肺血管内皮细胞在大鼠急性肺损伤发生中的作用
作者：杨红 斯琴 孙仁宇
单位：(中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所病理生理室， 北京 100005)
关键词：肺；内皮，血管； 细胞； 内毒素类
中国病理生理杂志000916 [摘 要] 目的：观察肺血管内皮细胞受损在大鼠急性肺损伤发病中的作用及地塞米松的影响。方法：给Wistar 大鼠静脉注射脂多糖(LPS 5mg/kg BW)复制急性肺损伤模型。 采用ELISA、放射免疫、原位杂交等多种方法测定肺组织ICAM-1mRNA表达、iNOS活性、血中TNF-α、NO-2/NO3-、ACE含量及肺血管通透性、肺泡灌洗液中细胞数、蛋白含量等的变化。结果：注射LPS后，肺血管ICAM-1 mRNA表达增加，从1 h开始至24 h达高峰。肺组织匀浆iNOS活性升高、肺血管通透性升高、肺泡灌洗液中中性粒细胞数量增加，巨噬细胞数量减少、蛋白含量增加，血中TNF-α、NO2-/NO3-含量升高而ACE含量下降等变化多在注LPS后2 h明显。预先给予地塞米松对上述多种指标的变化有明显缓解作用。结论：提示LPS通过损伤肺血管内皮细胞导致急性肺损伤，地塞米松对其有一定保护作用。
, 百拇医药
[中图分类号] R563 [文献标识码] A
[文章编号] 1000-4718(2000)09-0831-04
Effect of pulmonary vascular endothelial cells on the
development of acute lung injury in rats
YANG Hong, SI Qin, SUN Ren-yu
(Department of Pathophysiology,Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences,School of Basic Medicine,Peking Union Medical College,Beijing 100005， China)
, 百拇医药
[Abstract] AIM: Effect of endothelial cell on the development of acute lung injury and the prevention of dexamethasone in acute lung injury were observed.METHODS:Rats were divided into three groups:1.Control group.2.LPS group:Venous injection with LPS(5mg/kg body weight),execute respectively at 1 h,2 h,6 h and 24 h after LPS injection. 3.dexamethasone group:intraperitoneal injection with dexamethasone ,1 h before LPS injection,execute after 2 hours after LPS injection.RESULTS: Serum NO,TNF-α levels,lung iNOS activity and lung ICAM-1mRNA expression were increased(P<0.05,P<0.01,vs control group),but serum ACE was decreased(P<0.01).Dexamethasone could improve all the changes above mentioned.CONCLUSION:Endothelial cell played a vital role in the development of acute lung injury and dexamethasone could prevent acute lung injury.
, 百拇医药
[MeSH] Lung; Endothelium, vascular; Cells; Endotoxins
