硫苷脂和烧伤后血清刺激大鼠中性粒细胞产生活性氧
作者：倪俊 于宝军 杨红莲 陈玉林 郇京宁 刘训龙
单位：倪俊(解放军85医院， 上海 200052)；于宝军(第二军医大学长海医院烧伤科)；杨红莲(第二军医大学长征医院外科)；陈玉林 郇京宁(第二军医大学长海医院烧伤科)；刘训龙(解放军85医院， 上海 200052)
关键词：烧伤；中性白细胞；氧；钙
中国病理生理杂志000822 [摘 要] 目的：研究L-选择素配体硫苷脂和烧伤后血清对大鼠中性粒细胞产生活性氧的影响。方法：分别用硫苷脂、烧伤后血清、烧伤后血清加硫苷脂刺激分离的大鼠中性粒细胞，用细胞色素C法测定细胞培养液中超氧阴离子浓度，用荧光物质东莨菪苷原测定细胞产生过氧化氢浓度，用荧光探针Fura-2/AM测定胞内游离钙浓度。结果：硫苷脂、烧伤后血清刺激后，细胞产生的超氧阴离子、过氧化氢和胞内钙离子浓度度均明显增加，烧伤后血清刺激后再用硫苷脂刺激，三者的浓度不再增加。结论：硫苷脂、烧伤后血清可能通过钙信号传导而使中性粒细胞产生活性氧增加，引起细胞的某些功能改变。
, http://www.100md.com
[中图分类号] R644.02 [文献标识码] A
[文章编号] 1000-4718(2000)08-0721-02
[MeSH] Burns; Neutrophils; Oxygen; Calcium
严重烧伤可导致全身炎症反应综合症的发生，白细胞粘附在全身炎症反应综合症的发生发展中起重要作用。粘附分子选择素介导白细胞粘附，同时它还是一信号分子[1]。选择素的生物学作用中是否有活性氧参与，烧伤后的情况又是怎样，目前尚不清楚。本研究利用分离的大鼠中性粒细胞，观察L-选择素配体硫苷脂和烧伤后血清对细胞培养液中活性氧产生和细胞内钙离子浓度的影响，以了解L-选择素在烧伤后中性粒细胞粘附中的作用。
材 料 和 方 法
一、中性粒细胞分离
, 百拇医药
用持续灌注法收集SD大鼠血细胞，即用30 mg/kg戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠后，仰卧位固定，经正中切口进胸，剪去部分前胸壁，充分暴露心脏，将IL冷PBS/EDTA(AMERSCO公司)灌洗液经左心室缓慢灌入，剪开右心室壁，使血液和灌洗液流出。收集胸腔中灌洗液，550 g离心10 min，去上清液。随后用淋巴细胞分离液(上海华精生物高科技有限公司)分离大鼠中性粒细胞，该法获得的细胞活力在97%以上(台盼蓝液法)，中性粒细胞约占88%[2]。分离的细胞保存在DMEM(Gibco公司)培养液中。
二、大鼠烧伤后6 h血清制备
SD大鼠用戊巴比妥钠(30 mg/kg ip)麻醉，背部去毛，用恒温水烫仪(第二军医大学长海医院烧伤中心研制)100℃水烫12 s，制成30% Ⅲ度烧伤模型。在烧伤后6 h取血分离血清，56℃水浴30 min灭活补体，冰冻储存，备用。
三、实验分组
, 百拇医药
实验分为5组：第1组，对照组，细胞不刺激；第2组，硫苷脂(400 μg/100 μL)刺激细胞；第3组，正常血清(100 μL)刺激细胞；第4组，烧伤后6 h血清(100 μL)刺激细胞；第5组，烧伤后6 h血清(100 μL)刺激细胞后，硫苷脂(400 μg/100 μL)再刺激细胞。
四、检测
用细胞色素C(Sigma公司)法测定细胞培养液中超氧阴离子浓度，细胞产生过氧化氢浓度检测用荧光物质东莨菪苷原(Sigma公司)测定[3]。细胞内钙离子浓度用荧光探针Fura-2/AM(Calbiochem公司)检测。
五、统计处理
结果用
±s表示，进行t检验。结 果
, 百拇医药
硫苷脂刺激后细胞产生超氧阴离子和过氧化氢浓度非常明显高于对照组(P<0.01)。正常血清对细胞无刺激作用。烧伤后6 h血清刺激后，细胞产生的超氧阴离子和过氧化氢浓度非常明显高于对照组(P<0.01)，但在此基础上再用硫苷脂刺激，产生的量不再增加，和单用烧伤后血清刺激组相比无明显差异(P>0.05，表1)。
细胞在硫苷脂刺激后胞内钙离子浓度明显高于对照组(P<0.01)。正常血清刺激不能使胞内钙离子浓度增加，用烧伤后6 h血清刺激，胞内钙离子浓度明显增加(P<0.01)。但烧伤后血清刺激后的细胞再用硫苷脂刺激，钙离子浓度不再明显增加(P>0.05，表1)。
表1 大鼠中性粒细胞产生的活性氧和胞内钙离子浓度
Tab 1 Alterations of the reactive oxygen and [Ca2+]i
