葡萄糖、乳酸和丙酮酸对心肌线粒体氧耗动态适应的影响.
作者：田新强
单位：田新强(大同医学专科学校病理生理教研室，山西 大同 037008)
关键词：心肌；线粒体；氧化磷酸化；葡萄糖；乳酸；丙酮酸
中国病理生理杂志000804
[摘 要] 目的：了解外源性碳源物对心肌氧化磷酸化动态调节的影响。方法：采用Van Beek建立的心肌线粒体平均氧耗反应时间(tmito)测定方法，以葡萄糖、乳酸和丙酮酸分别为心肌供能的碳源物，用37℃的Tyrode液灌流离体兔心脏进行实验。结果：心率由120分别增至140和220(min-1)。测得的tmito：葡萄糖为(6.3±1.0) s和(7.4±0.9) s；乳酸为(5.4±1.2) s和(7.0±0.9) s；丙酮酸为(4.0±0.7) s和(6.5±0.6) s (tow-way ANOVA,P<0.05，与葡萄糖，乳酸比较)。结论：心肌线粒体氧化磷酸化在心肌ATP利用快速变化的动态适应过程中，还原当量向线粒体内的转运可能是动态适应的限速因素。
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[中图分类号] R331.3+1 [文献标识码] A
[文章编号] 1000-4718(2000)08-0685-05
The effect of glucose, lactate and pyruvate on the dynamic
adaptation of cardiac mitochondrial oxygen consumption
TIAN Xin-qiang
(Department of Pathophysiology, Datong Medical College, Datong 037008, China)
[Abstract] AIM: To understand the effect of exogenous carbon substrate on the dynamic regulation of cardiac oxidative phosphorylation. METHODS: Method of mean response time measurement of the myocardial mitochondrial O2 consumption (tmito) was developed by van Beek. Glucose, lactate, or pyruvate as carbon substrate respectively for myocardial energy supply was perfused in isolated rabbit hearts with Tyrode solution at 37℃. RESULTS: When heart rate was stepped up from 120 to 140 and 220 (beat.min-1) respectively the tmito. We have measured was: (6.3±1.0) s and (7.4±0.9) s for glucose; (5.4±1.2) s and (7.0±0.9) s for lactate; (4.0±0.7)s and (6.5±0.6) s for pyruvate (two way ANOVA, P<0.05, compared with lactate and glucose). CONCLUSION: The transport of reducing equivalent into the mitochondrial matrix might be a limitation factor of dynamic adaptation of cardiac mitochondrial oxidative phosphorylation during fast changes in ATP utilization.
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[MeSH] Myocardium; Mitochondria; Oxidative phosphorylation; Glucose; Lactates; Pyruvates
外源性碳源物的类型对作功处于稳定状态的心肌氧化磷酸化水平有明显的影响[1]。当葡萄糖为外源性碳源时，细胞内二磷酸腺苷(adenosine diphosphate, ADP)和无机磷酸(inorganic phosphate, Pi)的水平较高，而进入线粒体呼吸链的还原当量对氧化磷酸化起相当重要的限速控制作用[2]。当丙酮酸为外源性碳源物时，心肌细胞线粒体内还原型尼可酰胺腺嘌呤二核苷酸(reduced nicotinamide adenine dinucleotide, NADH)的水平增高[3]，而ADP水平较低。外源性碳源物对心肌线粒体氧化磷酸化动态适应的影响还知之甚少。在骨骼肌，当三磷酸腺苷(adenosine triphosphate, ATP)消耗增加时，其线粒体ATP合成的适应速度是恒定的[4]，氧化磷酸化的变化是由磷酸化合物代谢水平的变化所引起的。然而，用葡萄糖灌流离体兔心脏，在较大的心率变化时，心肌氧化磷酸化对ATP分解的适应速度降低[5]。假若其适应速度降低是由于葡萄糖为氧化底物时，心肌线粒体内的尼可酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide, NAD+)水平降低起了部分限速作用[5]。由此提出糖酵解或还原当量的转运是否是氧化磷酸化适应过程的限速因素。本研究采用Van Beek 建立的心肌线粒体平均氧耗反应时间测定方法[6]，试图了解不同外源性碳源物对心肌氧化磷酸化动态适应的影响。
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材 料 和 方 法
一、一般准备
新西兰兔(n=12)雌雄不限，体重(2.6±0.2) kg(
