异丙肾上腺素舒血管作用机制的在体实验研究
作者：李洁 徐标 何家声
单位：(南京铁道医学院附院心内科，江苏 南京 210009)
关键词：受体，肾上腺素能β；一氧化氮；股动脉；血管舒张
中国病理生理杂志000919
[摘 要] 目的：研究NOS(一氧化氮合酶)抑制剂对异丙肾上腺素(isoprenaline)产生的血管舒张作用的影响及涉及的β-肾上腺素能受体(β-AR)亚型，探讨NO是否作为β-AR激动后信号转导过程中的信使物质参与β-AR激动产生的血管舒张。方法：利用家兔股动脉恒流灌注模型。结果：(1)Isoprenaline产生浓度依赖的血管舒张。(2)NOS抑制剂L-NAME阻断了isoprenaline产生的血管舒张作用。(3)β1-AR阻滞剂CGP 20712 A不能阻断isoprenaline产生的外围血管舒张作用，但β2-AR阻滞剂ICI 118551能阻断isoprenaline产生的外周血管舒张作用。结论：Isoprenaline引起兔股动脉舒张通过激活NOS介导，涉及的β受体亚型为β2受体。
, 百拇医药
[中图分类号] R961 [文献标识码] A
[文章编号] 1000-4718(2000)09-0842-03
Study on the relationship between β-adrenoceptor and
L-arginine/NO pathway in vivo
LI Jie, XU Biao, HE Jia-sheng
(Division of Cardiology, Nanjing Railway Medical College, Nanjing 210009, China)
[Abstract] AIM and METHODS: A constant perfusion model of rabbit femoral artery was used to examine whether vasodilation induced by β-adrenoceptor(β-AR) stimulation is dependent on NOS activiation in vivo and which subtype(s) of β-AR is/are responsible for NOS activiation in order to ascertain the role of NO in vasodilation induced by β-AR stimulation. RESULTS: Isoprenaline elicited a concentration-dependent vasodilation of rabbit femoral artery, co-infusing NOS inhibitor L-NAME or β2-AR antagonist ICI 118551 abolished the vasodilation by Isoprenaline, but β1-AR antagonist CGP 20712A had no effect on vasodilation of rabbit femoral arterg induced by isoprenaline. CONCLUSION: Isoprenaline-induced vasodilation in this femoral vascular bed is mediated through activiation of NOS and only β2-AR is responsible for this sort of vasodilation.
, 百拇医药
[MeSH] Receptors, adrenergic beta; Nitric oxide; Femoral artery; Vasodilation
β-肾上腺素能受体在体内分布广泛，介导一系列重要的生理、生化过程。异丙肾上腺素(isoprenaline)为非选择性β-AR兴奋剂，能引起外周血管舒张，但其机制仍不完全清楚。一些研究认为这是isoprenaline直接作用于平滑肌细胞β-AR受体，激动腺苷酸环化酶(adenylcyclase, AC)的结果。NO是重要的生物信使分子和效应分子，离体研究表明，NO参与了β-AR的信号转导过程[1-4]，但β-AR兴奋激活NOS的机制尚不清楚，有关这方面的在体研究还很少，本文旨在通过在体动物实验模型，进一步验证β-AR兴奋引起的血管舒张是否与NO有关，以及累及的β受体亚型。
材 料 和 方 法
一、主要试剂
, 百拇医药
Isoprenaline、L-NAME(Sigma)、ICI 118551(Zeneca)，CGP 20712 A(Ciba-Geigy )，所有实验药物用生理盐水溶解，实验当天配制，置4℃冰箱保存。
二、实验动物分组和处理