, 百拇医药
in isolated rat neutrophils (n=5,±s) Group
O2(nmoles/1
×106 cells)
H2O2(nmoles/1
×106 cells)
[Ca2+]i
(nmol/L)
1
, 百拇医药
0.1±0.1
0.2±0.1
58.1±5.6
2
0.9±0.1* *
1.5±0.2* *
155.6±50.2* *
3
0.2±0.1
0.3±0.1
67.2±8.8
, 百拇医药
4
1.2±0.3* *△△
1.4±0.2* *△△
98.5±17.3* *△△
5
1.2±0.8* *
1.5±0.3
107.3±27.3* *
* * P<0.01, vs group 1; △△P<0.01, vs group 3讨 论
反应性氧族和反应性氮族通过其分布在细胞外的配体，在调节细胞反应中起重要作用，许多学者将其作为信号分子。它们可参与细胞因子、生长因子、激素的作用和分泌；离子转动；转录；神经调节和凋亡[4]。这可能与调节NF-κB、激活蛋白(AP)-1有关。信号分子H2O2即可通过ERK与JNK/SAPK两条途径来传导信号[5]。
, http://www.100md.com
L-选择素在血中性粒细胞、单核细胞、大多数T、B细胞及NK细胞的一亚群中有表达，它通过与分布在内皮细胞表面的配体结合，介导白细胞在血管内皮上的接触和滚动；通过与白细胞上配体结合，介导白细胞间粘附；并介导淋巴细胞归巢。L-选择素及配体PSG-1还能介导细胞的“内翻外”信号传导[1]。实验发现，硫苷脂使大鼠中性粒细胞产生的超氧阴离子、过氧化氢及胞内钙离子浓度明显增加。这提示，L-选择素交联能够诱导细胞内信号(包括钙离子释放)，最终导致细胞活性氧产生增加。
烧伤后血清中含有大量的炎症介质和细胞因子，如PGE2、LTB4、IL-2、TNF、C1q，它们对机体有刺激作用。烧伤后血清能激活细胞NADPH氧化酶，使超氧阴离子和过氧化氢产生增加，细胞内钙离子浓度也增加。烧伤后血清也能诱导细胞内信号，使活性氧产生增加。但烧伤后血清刺激后的PMN再用硫苷脂刺激，超氧阴离子、过氧化氢产量及胞内钙离子浓度均不再明显增加。这可能是烧伤后血清刺激后，PMN表面的L-选择素有脱落。这种脱落现象在激活或趋化因子如LPS、TNF-α、PMA刺激后均发生，其具体机理不清，可能会促进随后进行的中性粒细胞与内皮细胞紧密接触时的粘附[6]。烧伤后体内的中性粒细胞有无L-选择素脱落，烧伤后的中性粒细胞的信号传导是否有L-选择素参与，仍待进一步研究。
, 百拇医药
[基金项目] 上海市医学领先专业基金资助
[参 考 文 献]
[1] 倪 俊，陈玉林. 选择素与创伤脓毒症[J]. 国外医学创伤与外科基本问题分册， 1998， 19(3)： 133～136.
[2] 丁自强，李少华，吴中立. 血小板激活抑制因子介导过氧化氢引起的白细胞-内皮细胞粘附[J]. 第二军医大学学报， 1992， 13(2)： 106～110.
[3] Waddell TK, Tialkow L, Chan CK, et al. Potentiation of the oxidative burst of human neutrophil[J]. J Biol Chem, 1994, 269(28): 18485～18490.
[4] Lander HM. An essential role for free radicals and derived species in signal transduction[J]. FASEB J, 1997, 11(1): 118～124.
, http://www.100md.com
[5] Wang X, Martindale JL, Liu Y, et al. The cellular resonse to oxidative stress: influences of mitogenactivated protein kinase signalling pathways on cell survival[J]. Biochem J, 1998; 333(2): 291～300.
[6] Kansas GS. Selectin and their ligands: current and controversies[J]. Blood, 1996; 88(9): 3259～3287.