±s)，肌注氟丁酰酮(9.8±0.3) mg/kg和芬太尼(hypnorm; Janssen Pharmaceutica, Beerse, Belgium)(0.38±0.01) mg/kg麻醉动物，静注苯巴比妥钠10 mg/kg和肝素2 500 IU，开胸，取出心脏，按照Langendoff 方法灌流心脏。以37℃的Tyrode液作为灌流液，95% O2 和5% CO2 气体充分饱和。腺苷(Sigma, St. Louis, MO)10-5 mol/L作为冠脉血管舒张剂加入灌流液中以保证心肌最大的灌流量。以11.1 mmol/L的葡萄糖、乳酸和丙酮酸分别为心肌供能的碳源物质。离体心脏准备详见van Beek等的报道[5, 6]。
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二、灌流装置
采用恒流恒温灌流系统。两个Clark type氧电极分别置于心脏的主动脉和肺动脉插管测定灌流液氧分压。一灌流旁路装置可使约10%的灌流液转为由95% N2和5%CO2饱和的灌流液，使灌流液氧浓度突然降低(arterial oxygen concentration step, ACS)；或使约10%的灌流量突然减少(perfusion flow step, PFS)；ACS和PFS用于测定氧从心肌血管至线粒体内的运输时间(ttransport)。所有测量结果数字化储存在PC计算机中，作数据分析处理。详见Van Beek 等的报道[5, 6]。
三、心肌线粒体平均氧耗反应时间(the mean response time of myocardial mitochondrial oxygen consumption, tmito)
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当心率突然增加时，心肌内ATP水解即刻增加；继而线粒体的生物氧化水平增高，心肌氧耗也随之增加；已知心肌内90%的ATP来自线粒体的生物氧化过程，测定心脏静脉氧分压变化的时间过程，可得知心肌线粒体氧耗反应的适应速度，被定义为心肌线粒体平均氧耗反应时间(tmito)[6]。tmito可按公式 tmito=tv-ttransport得出。该公式数学上的精确定义和推导参见Van Beek[6]的报道。tv表示心率增快后的静脉氧分压变化反应时间，由置于肺动脉插管的氧电极测得的静脉氧分压变化以时间作定积分计算得出；ttransport表示氧从心肌血管至线粒体内的运输时间，可从ACS或PFS测得的静脉氧分压变化反应时间计算得出。
四、分组及实验步骤
由于离体兔心脏用37℃Tyrode液灌流超过120 min以上时，心肌收缩将明显降低，故将实验分为两组。Ⅰ组(n=6)：Tyrode液中分别加入11.1 mmol/L葡萄糖和11.1 mmol/L丙酮酸灌流心脏。Ⅱ组(n=6)：灌流液中分别加入11.1 mmol/L葡萄糖和11.1 mmol/L乳酸灌流心脏。实验过程时间表和碳源物灌流顺序见图1。约经30 min后，每种碳源物分别测定3个指标，即：①心率变化(heart rate step, HRS)时的静脉氧分压变化反应时间，由基础心率120次.min-1增加至140、160、190、220次.min-1，每次均返回至基础心率120次.min-1；②实施ACS和PFS，用于测定氧在心肌中的运输时间；③灌流白蛋白-伊文思蓝液(evans blue steps, EBS)，用于测定心肌血管的容量，以计算氧运输时间。 ②，③两项均在心率120 和220次.min-1分别予以测定。每次转换为第二种碳源物后，需经15 min平衡时间，使左心室压稳定后，表示心肌代谢达到稳定。
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Fig 1 Time table of the experimental protocol. Exision of the heart occurs at t=0
During each series of measurements several interventions (HRS, ACS,PFS and EBS, see method) were applied to determine tmito. Substrate concentration used was 11.1 mmol/L. Eq: equilibration period
图1 不同碳源物灌流心肌的时间顺序表
所有数据均以均数±标准差(±s)表示。采用双因素方差分析(two-way analysis of variance, ANOVA)和t检验进行差异显著性检验。
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结 果
一、一般情况
在实验结束后即刻测心脏的湿重为(12.0±0.4) g (n=12)，经48 h、 60℃脱水干燥后测得的心肌干重为(1.6±0.1) g。心肌灌流量为(7.4±0.4) mL.min-1.g-1 wet weight。两组间的心脏干、湿重及心肌灌流量无明显差异；各组实验前后的心肌灌流量无明显差异(t-test, P>0.05)。
二、左心室作功
3种碳源物的灌流过程中均出现左心室收缩压(left ventricular systolic pressure, LVSP)随心率的加快而逐渐下降(ANOVA，P<0.05)，结果见图2。各组内两种碳源物灌流时的LVSP无显著差异(P>0.05)。
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三、心肌耗氧量
心肌耗氧量随心率的增快明显增加(ANOVA， P<0.05)，但3种碳源物之间的心肌耗氧量无明显差异(P>0.05)，见图3。因分组实验，两组之间葡萄糖灌流时的心肌耗氧值有所变异，但无明显差异(P>0.05)。心肌耗氧量与心率-压力产物(rate-pressure product，RPP；RPP=心率×左心室最大收缩压)呈高度线性正相关，随RPP的增加心肌耗氧量明显增加，其相关系数(r)：Ⅰ组：葡萄糖灌流时为0.98±0.01(t-test，P<0.001)；丙酮酸灌流时为0.91±0.07(P<0.05)；Ⅱ组：葡萄糖灌流时为0.99±0.01(P<0.01)；乳酸灌流时为0.96±0.02(P<0.01)。
三、心肌线粒体平均氧耗反应时间(tmito)