急性肺损伤(acute lung injury, ALI)是临床ICU中一类极常见且十分凶险的病症[1，2]，如不及时纠正并发症，极易引起病人转为急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS)导致死亡。我国尚无有关发病率的报道，美国每年有150 000人发病。过去，人们多集中在对中性粒细胞及其释放的炎症介质的研究，虽取得一定进展，但针对ALI这一类以血管通透性增加为特征的炎症综合征，最有效的方法莫过于直接观察血管内皮细胞(vascular endothelial cells， VEC)在ALI发生中的作用。本实验整体观察脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)对大鼠肺血管通透性的影响，肺泡灌洗液中细胞，蛋白的变化，肺血管ICAM-1mRNA表达，以及血中TNF-α、NO2-/NO3-、ACE含量和肺组织iNOS活性的变化，以探讨VEC在ALI发生中的作用。本研究还观察地塞米松对ALI大鼠上述指标变化的影响，为ALI的治疗提供一条思路。
, 百拇医药
材 料 和 方 法
一、试剂
脂多糖(LPS O55B5 Sigma)，L-(2，3，4，5-[3H])arginine(37 MBq/mL,Amersham life science),NG-nitro-L-arginine, DIG labeling and Detection kit(Boehringer Mannheim),dextran sulfate,yeast extrant,Dowex 50w xg 200-400mesh(Sigma),TNF-α检测试剂盒，NO测试盒(购自邦定公司)，evans blue,地塞米松, 甲酰胺
二、 大鼠急性肺损伤模型及分组
雄性Wistar大鼠(200-350 g)共160只，购自中国预防医学科学院流行病研究所实验动物部，大鼠经腹腔注射乌拉坦麻醉后，舌下静脉注射LPS(5mg/kg BW)复制ALI模型。动物分组：(一)对照组：舌下静脉注射生理盐水，2 h后采集标本。 (二)ALI组：注射LPS后，分别于1、2、6及24 h采集样品。(三)地塞米松组：注射LPS前1 h，腹腔注射地塞米松(70 mg/kg BW)，注射LPS后2 h采集样品。各组肺组织标本行常规光镜包埋切片，冰冻切片(8 μm)备用。
, 百拇医药
三、核酸探针制备[3]
大鼠ICAM-1 cDNA质粒由本所病理生理室薛全福，王立荣惠赠。含目的片段的质粒经常规转化、扩增、抽提、纯化后，得大量纯化的含目的基因的质粒，经PstI/KpnI酶切，玻璃丝法回收探针，随后使用Boehringer Mannheim公司生产的地高辛高效标记检测试剂盒标记。
四、肺组织湿重/干重及肺泡灌洗液中细胞计数、蛋白含量测定
开胸取出肺脏，称湿重后，置烤箱(80℃，20 h)烤至恒重，称干重，计算湿重/干重比值。另一批大鼠，开胸后，行肺泡灌洗,灌洗液在显微镜下计数细胞总数及细胞分类，测定蛋白含量，计算肺通透指数(肺泡灌洗液蛋白/血浆蛋白，lung permeability index LPI)
五、血清血管紧张素转换酶(angiotensin converting enzyme ACE)及血浆TNF-α、NO2-/NO3-含量测定
, 百拇医药
血清样品加入底物缓冲液(0.1 mol/L K2HPO4 pH 8.3，0.3 mol/L NaCl,5 mmol/L hipparyl-L-histidyl-L-leucine)37℃,温育15 min，加入0.28 mol/L NaOH，1% OPT，10 min后，加3N HCl，离心10min(3 000 r/min), MPF-4荧光分光光度计比色(激发波长360 nm,发射波长500 nm)，测定ACE含量μmol/(L*min)。 按说明书操作,测定TNF-α(ng/L)及NO2-/NO3-含量(μmol)。
六、肺血管通透性变化[4]
各组动物均在注射LPS同时股静脉注射Evans 蓝(50 mg/kg BW),开胸后取出肺脏，剪去周围组织，将肺浸泡于甲酰胺溶液中(甲酰胺用量20 mL/100 g BW)置45～50℃温箱中温育72 h，待组织中色素与浸泡液中色素达到平衡，取出组织，离心，取上清液，用72型分光光度计λ620 nm进行比色，根据标准曲线计算Evans 蓝含量，以反映肺血管通透性的变化。
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七、 肺组织iNOS活性的测定[5]
断头处死大鼠，速取左肺，按1∶5(W/V)加入预冷的提取液，冰浴中匀浆，4℃，20 000 g离心60 min，收集上清液，即NOS提取液。用Lowry法测定NOS提取液蛋白含量，[3H]-精氨酸转化实验测定提取液NOS活性，以每min每g蛋白生成[3H]-胍氨酸的nmol数表示。
八、肺组织切片的原位杂交[6]
速取左肺，液氮速冻，恒冷切片，4%多聚甲醛PBS固定，PBS洗，梯度乙醇脱水，5 mmol/L MgCl2处理10 min,0.1 mol/L-甘氨酸-0.2 mol/L Tris(pH=7.5)10 min。再次用4%多聚甲醛固定，PBS洗，乙醇脱水。预杂交，digoxigenin标记的ICAM-1探针杂交,DIG detection Kit 显色，封片保存，光镜下观察、照相。灰度扫描，测反光度值(
