组，每组8只动物，手术+irbesartan组于术前6 d开始灌胃给药，术后14 d取材。
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三、方法
(一)α-actin、 Bax和Bcl-2免疫组化观察 动物麻醉后，迅速打开腹腔，分离、剪下右侧髂总动脉，置于4%多聚甲醛中固定24 h，常规脱水、浸蜡、包埋，5 μm连续切片，免疫组化采用SP法，Bax和Bcl-2免疫组化过程中用微波修复抗原，DAB显色，苏木素复染，同时作不加一抗而其它条件均相同的阴性对照。鼠抗人平滑肌肌动蛋白单克隆抗体的工作浓度为1∶20，兔抗人Bax多克隆抗体的工作浓度为1∶200，兔抗人Bcl-2多克隆抗体的工作浓度为1∶50。镜下计数着色细胞数和未着色细胞数，计算阳性细胞占同类细胞数的百分比，每只动物观察3张切片，间隔约15 mm，3个数值求均数。
(二)凋亡细胞检测 取制备好的石蜡切片作TUNEL染色，标本DAB显色，苏木素复染。同时作不加末端脱氧核苷酸转移酶而其它条件均相同的阴性对照。镜下计数着色细胞数和未着色细胞数，计算阳性细胞占同类细胞数的百分率，每只动物观察3张切片，间隔约15 mm，3个数值求均数。
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四、统计分析
所测数据用均数±标准差(
±s)表示。实验数据进行方差分析。结 果
一、VSMC的鉴定及球囊损伤血管内皮后VSMC凋亡的变化
(一)VSMC的鉴定 免疫组化染色显示，血管中层大部分细胞和增殖的内膜层所有细胞胞浆内SMα-actin染色均呈黄色片状阳性着色，阴性对照未见着色。
表1 球囊损伤血管内皮后血管壁中的TUNEL阳性细胞率(%)
Tab 1 The percentage of TUNEL-positive cells in vascular wall
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after balloon injury (
±s, n=8)Media (%)
Intima(%)
Sham
0
0
3 d
7.71±1.37
7 d
9.76±1.60△
41.02±3.70
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14 d
8.05±0.50▲
17.94±1.52▲▲
28 d
0
5.05±0.32☆
Irbesartan
10.09±1.52☆
53.23±5.02☆
△P<0.05, vs 3 d; ▲P<0.05, ▲▲P<0.01, vs 7 d; ☆P<0.01, vs 14 d
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(二)VSMC凋亡的变化规律 假手术组血管TUNEL染色未见阳性着色；球囊损伤后第3 d，血管中层可见胞核呈棕黄色阳性着色的VSMC散在分布，尚未形成新生内膜；损伤后第7 d(图1，见加页Ⅰ)，血管中层TUNEL阳性细胞数增多，新生内膜形成，内膜层可见大量TUNEL阳性细胞；损伤后第14 d，血管中层和内膜层TUNEL阳性细胞率低于损伤后第7 d，尤以内膜层明显(P<0.01)；损伤后第28 d，仅见少量TUNEL阳性细胞位于血管内膜。irbesartan组血管内膜VSMC凋亡率显著高于手术后14 d组(P<0.01，见表1)。
二、球囊损伤后血管壁Bax和Bcl-2蛋白的变化规律
假手术组血管中层可见Bax免疫组化阳性细胞，胞浆中有棕黄色片状或颗粒状着色，有的细胞核膜也有阳性着色；球囊损伤血管内皮后第3 d，血管中层Bax阳性细胞率显著高于假手术组(P<0.01)；损伤后第7 d(图2，见加页Ⅰ)，血管中层和内膜层Bax阳性细胞率均达最高；损伤后第14 d和28 d，Bax表达阳性细胞率在血管中层和内膜层都较低；Bax在血管中层和内膜层的阳性表达率无显著差异(P>0.05)。
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假手术组血管中层可见细胞浆内颗粒状或片状棕黄色Bcl-2免疫组化阳性着色，有的细胞可见核膜呈棕黄色；球囊损伤血管内皮后第3 d血管中层Bcl-2阳性细胞率显著高于假手术组(P<0.01)；损伤后第7 d、14 d、 28 d，血管壁Bcl-2表达逐渐增多，至第28 d表达最多(图3，见加页Ⅰ)。Bcl-2在血管中层和内膜层的表达无显著差异(P>0.05)。
球囊损伤内皮后第3 d血管中层Bax/Bcl-2显著高于假手术组(P<0.01)； 损伤后第7 d，该比率达最高；损伤后第14 d和28 d血管内膜和中层Bax/Bcl-2较少。
手术+irbesartan组Bax及Bax/Bcl-2表达均显著高于手术后14 d组(P<0.01)(图4，见加页Ⅰ)，而Bcl-2表达显著低于手术后14 d组(P<0.01，见表2)。
表2 球囊损伤血管内皮后血管壁中Bax、Bcl-2表达的变化
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Tab 2 The change of Bax and Bcl-2 protein in vascular wall after balloon injury (
±s, n=8)Bax(%)
Bcl-2(%)
Bax/Bcl-2
Media
Intima
Media
Intima
Media
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Intima
Sham
19.9±2.8
0
21.7±1.8
0
0.9±0.2
0
3 d
34.4±3.1*
29.5±2.1*
1.2±0.1*