tmito测定结果见图4。各组随不同心率变化时测得的tmito无显著差异，未出现随心率增加而延长的现象。在第Ⅰ组：测得灌流葡萄糖和丙酮酸时的平均tmito分别为(6.7±0.9) s和(5.1±0.5) s，tmito二者之间有明显差异(ANOVA，P<0.05)。丙酮酸灌流时的tmito明显快于葡萄糖灌流时的tmito。在第Ⅱ组：测得灌流葡萄糖和乳酸时的平均tmito分别为(6.3±0.7) s和(6.2±0.9) s，二者之间无显著差异。两组之间灌流葡萄糖时的tmito虽有变异，但无明显差异(P>0.05)。
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Fig 2 Left ventricular systolic pressure (LVSP) at various heart rate during perfusion with the different exogenous carbon substrate
Glucose data was from two different groups (see methods): Group Ⅰ as control for pyruvate and group Ⅱ as control for lactate (±s, n=6). # P<0.05, vs heart rate 120 beat.min-1 for both substrates
图2 不同心率和不同碳源物时的左心室收缩压
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Fig 3 Oxygen consumption as a function of heart rate for three exogenous carbon substrate sources
Glucose data was from two different groups (see Methods): Group Ⅰ as control for pyruvate and group Ⅱ as control for lactate (±s, n=6). # P<0.05, vs heart rate 120 beat.min-1 for both substrates
图3 不同心率和不同碳源物时的心肌耗氧量
讨 论
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实验中，当分别灌流葡萄糖和乳酸时，它们的tmito无明显差别；而灌流丙酮酸时测得的tmito比灌流葡萄糖时测得的tmito缩短约24%，提示氧化底物的类型对心肌氧化磷酸化过程的动态适应是有影响的。其机制可能为：其一，丙酮酸代谢与葡萄糖和乳酸代谢的主要差别是：葡萄糖需糖酵解、乳酸需转化为丙酮酸；而胞浆内糖酵解和乳酸转化过程中形成的NADH则需经苹果酸穿梭过程进入线粒体，向呼吸链提供还原当量(reducing equivalents)；而丙酮酸则可直接进入线粒体参与代谢，无需NADH由胞浆向线粒体内的穿梭转运。乳酸在依赖NAD+的乳酸脱氢酶参与下，转化为丙酮酸并生成NADH。如果胞浆内苹果酸穿梭系统转运NADH不是足够快的话，则葡萄糖或乳酸为碳源物时，可因胞浆内NADH的增加而抑制乳酸转为丙酮酸的过程，进而延缓心肌线粒体ATP合成的动态适应。Scholz等[7]报道在心肌作功稳态时灌流乳酸，心肌细胞内的丙酮酸含量较低，使丙酮酸脱氢酶磷酸酶活性降低，继而使丙酮酸脱氢酶活性降低，导致胞浆内还原当量生成相对缓慢，并延缓线粒体内的ATP合成反应。本实验中，心肌作功为动态适应过程，葡萄糖和乳酸作为碳源物时，可能有类似稳态时的情况，而使线粒体氧耗反应较慢。提示NADH由胞浆向线粒体内的转运可能是心肌ATP合成动态适应的限速因素。其二，有资料表明丙酮酸灌流心肌可增加线粒体内NAD+的还原[8]，使线粒体内NADH水平增高，线粒体的有氧代谢能力(mitochondrial aerobic capacity, MAC)增强；而tmito与MAC呈负相关[4, 6]。这可能是丙酮酸灌流心肌时的tmito比葡萄糖和乳酸灌流时的tmito缩短的另一因素。
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Fig 4 tmito of the different substrate infusion with various test heart rate steps
The basal heart rate was 120 teat.min-1. Glucose data was from two different groups (see methods): Group Ⅰ as control for pyruvate and group Ⅱ as control for lactate (±s, n=6 )
图4 不同心率和不同碳源物灌流时的心肌线粒体平均氧耗反应时间 (tmito)
本实验结果提示：在心肌细胞内ATP需求增加时，NADH向线粒体内的转运可能是心肌线粒体氧化磷酸化动态适应的一个重要的限速因素。心肌MAC也可能影响心肌氧化磷酸化的动态适应过程。
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(感谢荷兰阿姆斯特丹自由大学Prof. Dr. J.H.G.M. van Beek的热诚帮助)
[基金项目] 山西省出国留学基金；荷兰科学研究组织生命科学基金(grant 810-410-003)的部分资助
[参 考 文 献]
[1] Laughlin ME, Taylor J, Chesnick AS, et al. Pyruvate and lactate metabolism in the vivo dog heart [J]. Am J Physiol, 1993, 264:H2068～H2079.
[2] Katz A, Koretsky AP, Balaban RS. Activation of dehydrogenase activity and cardiac respiration: a [31P]-NMR study [J]. Am J Physiol, 1988, 255:H185～H188.