[收稿日期]2000-02-28 [修回日期]2000-05-08, 百拇医药
单位：倪俊(解放军85医院， 上海 200052)；于宝军(第二军医大学长海医院烧伤科)；杨红莲(第二军医大学长征医院外科)；陈玉林 郇京宁(第二军医大学长海医院烧伤科)；刘训龙(解放军85医院， 上海 200052)
关键词：烧伤；中性白细胞；氧；钙
中国病理生理杂志000822 [摘 要] 目的：研究L-选择素配体硫苷脂和烧伤后血清对大鼠中性粒细胞产生活性氧的影响。方法：分别用硫苷脂、烧伤后血清、烧伤后血清加硫苷脂刺激分离的大鼠中性粒细胞，用细胞色素C法测定细胞培养液中超氧阴离子浓度，用荧光物质东莨菪苷原测定细胞产生过氧化氢浓度，用荧光探针Fura-2/AM测定胞内游离钙浓度。结果：硫苷脂、烧伤后血清刺激后，细胞产生的超氧阴离子、过氧化氢和胞内钙离子浓度度均明显增加，烧伤后血清刺激后再用硫苷脂刺激，三者的浓度不再增加。结论：硫苷脂、烧伤后血清可能通过钙信号传导而使中性粒细胞产生活性氧增加，引起细胞的某些功能改变。
, http://www.100md.com
[中图分类号] R644.02 [文献标识码] A
[文章编号] 1000-4718(2000)08-0721-02
[MeSH] Burns; Neutrophils; Oxygen; Calcium
严重烧伤可导致全身炎症反应综合症的发生，白细胞粘附在全身炎症反应综合症的发生发展中起重要作用。粘附分子选择素介导白细胞粘附，同时它还是一信号分子[1]。选择素的生物学作用中是否有活性氧参与，烧伤后的情况又是怎样，目前尚不清楚。本研究利用分离的大鼠中性粒细胞，观察L-选择素配体硫苷脂和烧伤后血清对细胞培养液中活性氧产生和细胞内钙离子浓度的影响，以了解L-选择素在烧伤后中性粒细胞粘附中的作用。
材 料 和 方 法
一、中性粒细胞分离
, 百拇医药
用持续灌注法收集SD大鼠血细胞，即用30 mg/kg戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠后，仰卧位固定，经正中切口进胸，剪去部分前胸壁，充分暴露心脏，将IL冷PBS/EDTA(AMERSCO公司)灌洗液经左心室缓慢灌入，剪开右心室壁，使血液和灌洗液流出。收集胸腔中灌洗液，550 g离心10 min，去上清液。随后用淋巴细胞分离液(上海华精生物高科技有限公司)分离大鼠中性粒细胞，该法获得的细胞活力在97%以上(台盼蓝液法)，中性粒细胞约占88%[2]。分离的细胞保存在DMEM(Gibco公司)培养液中。
二、大鼠烧伤后6 h血清制备
SD大鼠用戊巴比妥钠(30 mg/kg ip)麻醉，背部去毛，用恒温水烫仪(第二军医大学长海医院烧伤中心研制)100℃水烫12 s，制成30% Ⅲ度烧伤模型。在烧伤后6 h取血分离血清，56℃水浴30 min灭活补体，冰冻储存，备用。
三、实验分组
, 百拇医药
实验分为5组：第1组，对照组，细胞不刺激；第2组，硫苷脂(400 μg/100 μL)刺激细胞；第3组，正常血清(100 μL)刺激细胞；第4组，烧伤后6 h血清(100 μL)刺激细胞；第5组，烧伤后6 h血清(100 μL)刺激细胞后，硫苷脂(400 μg/100 μL)再刺激细胞。
四、检测
用细胞色素C(Sigma公司)法测定细胞培养液中超氧阴离子浓度，细胞产生过氧化氢浓度检测用荧光物质东莨菪苷原(Sigma公司)测定[3]。细胞内钙离子浓度用荧光探针Fura-2/AM(Calbiochem公司)检测。
五、统计处理
结果用
±s表示，进行t检验。结 果, 百拇医药
硫苷脂刺激后细胞产生超氧阴离子和过氧化氢浓度非常明显高于对照组(P<0.01)。正常血清对细胞无刺激作用。烧伤后6 h血清刺激后，细胞产生的超氧阴离子和过氧化氢浓度非常明显高于对照组(P<0.01)，但在此基础上再用硫苷脂刺激，产生的量不再增加，和单用烧伤后血清刺激组相比无明显差异(P>0.05，表1)。
细胞在硫苷脂刺激后胞内钙离子浓度明显高于对照组(P<0.01)。正常血清刺激不能使胞内钙离子浓度增加，用烧伤后6 h血清刺激，胞内钙离子浓度明显增加(P<0.01)。但烧伤后血清刺激后的细胞再用硫苷脂刺激，钙离子浓度不再明显增加(P>0.05，表1)。
表1 大鼠中性粒细胞产生的活性氧和胞内钙离子浓度
Tab 1 Alterations of the reactive oxygen and [Ca2+]i
, 百拇医药