健康青紫蓝兔，16只，体重(2.13±0.19)kg，雌雄不限，由本院动物中心提供。家兔股动脉恒流灌注模型的建立：家兔1.0 g*kg-1乌拉坦耳缘静脉注射麻醉。固定四肢，在腹股沟动脉搏动明显处切开皮肤，逐层分离至股动脉鞘，分离一侧股动脉，剪断伴行神经。用10 000 U*L-1肝素生理盐水反复冲洗蠕动泵的胶管，用量筒校正每分灌流量。给予家兔iv肝素700 U*kg-1，股动脉近心端插入1内径为1.5 mm的导管，与蠕动泵的输入管相连，中间连接一个三通管，作为药物注射用。股动脉远心端插入同1内径的另一个导管，与蠕动泵的输出端相连，中间连一个三通管，连接压力换能器，监测灌注压。启动蠕动泵，调节灌流量与体循环血压一致。股动脉缺血时间要求<5 min，灌流30 min待灌注压平稳后开始如下实验。
, 百拇医药
按2.5×10-16、2.5×10-15、2.5×10-14、2.5×10-13、2.5×10-12、2.5×10-11mol*kg-1(注射容量0.5 mL)依次股动脉内注入isoprenaline，注射时间为2 s，间隔时间为1 min，灌注过程连续监测灌注压，建立isoprenaline引起血管舒张的浓度-反应曲线。待血压稳定恢复到灌注前水平后用NOS抑制剂L-NAME (10-3 mol*L-1) 1 mL股动脉内缓慢注射，15 min后再重复给予上述剂量组isoprenaline，再次构建isoprenaline引起血管舒张的作用曲线。在另一组实验中，建立了isoprenaline的浓度-反应曲线后，随机使用β1-AR阻滞剂CGP 20712A (3×10-6 mol*L-1) 1 mL或β2-AR阻滞剂ICI 118551 (10-6 mol*L-1) 1 mL股动脉内缓慢注射，15 min后重复给予上述剂量组isoprenaline，构建isoprenaline引起血管舒张的浓度-反应曲线。对照组为建立isoprenaline的浓度-反应曲线，待血压稳定恢复到灌注前水平后用1 mL的生理盐水股动脉内缓慢注射，15 min后再次构建isoprenaline引起血管舒张的作用曲线。
, http://www.100md.com
三、数据处理
所有数据均用
±s表示，isoprenaline的量效关系曲线用One-Way ANOVA检验(Prism统计软件)。
结 果
Isoprenaline产生浓度依赖的外周血管舒张，L-NAME灌注后isoprenaline产生的外周血管舒张作用消失。CGP 20712A不影响isoprenalin产生的外周血管舒张作用：ICI 118551完全阻断isoprenaline产生的外周血管舒张。
表1 NOS抑制剂及β-AR阻滞剂对isoprenaline舒血管作用的影响
Tab 1 Changes of vasorelaxation by isoprenaline in rabbit femoral vascular bed(±s. n=6) Blocker
, http://www.100md.com
Emax(-%)
EC50(lg mol*kg-1)
Before blockade
After blockade
Before blockade
After blockade
L-NAME
-33.46±1.366
-2.741±0.4224* *
-12.51±0.1027
, 百拇医药
-12.47±0.4251*
ICI 118551
-35.42±1.133
-0.7611±0.2927* *
-12.53±0.0842
-12.29±0.8667*
CGP 20712A
-34.11±1.467
-33.23±1.4070*
-12.54±0.1154
, 百拇医药
-12.66±0.1136*
Control
-34.53±1.675
-32.19±1.2550*
-11.98±0.1347
-12.05±0.5131*
* P>0.05，** P<0.01 vs before blockade.讨 论
Isoprenaline为非选择性的β-AR激动剂，能产生外周血管扩张作用，既往的研究认为这种作用是通过激动平滑肌细胞上的β受体介导的。研究表明，人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelicyte, HUVEC)可表达β-AR，同isoprenaline孵育后可使NOS表达增加[1，2]。离体研究还发现，去除内皮及抑制NOS后isoprenalin产生的家兔主动脉环舒张作用消失，提示内皮和NO参与了isoprenalin激动产生的血管舒张，NO可能为β-AR激动后信号转导过程中的一信使[3，4]。但在体研究中还未见类似的报告。
, http://www.100md.com
本研究根据压力∞流量×阻力的原理，建立股动脉恒流灌注模型，在实验过程中保持灌流量恒定，根据灌注压的变化来直接反应周围血管阻力的变化。发现L-NAME能阻断isoprenaline产生的兔股动脉血管舒张，β1-AR阻滞剂CGP 20712A不能阻断Isoprenaline产生的兔股动脉血管舒张，但β2-AR阻滞剂ICI 118551能阻断isoprenaline产生的兔股动脉血管舒张，这说明isoprenaline引起的周围血管舒张主要与β2有关，而与β1无明显关系。证实了β2-AR兴奋引起的周围血管舒张与L-Arg/NO通路的密切关系。