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[3] Katz A, Edlund A, Sahlin K. NADH content and lactate production in the perfused tabbity heart [J]. Acta Physiol Scand, 1987, 130:193～200.
[4] Meyer RA. A linear model of muscle respiration explains monexponential phosphocreatine changes [J]. Am J Physiol, 1988, 254:C548～C553.
[5] Eijgelshoven MH J, Hak JB, van Beek JHGM, et al. The adaptation speed of cardiac mitochondrial oxygen consumption decreases with higher heart rate [J]. Am J Physiol, 1993, 265:H1893～H1898.
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[6] Van Beek JHGM, Westerhoff N. Response time of cardiac mitochondrial oxygen consumption to heart rate steps [J]. Am J Physiol, 1991, 260:H613～H625.
[7] Scholz TD, Balaban RS. Mitochondrial F1-ATPase activity of canine myocardium: effects of hypoxia and stimulation [J]. Am J Physiol, 1994, 266:H2396～H2403.
[8] Mootha VK, Arai AE, Balaban RS. Maximum oxidative phosphorylation capacity of the mammalian heart [J]. Am J Physiol, 1997, 272:H769～H775.
[收稿日期] 1999-12-01 [修回日期] 2000-03-27, http://www.100md.com
单位：田新强(大同医学专科学校病理生理教研室，山西 大同 037008)
关键词：心肌；线粒体；氧化磷酸化；葡萄糖；乳酸；丙酮酸
中国病理生理杂志000804
[摘 要] 目的：了解外源性碳源物对心肌氧化磷酸化动态调节的影响。方法：采用Van Beek建立的心肌线粒体平均氧耗反应时间(tmito)测定方法，以葡萄糖、乳酸和丙酮酸分别为心肌供能的碳源物，用37℃的Tyrode液灌流离体兔心脏进行实验。结果：心率由120分别增至140和220(min-1)。测得的tmito：葡萄糖为(6.3±1.0) s和(7.4±0.9) s；乳酸为(5.4±1.2) s和(7.0±0.9) s；丙酮酸为(4.0±0.7) s和(6.5±0.6) s (tow-way ANOVA,P<0.05，与葡萄糖，乳酸比较)。结论：心肌线粒体氧化磷酸化在心肌ATP利用快速变化的动态适应过程中，还原当量向线粒体内的转运可能是动态适应的限速因素。
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[中图分类号] R331.3+1 [文献标识码] A
[文章编号] 1000-4718(2000)08-0685-05
The effect of glucose, lactate and pyruvate on the dynamic
adaptation of cardiac mitochondrial oxygen consumption
TIAN Xin-qiang
(Department of Pathophysiology, Datong Medical College, Datong 037008, China)
[Abstract] AIM: To understand the effect of exogenous carbon substrate on the dynamic regulation of cardiac oxidative phosphorylation. METHODS: Method of mean response time measurement of the myocardial mitochondrial O2 consumption (tmito) was developed by van Beek. Glucose, lactate, or pyruvate as carbon substrate respectively for myocardial energy supply was perfused in isolated rabbit hearts with Tyrode solution at 37℃. RESULTS: When heart rate was stepped up from 120 to 140 and 220 (beat.min-1) respectively the tmito. We have measured was: (6.3±1.0) s and (7.4±0.9) s for glucose; (5.4±1.2) s and (7.0±0.9) s for lactate; (4.0±0.7)s and (6.5±0.6) s for pyruvate (two way ANOVA, P<0.05, compared with lactate and glucose). CONCLUSION: The transport of reducing equivalent into the mitochondrial matrix might be a limitation factor of dynamic adaptation of cardiac mitochondrial oxidative phosphorylation during fast changes in ATP utilization.