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7 d
59.4±5.2△△
62.3±5.1
32.3±2.9△
33.97±3.1
1.9±0.2△△
1.85±0.2
14 d
50.7±3.6▲
51.9±3.1▲
40.2±2.6▲
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40.9±3.8▲
1.3±0.1▲
1.3±0.0▲
28 d
37.3±3.6☆
38.6±4.1☆
66.3±4.4☆
67.7±4.7☆
0.57±0.1☆
0.6±0.1☆
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Irbesartan
67.0±4.1☆
67.8±4.7☆
29.1±1.4☆
29.4±1.6☆
2.3±0.1☆
2.3±0.1☆
*P<0.01, vs sham; △P<0.05, △△P<0.01, vs 3 d; ▲P<0.01, vs 7 d; ☆P<0.01, vs 14 d讨 论
SMα-actin是VSMC的特异性抗体，它不与成纤维细胞、单核细胞等反应，本实验通过免疫组化染色发现，所有的内膜细胞和大多数中层细胞SMα-actin均呈阳性反应，因此可确定所有内膜细胞和大多数中层细胞均为VSMC。
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细胞凋亡是一个主动的可调控的过程，是受一系列基因即凋亡相关基因调控的。bcl-2和Bax基因是两个重要的凋亡相关基因，前者抑制细胞凋亡，后者促进细胞凋亡。它们分别表达的Bcl-2和Bax蛋白均为Bcl-2家族成员，二者的氨基酸序列有21%的同源性[3]。Bennett等[4]发现Bcl-2的过度表达抑制去血清条件下转染c-myc和EIA基因所致的大鼠VSMC凋亡；Aoki等[5]发现去血清诱导的人主动脉VSMC凋亡伴Bax蛋白表达增多。人冠状动脉粥样硬化斑块VSMC凋亡较多的脂质条纹区Bax表达也增加[6]。说明Bcl-2和Bax也参与了VSMC凋亡的调控。
本实验发现Bcl-2蛋白在正常血管中层VSMC核膜及胞浆表达明显，球囊损伤内皮后第3 d，Bcl-2蛋白在中层VSMC的表达逐渐开始增多，损伤后第7 d出现的新生内膜中也有Bcl-2蛋白表达，并随时间推移表达增加：损伤后第4周，内膜和中层的Bcl-2蛋白表达均达高峰。损伤7 d后，随血管损伤后时间推延，新生内膜和血管中层Bcl-2蛋白表达逐渐升高而VSMC凋亡率下降，应用AT1R拮抗剂后Bcl-2表达减少，VSMC凋亡增加，说明Bcl-2蛋白抑制血管损伤后血管内膜和中层VSMC凋亡。Bcl-2抑制细胞凋亡的机制不清，可能的途径有：①Bcl-2蛋白位于核膜、部分内质网膜和线粒体膜[7]，它通过抑制内质网和线粒体钙的释放而抑制细胞凋亡[8]。许多引起细胞凋亡生化和形态学改变的酶如核酸内切酶、钙离子依赖的中性蛋白酶(calpoin)、谷氨酰胺转移酶等是Ca2+依赖性的，它们使DNA断裂，破坏细胞骨架，使胞浆内蛋白质交联、降解，使细胞发生凋亡；Ca2+还使细胞膜上磷脂酰丝氨酸(PS)暴露，吞噬细胞通过PS识别和吞噬凋亡细胞[9]。细胞浆中Ca2+减少使这些酶不能被激活，从而保护细胞结构，中止凋亡过程，这与一些文章推论的Bcl-2阻断引起细胞凋亡的最后环节相符[7]。②通过抗氧化途径抑制细胞凋亡。已有实验证明被氧化的低密度脂蛋白通过脂质过氧化介导VSMC凋亡，过氧化氢通过产生羟自由基(OH*)介导VSMC凋亡[10，11]。Bcl-2可抑制氧自由基对脂质的氧化作用[12]。③抑制ICE基因，c-myc基因引起的细胞凋亡[13]。
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本实验表明球囊损伤内皮后，Bax蛋白在血管中层和新生内膜VSMC中表达增加，损伤后7 d达高峰，以后逐渐降低，与球囊损伤后VSMC凋亡的趋势一致，应用AT1R拮抗剂后Bax表达增加，血管内膜和中层VSMC凋亡也增多，说明Bax促进球囊损伤后VSMC凋亡。Bax促进细胞凋亡的机制可能有两个途径[9]，①促进Ca2+从内质网释放，进入胞核，激活核酸内切酶，使DNA断裂。②促进线粒体释放细胞色素C，使线粒体功能丧失。
本实验表明球囊损伤后第3 d和第7 d，血管中层VSMC表达Bcl-2蛋白持续升高，但中层VSMC凋亡继续增多，在第7 d达高峰，似乎与Bcl-2在内膜中抑制VSMC凋亡的实验结果不符。但是我们也观察到在此期间中层VSMC表达Bax和Bcl-2的比率是升高的。已有实验证明Bcl-2家族成员之间相互作用形成同源二聚体或异源二聚体，Bax的同源二聚体促进细胞凋亡，Bcl-2的同源二聚体抑制细胞凋亡，Bax与Bcl-2形成的异源二聚体对凋亡无作用。Bax高则Bax同源二聚体增多，细胞趋向于凋亡，Bcl-2高则Bcl-2同源二聚体升高，细胞趋向于存活。所以Bax与Bcl-2表达的比率才是决定细胞是否凋亡的关键。尽管本实验中球囊损伤内皮后第3 d和第7 d血管中层VSMC表达Bcl-2增多，但Bax与Bcl-2的比率也是升高的，所以中层VSMC凋亡仍继续增加。另外，我们注意到，尽管新生内膜与中层Bax与Bcl-2表达无显著差异，但新生内膜中VSMC凋亡率却高于血管中层，其中具体原因不清，可能与其它一些凋亡相关基因在血管中层和新生内膜中表达不一有关。
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[参 考 文 献]
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[收稿日期]1999-07-20 [修回日期]1999-12-03, 百拇医药