至今，β-AR兴奋激活NOS的机制尚不清楚。研究表明，激动HUVEC上的β-AR可增加NOS活性，且这种增强与cAMP增加成正比，给予细胞渗透性cAMP(db cAMP)同样能引起HUVEC的NOS活性增加，提示β受体激动通过激活AC使cAMP增加，从而激活NOS，但这种NOS激活不伴有细胞内[Ca2+]的增加，这一过程不同于乙酰胆碱或组胺激活NOS需要通过细胞内[Ca2+]增加来介导[5]。同时，Cadillo等报道高血压患者乙酰胆碱(ACh)内皮依赖的周围血管舒张功能下降，但依赖isoprenaline的周围血管舒张功能正常，进一步证实了isoprenaline和ACh激活NOS是两条不同的信号转导途径[6]。
, http://www.100md.com
Iso-AR复合物偶联G蛋白，进而激活腺苷酸环化酶使ATP形成cAMP。Oddis等发现cAMP可促进NOS mRNA的稳定性，冠脉扩张药双嘧达莫(dipgyridamole)可通过增加大鼠平滑肌细胞内的cAMP促进IL-1β诱导的NO生成[7]。
许多研究发现心力衰竭时心肌和淋巴细胞β受体密度降低，β受体对激动剂敏感性下降，而且发现，在动物和人发生心力衰竭后冠状动脉和其他周围血管内皮依赖性舒张常受损及NO生成减少[8]，且这种NO生成减少不是由于底物L-精氨酸缺乏所致，可能起源于NOS mRNA和环氧化酶mRNA表达的下降，两者分别下降51%和64%，相应的蛋白质产生也减少，导致NO产生减少[9]。既然我们研究已发现血管内皮细胞表达β-AR，心力衰竭时外周血管内皮依赖性舒张常受损，我们推测心衰时AR的减敏和下调可能通过β-AR-cAMP通路导致NO合成减少，这可能是心衰时高血管阻力的原因之一，这还需进一步验证。
, http://www.100md.com
[参 考 文 献]
[1] Howell RE, Albeda SM, Daise ML, et al. Characterization of β adrenergic receptors in cultured human and bovine endothelial cells[J]. J Appl Physiol, 1998, 65:1251-1257.
[2] Molenar P, Malta E, Jones CR, et al. Autoradiographic localization and function of adrenoceptors on the human internal mammary artery and saphenous vein[J]. Br J pharmacol, 1998, 95:225-233.
[3] Xu B, Queen LR, Ferro A. β-Adrenoceptor-mediated vasorelaxation is largely mediated through the L-argine/nitric oxide system in human umbilical vein[J]. J Physiol, 1998, 506:30-31.
, 百拇医药
[4] Graves J, Poston L. β-Adrenoceptor agonist mediated relaxation of rat isoprenalinelated resistance arteries: a role for the endothelium and nitric oxide[J]. Br J Pharmacol, 1993, 108:631-637.
[5] Gray DW, Marshall L. Novel signal transduction pathway mediating endothelium-dependent β-Adrenoceptor vasorelaxation in rat thoracic aorta[J]. Br J Pharmacol, 1992, 107:684-690.
[6] Cardillo C, Kilcoyne CM, Quyyumi AA, et al. Selective defect in nitric oxide synthesis may explain the impaired endothelium-dependent vasodilation in patients with essentail hypertention[J]. Circulation, 1998, 97:851.
, 百拇医药
[7] Masters BSS. Nitric oxide synthase:why so complex?[J]. Annu Rev Nutr, 1994, 14:131-145.
[8] Drexler H, Hayoz D, Munzel T, et al. Endothelial function in chronic congestion heart failure[J]. Am J Cardiol, 1992, 69:1596-1601.
[9] Smith CJ, Sun, D, Hoegler C, et al. Reduced gene expression of vascular endothelial NO synthase and cyclooxgenase-1 in heart failure[J]. Circ Res, 1996, 78:58-64.