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[MeSH] Myocardium; Mitochondria; Oxidative phosphorylation; Glucose; Lactates; Pyruvates
外源性碳源物的类型对作功处于稳定状态的心肌氧化磷酸化水平有明显的影响[1]。当葡萄糖为外源性碳源时，细胞内二磷酸腺苷(adenosine diphosphate, ADP)和无机磷酸(inorganic phosphate, Pi)的水平较高，而进入线粒体呼吸链的还原当量对氧化磷酸化起相当重要的限速控制作用[2]。当丙酮酸为外源性碳源物时，心肌细胞线粒体内还原型尼可酰胺腺嘌呤二核苷酸(reduced nicotinamide adenine dinucleotide, NADH)的水平增高[3]，而ADP水平较低。外源性碳源物对心肌线粒体氧化磷酸化动态适应的影响还知之甚少。在骨骼肌，当三磷酸腺苷(adenosine triphosphate, ATP)消耗增加时，其线粒体ATP合成的适应速度是恒定的[4]，氧化磷酸化的变化是由磷酸化合物代谢水平的变化所引起的。然而，用葡萄糖灌流离体兔心脏，在较大的心率变化时，心肌氧化磷酸化对ATP分解的适应速度降低[5]。假若其适应速度降低是由于葡萄糖为氧化底物时，心肌线粒体内的尼可酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide, NAD+)水平降低起了部分限速作用[5]。由此提出糖酵解或还原当量的转运是否是氧化磷酸化适应过程的限速因素。本研究采用Van Beek 建立的心肌线粒体平均氧耗反应时间测定方法[6]，试图了解不同外源性碳源物对心肌氧化磷酸化动态适应的影响。
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材 料 和 方 法
一、一般准备
新西兰兔(n=12)雌雄不限，体重(2.6±0.2) kg(
±s)，肌注氟丁酰酮(9.8±0.3) mg/kg和芬太尼(hypnorm; Janssen Pharmaceutica, Beerse, Belgium)(0.38±0.01) mg/kg麻醉动物，静注苯巴比妥钠10 mg/kg和肝素2 500 IU，开胸，取出心脏，按照Langendoff 方法灌流心脏。以37℃的Tyrode液作为灌流液，95% O2 和5% CO2 气体充分饱和。腺苷(Sigma, St. Louis, MO)10-5 mol/L作为冠脉血管舒张剂加入灌流液中以保证心肌最大的灌流量。以11.1 mmol/L的葡萄糖、乳酸和丙酮酸分别为心肌供能的碳源物质。离体心脏准备详见van Beek等的报道[5, 6]。, http://www.100md.com
二、灌流装置
采用恒流恒温灌流系统。两个Clark type氧电极分别置于心脏的主动脉和肺动脉插管测定灌流液氧分压。一灌流旁路装置可使约10%的灌流液转为由95% N2和5%CO2饱和的灌流液，使灌流液氧浓度突然降低(arterial oxygen concentration step, ACS)；或使约10%的灌流量突然减少(perfusion flow step, PFS)；ACS和PFS用于测定氧从心肌血管至线粒体内的运输时间(ttransport)。所有测量结果数字化储存在PC计算机中，作数据分析处理。详见Van Beek 等的报道[5, 6]。
三、心肌线粒体平均氧耗反应时间(the mean response time of myocardial mitochondrial oxygen consumption, tmito)
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当心率突然增加时，心肌内ATP水解即刻增加；继而线粒体的生物氧化水平增高，心肌氧耗也随之增加；已知心肌内90%的ATP来自线粒体的生物氧化过程，测定心脏静脉氧分压变化的时间过程，可得知心肌线粒体氧耗反应的适应速度，被定义为心肌线粒体平均氧耗反应时间(tmito)[6]。tmito可按公式 tmito=tv-ttransport得出。该公式数学上的精确定义和推导参见Van Beek[6]的报道。tv表示心率增快后的静脉氧分压变化反应时间，由置于肺动脉插管的氧电极测得的静脉氧分压变化以时间作定积分计算得出；ttransport表示氧从心肌血管至线粒体内的运输时间，可从ACS或PFS测得的静脉氧分压变化反应时间计算得出。
四、分组及实验步骤