in isolated rat neutrophils (n=5,
±s) GroupO2(nmoles/1
×106 cells)
H2O2(nmoles/1
×106 cells)
[Ca2+]i
(nmol/L)
1
, 百拇医药
0.1±0.1
0.2±0.1
58.1±5.6
2
0.9±0.1* *
1.5±0.2* *
155.6±50.2* *
3
0.2±0.1
0.3±0.1
67.2±8.8
, 百拇医药
4
1.2±0.3* *△△
1.4±0.2* *△△
98.5±17.3* *△△
5
1.2±0.8* *
1.5±0.3
107.3±27.3* *
* * P<0.01, vs group 1; △△P<0.01, vs group 3讨 论
反应性氧族和反应性氮族通过其分布在细胞外的配体，在调节细胞反应中起重要作用，许多学者将其作为信号分子。它们可参与细胞因子、生长因子、激素的作用和分泌；离子转动；转录；神经调节和凋亡[4]。这可能与调节NF-κB、激活蛋白(AP)-1有关。信号分子H2O2即可通过ERK与JNK/SAPK两条途径来传导信号[5]。
, http://www.100md.com
L-选择素在血中性粒细胞、单核细胞、大多数T、B细胞及NK细胞的一亚群中有表达，它通过与分布在内皮细胞表面的配体结合，介导白细胞在血管内皮上的接触和滚动；通过与白细胞上配体结合，介导白细胞间粘附；并介导淋巴细胞归巢。L-选择素及配体PSG-1还能介导细胞的“内翻外”信号传导[1]。实验发现，硫苷脂使大鼠中性粒细胞产生的超氧阴离子、过氧化氢及胞内钙离子浓度明显增加。这提示，L-选择素交联能够诱导细胞内信号(包括钙离子释放)，最终导致细胞活性氧产生增加。
烧伤后血清中含有大量的炎症介质和细胞因子，如PGE2、LTB4、IL-2、TNF、C1q，它们对机体有刺激作用。烧伤后血清能激活细胞NADPH氧化酶，使超氧阴离子和过氧化氢产生增加，细胞内钙离子浓度也增加。烧伤后血清也能诱导细胞内信号，使活性氧产生增加。但烧伤后血清刺激后的PMN再用硫苷脂刺激，超氧阴离子、过氧化氢产量及胞内钙离子浓度均不再明显增加。这可能是烧伤后血清刺激后，PMN表面的L-选择素有脱落。这种脱落现象在激活或趋化因子如LPS、TNF-α、PMA刺激后均发生，其具体机理不清，可能会促进随后进行的中性粒细胞与内皮细胞紧密接触时的粘附[6]。烧伤后体内的中性粒细胞有无L-选择素脱落，烧伤后的中性粒细胞的信号传导是否有L-选择素参与，仍待进一步研究。
, 百拇医药
[基金项目] 上海市医学领先专业基金资助
[参 考 文 献]
[1] 倪 俊，陈玉林. 选择素与创伤脓毒症[J]. 国外医学创伤与外科基本问题分册， 1998， 19(3)： 133～136.
[2] 丁自强，李少华，吴中立. 血小板激活抑制因子介导过氧化氢引起的白细胞-内皮细胞粘附[J]. 第二军医大学学报， 1992， 13(2)： 106～110.
[3] Waddell TK, Tialkow L, Chan CK, et al. Potentiation of the oxidative burst of human neutrophil[J]. J Biol Chem, 1994, 269(28): 18485～18490.
[4] Lander HM. An essential role for free radicals and derived species in signal transduction[J]. FASEB J, 1997, 11(1): 118～124.
, http://www.100md.com
[5] Wang X, Martindale JL, Liu Y, et al. The cellular resonse to oxidative stress: influences of mitogenactivated protein kinase signalling pathways on cell survival[J]. Biochem J, 1998; 333(2): 291～300.
[6] Kansas GS. Selectin and their ligands: current and controversies[J]. Blood, 1996; 88(9): 3259～3287.
[收稿日期]2000-02-28 [修回日期]2000-05-08, 百拇医药