[收稿日期]1999-06-17 [修回日期]1999-10-13, 百拇医药
单位：(南京铁道医学院附院心内科，江苏 南京 210009)
关键词：受体，肾上腺素能β；一氧化氮；股动脉；血管舒张
中国病理生理杂志000919
[摘 要] 目的：研究NOS(一氧化氮合酶)抑制剂对异丙肾上腺素(isoprenaline)产生的血管舒张作用的影响及涉及的β-肾上腺素能受体(β-AR)亚型，探讨NO是否作为β-AR激动后信号转导过程中的信使物质参与β-AR激动产生的血管舒张。方法：利用家兔股动脉恒流灌注模型。结果：(1)Isoprenaline产生浓度依赖的血管舒张。(2)NOS抑制剂L-NAME阻断了isoprenaline产生的血管舒张作用。(3)β1-AR阻滞剂CGP 20712 A不能阻断isoprenaline产生的外围血管舒张作用，但β2-AR阻滞剂ICI 118551能阻断isoprenaline产生的外周血管舒张作用。结论：Isoprenaline引起兔股动脉舒张通过激活NOS介导，涉及的β受体亚型为β2受体。
, 百拇医药
[中图分类号] R961 [文献标识码] A
[文章编号] 1000-4718(2000)09-0842-03
Study on the relationship between β-adrenoceptor and
L-arginine/NO pathway in vivo
LI Jie, XU Biao, HE Jia-sheng
(Division of Cardiology, Nanjing Railway Medical College, Nanjing 210009, China)
[Abstract] AIM and METHODS: A constant perfusion model of rabbit femoral artery was used to examine whether vasodilation induced by β-adrenoceptor(β-AR) stimulation is dependent on NOS activiation in vivo and which subtype(s) of β-AR is/are responsible for NOS activiation in order to ascertain the role of NO in vasodilation induced by β-AR stimulation. RESULTS: Isoprenaline elicited a concentration-dependent vasodilation of rabbit femoral artery, co-infusing NOS inhibitor L-NAME or β2-AR antagonist ICI 118551 abolished the vasodilation by Isoprenaline, but β1-AR antagonist CGP 20712A had no effect on vasodilation of rabbit femoral arterg induced by isoprenaline. CONCLUSION: Isoprenaline-induced vasodilation in this femoral vascular bed is mediated through activiation of NOS and only β2-AR is responsible for this sort of vasodilation.
, 百拇医药
[MeSH] Receptors, adrenergic beta; Nitric oxide; Femoral artery; Vasodilation
β-肾上腺素能受体在体内分布广泛，介导一系列重要的生理、生化过程。异丙肾上腺素(isoprenaline)为非选择性β-AR兴奋剂，能引起外周血管舒张，但其机制仍不完全清楚。一些研究认为这是isoprenaline直接作用于平滑肌细胞β-AR受体，激动腺苷酸环化酶(adenylcyclase, AC)的结果。NO是重要的生物信使分子和效应分子，离体研究表明，NO参与了β-AR的信号转导过程[1-4]，但β-AR兴奋激活NOS的机制尚不清楚，有关这方面的在体研究还很少，本文旨在通过在体动物实验模型，进一步验证β-AR兴奋引起的血管舒张是否与NO有关，以及累及的β受体亚型。
材 料 和 方 法
一、主要试剂
, 百拇医药
Isoprenaline、L-NAME(Sigma)、ICI 118551(Zeneca)，CGP 20712 A(Ciba-Geigy )，所有实验药物用生理盐水溶解，实验当天配制，置4℃冰箱保存。
二、实验动物分组和处理
健康青紫蓝兔，16只，体重(2.13±0.19)kg，雌雄不限，由本院动物中心提供。家兔股动脉恒流灌注模型的建立：家兔1.0 g*kg-1乌拉坦耳缘静脉注射麻醉。固定四肢，在腹股沟动脉搏动明显处切开皮肤，逐层分离至股动脉鞘，分离一侧股动脉，剪断伴行神经。用10 000 U*L-1肝素生理盐水反复冲洗蠕动泵的胶管，用量筒校正每分灌流量。给予家兔iv肝素700 U*kg-1，股动脉近心端插入1内径为1.5 mm的导管，与蠕动泵的输入管相连，中间连接一个三通管，作为药物注射用。股动脉远心端插入同1内径的另一个导管，与蠕动泵的输出端相连，中间连一个三通管，连接压力换能器，监测灌注压。启动蠕动泵，调节灌流量与体循环血压一致。股动脉缺血时间要求<5 min，灌流30 min待灌注压平稳后开始如下实验。