由于离体兔心脏用37℃Tyrode液灌流超过120 min以上时，心肌收缩将明显降低，故将实验分为两组。Ⅰ组(n=6)：Tyrode液中分别加入11.1 mmol/L葡萄糖和11.1 mmol/L丙酮酸灌流心脏。Ⅱ组(n=6)：灌流液中分别加入11.1 mmol/L葡萄糖和11.1 mmol/L乳酸灌流心脏。实验过程时间表和碳源物灌流顺序见图1。约经30 min后，每种碳源物分别测定3个指标，即：①心率变化(heart rate step, HRS)时的静脉氧分压变化反应时间，由基础心率120次.min-1增加至140、160、190、220次.min-1，每次均返回至基础心率120次.min-1；②实施ACS和PFS，用于测定氧在心肌中的运输时间；③灌流白蛋白-伊文思蓝液(evans blue steps, EBS)，用于测定心肌血管的容量，以计算氧运输时间。 ②，③两项均在心率120 和220次.min-1分别予以测定。每次转换为第二种碳源物后，需经15 min平衡时间，使左心室压稳定后，表示心肌代谢达到稳定。
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Fig 1 Time table of the experimental protocol. Exision of the heart occurs at t=0
During each series of measurements several interventions (HRS, ACS,PFS and EBS, see method) were applied to determine tmito. Substrate concentration used was 11.1 mmol/L. Eq: equilibration period
图1 不同碳源物灌流心肌的时间顺序表
所有数据均以均数±标准差(
±s)表示。采用双因素方差分析(two-way analysis of variance, ANOVA)和t检验进行差异显著性检验。, 百拇医药
结 果
一、一般情况
在实验结束后即刻测心脏的湿重为(12.0±0.4) g (n=12)，经48 h、 60℃脱水干燥后测得的心肌干重为(1.6±0.1) g。心肌灌流量为(7.4±0.4) mL.min-1.g-1 wet weight。两组间的心脏干、湿重及心肌灌流量无明显差异；各组实验前后的心肌灌流量无明显差异(t-test, P>0.05)。
二、左心室作功
3种碳源物的灌流过程中均出现左心室收缩压(left ventricular systolic pressure, LVSP)随心率的加快而逐渐下降(ANOVA，P<0.05)，结果见图2。各组内两种碳源物灌流时的LVSP无显著差异(P>0.05)。
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三、心肌耗氧量
心肌耗氧量随心率的增快明显增加(ANOVA， P<0.05)，但3种碳源物之间的心肌耗氧量无明显差异(P>0.05)，见图3。因分组实验，两组之间葡萄糖灌流时的心肌耗氧值有所变异，但无明显差异(P>0.05)。心肌耗氧量与心率-压力产物(rate-pressure product，RPP；RPP=心率×左心室最大收缩压)呈高度线性正相关，随RPP的增加心肌耗氧量明显增加，其相关系数(r)：Ⅰ组：葡萄糖灌流时为0.98±0.01(t-test，P<0.001)；丙酮酸灌流时为0.91±0.07(P<0.05)；Ⅱ组：葡萄糖灌流时为0.99±0.01(P<0.01)；乳酸灌流时为0.96±0.02(P<0.01)。
三、心肌线粒体平均氧耗反应时间(tmito)
tmito测定结果见图4。各组随不同心率变化时测得的tmito无显著差异，未出现随心率增加而延长的现象。在第Ⅰ组：测得灌流葡萄糖和丙酮酸时的平均tmito分别为(6.7±0.9) s和(5.1±0.5) s，tmito二者之间有明显差异(ANOVA，P<0.05)。丙酮酸灌流时的tmito明显快于葡萄糖灌流时的tmito。在第Ⅱ组：测得灌流葡萄糖和乳酸时的平均tmito分别为(6.3±0.7) s和(6.2±0.9) s，二者之间无显著差异。两组之间灌流葡萄糖时的tmito虽有变异，但无明显差异(P>0.05)。
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Fig 2 Left ventricular systolic pressure (LVSP) at various heart rate during perfusion with the different exogenous carbon substrate
Glucose data was from two different groups (see methods): Group Ⅰ as control for pyruvate and group Ⅱ as control for lactate (
±s, n=6). # P<0.05, vs heart rate 120 beat.min-1 for both substrates图2 不同心率和不同碳源物时的左心室收缩压
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Fig 3 Oxygen consumption as a function of heart rate for three exogenous carbon substrate sources
Glucose data was from two different groups (see Methods): Group Ⅰ as control for pyruvate and group Ⅱ as control for lactate (
±s, n=6). # P<0.05, vs heart rate 120 beat.min-1 for both substrates图3 不同心率和不同碳源物时的心肌耗氧量
讨 论
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实验中，当分别灌流葡萄糖和乳酸时，它们的tmito无明显差别；而灌流丙酮酸时测得的tmito比灌流葡萄糖时测得的tmito缩短约24%，提示氧化底物的类型对心肌氧化磷酸化过程的动态适应是有影响的。其机制可能为：其一，丙酮酸代谢与葡萄糖和乳酸代谢的主要差别是：葡萄糖需糖酵解、乳酸需转化为丙酮酸；而胞浆内糖酵解和乳酸转化过程中形成的NADH则需经苹果酸穿梭过程进入线粒体，向呼吸链提供还原当量(reducing equivalents)；而丙酮酸则可直接进入线粒体参与代谢，无需NADH由胞浆向线粒体内的穿梭转运。乳酸在依赖NAD+的乳酸脱氢酶参与下，转化为丙酮酸并生成NADH。如果胞浆内苹果酸穿梭系统转运NADH不是足够快的话，则葡萄糖或乳酸为碳源物时，可因胞浆内NADH的增加而抑制乳酸转为丙酮酸的过程，进而延缓心肌线粒体ATP合成的动态适应。Scholz等[7]报道在心肌作功稳态时灌流乳酸，心肌细胞内的丙酮酸含量较低，使丙酮酸脱氢酶磷酸酶活性降低，继而使丙酮酸脱氢酶活性降低，导致胞浆内还原当量生成相对缓慢，并延缓线粒体内的ATP合成反应。本实验中，心肌作功为动态适应过程，葡萄糖和乳酸作为碳源物时，可能有类似稳态时的情况，而使线粒体氧耗反应较慢。提示NADH由胞浆向线粒体内的转运可能是心肌ATP合成动态适应的限速因素。其二，有资料表明丙酮酸灌流心肌可增加线粒体内NAD+的还原[8]，使线粒体内NADH水平增高，线粒体的有氧代谢能力(mitochondrial aerobic capacity, MAC)增强；而tmito与MAC呈负相关[4, 6]。这可能是丙酮酸灌流心肌时的tmito比葡萄糖和乳酸灌流时的tmito缩短的另一因素。
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Fig 4 tmito of the different substrate infusion with various test heart rate steps
The basal heart rate was 120 teat.min-1. Glucose data was from two different groups (see methods): Group Ⅰ as control for pyruvate and group Ⅱ as control for lactate (
±s, n=6 )图4 不同心率和不同碳源物灌流时的心肌线粒体平均氧耗反应时间 (tmito)
本实验结果提示：在心肌细胞内ATP需求增加时，NADH向线粒体内的转运可能是心肌线粒体氧化磷酸化动态适应的一个重要的限速因素。心肌MAC也可能影响心肌氧化磷酸化的动态适应过程。
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(感谢荷兰阿姆斯特丹自由大学Prof. Dr. J.H.G.M. van Beek的热诚帮助)
[基金项目] 山西省出国留学基金；荷兰科学研究组织生命科学基金(grant 810-410-003)的部分资助
[参 考 文 献]
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[收稿日期] 1999-12-01 [修回日期] 2000-03-27, http://www.100md.com