, 百拇医药
按2.5×10-16、2.5×10-15、2.5×10-14、2.5×10-13、2.5×10-12、2.5×10-11mol*kg-1(注射容量0.5 mL)依次股动脉内注入isoprenaline，注射时间为2 s，间隔时间为1 min，灌注过程连续监测灌注压，建立isoprenaline引起血管舒张的浓度-反应曲线。待血压稳定恢复到灌注前水平后用NOS抑制剂L-NAME (10-3 mol*L-1) 1 mL股动脉内缓慢注射，15 min后再重复给予上述剂量组isoprenaline，再次构建isoprenaline引起血管舒张的作用曲线。在另一组实验中，建立了isoprenaline的浓度-反应曲线后，随机使用β1-AR阻滞剂CGP 20712A (3×10-6 mol*L-1) 1 mL或β2-AR阻滞剂ICI 118551 (10-6 mol*L-1) 1 mL股动脉内缓慢注射，15 min后重复给予上述剂量组isoprenaline，构建isoprenaline引起血管舒张的浓度-反应曲线。对照组为建立isoprenaline的浓度-反应曲线，待血压稳定恢复到灌注前水平后用1 mL的生理盐水股动脉内缓慢注射，15 min后再次构建isoprenaline引起血管舒张的作用曲线。
, http://www.100md.com
三、数据处理
所有数据均用
±s表示，isoprenaline的量效关系曲线用One-Way ANOVA检验(Prism统计软件)。结 果
Isoprenaline产生浓度依赖的外周血管舒张，L-NAME灌注后isoprenaline产生的外周血管舒张作用消失。CGP 20712A不影响isoprenalin产生的外周血管舒张作用：ICI 118551完全阻断isoprenaline产生的外周血管舒张。
表1 NOS抑制剂及β-AR阻滞剂对isoprenaline舒血管作用的影响
Tab 1 Changes of vasorelaxation by isoprenaline in rabbit femoral vascular bed(
±s. n=6) Blocker, http://www.100md.com
Emax(-%)
EC50(lg mol*kg-1)
Before blockade
After blockade
Before blockade
After blockade
L-NAME
-33.46±1.366
-2.741±0.4224* *
-12.51±0.1027
, 百拇医药
-12.47±0.4251*
ICI 118551
-35.42±1.133
-0.7611±0.2927* *
-12.53±0.0842
-12.29±0.8667*
CGP 20712A
-34.11±1.467
-33.23±1.4070*
-12.54±0.1154
, 百拇医药
-12.66±0.1136*
Control
-34.53±1.675
-32.19±1.2550*
-11.98±0.1347
-12.05±0.5131*
* P>0.05，** P<0.01 vs before blockade.讨 论
Isoprenaline为非选择性的β-AR激动剂，能产生外周血管扩张作用，既往的研究认为这种作用是通过激动平滑肌细胞上的β受体介导的。研究表明，人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelicyte, HUVEC)可表达β-AR，同isoprenaline孵育后可使NOS表达增加[1，2]。离体研究还发现，去除内皮及抑制NOS后isoprenalin产生的家兔主动脉环舒张作用消失，提示内皮和NO参与了isoprenalin激动产生的血管舒张，NO可能为β-AR激动后信号转导过程中的一信使[3，4]。但在体研究中还未见类似的报告。
, http://www.100md.com
本研究根据压力∞流量×阻力的原理，建立股动脉恒流灌注模型，在实验过程中保持灌流量恒定，根据灌注压的变化来直接反应周围血管阻力的变化。发现L-NAME能阻断isoprenaline产生的兔股动脉血管舒张，β1-AR阻滞剂CGP 20712A不能阻断Isoprenaline产生的兔股动脉血管舒张，但β2-AR阻滞剂ICI 118551能阻断isoprenaline产生的兔股动脉血管舒张，这说明isoprenaline引起的周围血管舒张主要与β2有关，而与β1无明显关系。证实了β2-AR兴奋引起的周围血管舒张与L-Arg/NO通路的密切关系。
至今，β-AR兴奋激活NOS的机制尚不清楚。研究表明，激动HUVEC上的β-AR可增加NOS活性，且这种增强与cAMP增加成正比，给予细胞渗透性cAMP(db cAMP)同样能引起HUVEC的NOS活性增加，提示β受体激动通过激活AC使cAMP增加，从而激活NOS，但这种NOS激活不伴有细胞内[Ca2+]的增加，这一过程不同于乙酰胆碱或组胺激活NOS需要通过细胞内[Ca2+]增加来介导[5]。同时，Cadillo等报道高血压患者乙酰胆碱(ACh)内皮依赖的周围血管舒张功能下降，但依赖isoprenaline的周围血管舒张功能正常，进一步证实了isoprenaline和ACh激活NOS是两条不同的信号转导途径[6]。
, http://www.100md.com
Iso-AR复合物偶联G蛋白，进而激活腺苷酸环化酶使ATP形成cAMP。Oddis等发现cAMP可促进NOS mRNA的稳定性，冠脉扩张药双嘧达莫(dipgyridamole)可通过增加大鼠平滑肌细胞内的cAMP促进IL-1β诱导的NO生成[7]。
许多研究发现心力衰竭时心肌和淋巴细胞β受体密度降低，β受体对激动剂敏感性下降，而且发现，在动物和人发生心力衰竭后冠状动脉和其他周围血管内皮依赖性舒张常受损及NO生成减少[8]，且这种NO生成减少不是由于底物L-精氨酸缺乏所致，可能起源于NOS mRNA和环氧化酶mRNA表达的下降，两者分别下降51%和64%，相应的蛋白质产生也减少，导致NO产生减少[9]。既然我们研究已发现血管内皮细胞表达β-AR，心力衰竭时外周血管内皮依赖性舒张常受损，我们推测心衰时AR的减敏和下调可能通过β-AR-cAMP通路导致NO合成减少，这可能是心衰时高血管阻力的原因之一，这还需进一步验证。
, http://www.100md.com
[参 考 文 献]
[1] Howell RE, Albeda SM, Daise ML, et al. Characterization of β adrenergic receptors in cultured human and bovine endothelial cells[J]. J Appl Physiol, 1998, 65:1251-1257.
[2] Molenar P, Malta E, Jones CR, et al. Autoradiographic localization and function of adrenoceptors on the human internal mammary artery and saphenous vein[J]. Br J pharmacol, 1998, 95:225-233.
[3] Xu B, Queen LR, Ferro A. β-Adrenoceptor-mediated vasorelaxation is largely mediated through the L-argine/nitric oxide system in human umbilical vein[J]. J Physiol, 1998, 506:30-31.
, 百拇医药
[4] Graves J, Poston L. β-Adrenoceptor agonist mediated relaxation of rat isoprenalinelated resistance arteries: a role for the endothelium and nitric oxide[J]. Br J Pharmacol, 1993, 108:631-637.
[5] Gray DW, Marshall L. Novel signal transduction pathway mediating endothelium-dependent β-Adrenoceptor vasorelaxation in rat thoracic aorta[J]. Br J Pharmacol, 1992, 107:684-690.
[6] Cardillo C, Kilcoyne CM, Quyyumi AA, et al. Selective defect in nitric oxide synthesis may explain the impaired endothelium-dependent vasodilation in patients with essentail hypertention[J]. Circulation, 1998, 97:851.
, 百拇医药
[7] Masters BSS. Nitric oxide synthase:why so complex?[J]. Annu Rev Nutr, 1994, 14:131-145.
[8] Drexler H, Hayoz D, Munzel T, et al. Endothelial function in chronic congestion heart failure[J]. Am J Cardiol, 1992, 69:1596-1601.
[9] Smith CJ, Sun, D, Hoegler C, et al. Reduced gene expression of vascular endothelial NO synthase and cyclooxgenase-1 in heart failure[J]. Circ Res, 1996, 78:58-64.
[收稿日期]1999-06-17 [修回日期]1999-10-13, 百拇医药