±s)。
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九、数据处理
数据以平均值±标准差(±s)表示，组间差异显著性比较用t检验。
结 果
一、 病理形态改变及原位杂交结果
注LPS后1h组大鼠肺组织尤其是肺血管内中性粒细胞滞留、聚集。以后随时间延长的各组，中性粒细胞滞留、聚集现象更加明显，并有向毛细血管外移行增多趋势。此外，肺脏还呈现广泛的充血、水肿、肺泡膈增厚，肺泡腔积有渗出液。原位杂交结果：正常大鼠肺血管内皮细胞有微弱的ICAM-1 mRNA表达，ALI组大鼠主要是肺静脉VEC，其次是小血管和毛细血管VEC有ICAM-1 mRNA表达，表达逐渐加强，至24 h组达高峰。地塞米松组肺泡腔渗出少，肺脏充血、水肿减轻。同时肺VEC的ICAM-1 mRNA表达受抑制(见表1)。
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表1 给LPS后大鼠肺组织ICAM-1mRNA表达的变化
Tab 1 Alteration of lung ICAM-1mRNA expression after
LPS injection (±s. n=5) Group
Value of reflect light
Control
9 596.5±1 139.6
LPS 1 h
3 709.9±1 988.4**
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LPS 2 h
1 140.3±878.0**
LPS 6 h
1 848.7±419.3**
LPS 24 h
678.8±389.6**
Dexamethasone+LPS
3 180.5±825.9★★
** P<0.01 vs control; ★★ P<0.01 vs LPS 2h group.
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二、 肺组织湿重/干重，肺血管通透性变化
ALI组大鼠肺组织湿重/干重的比值显著高于对照组(P<0.01);同时肺组织浸泡液Evans蓝含量也明显高于对照组(P<0.01)。地塞米松组肺组织湿重/干重比值及肺组织浸泡液Evans蓝含量明显低于ALI组(P<0.01)。
三、血清ACE的变化
注LPS后2 h血清ACE含量由对照组的144.4 降至106.92 μmol/(L*min) (P<0.05)。而注LPS后1、6及24 h各组其血清ACE含量无明显变化，分别为154.1、117.7、及156.2 μmol/(L*min)。
四、肺泡灌洗液细胞计数，蛋白含量及 LPI变化
ALI组大鼠肺泡灌洗液中细胞计数，只有在给LPS后24 h组明显高于对照组(P<0.05)；细胞分类计数除给LPS后24 h组无明显差异外，给LPS后1、2及6 h各组中性粒细胞数均高于对照组(P<0.01)，巨噬细胞数均低于对照组(P<0.01)。给LPS后1、2及6 h各组肺泡灌洗液蛋白含量均明显高于对照组(分别P<0.05、P<0.01、P<0.01)，而各实验组LPI均高于对照组。地塞米松组肺泡灌洗液中中性粒细胞数，蛋白含量及LPI均低于ALI组(见表2)。
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表2 急性肺损伤大鼠肺泡灌洗液细胞计数及蛋白含量的变化
Tab 2 Alteration of cell count 、cell classification and protein content in bronchial alveolar lavage fluid(BALF) of ALI rats(±s) Group
n
Cell
count(105)
Neutrophil
(%)
, 百拇医药 Macrophage
(%)
Protein content
(mg/L)
LPI(10-3)
Control
6
4.06±0.63
23.29±9. 84
71.56±9.56
62.17±19.13
1.09±0.28
, 百拇医药
LPS 1 h
6
4.71±1.07
55.47±7.58**
37.06±8.25**
180.83±117.70*
3.67±2.29*
LPS 2 h
6
3.78±1.91
49.21± 8.58**
, 百拇医药
36.23±13.75**
240.33±109.62**
4.78±1.90**
LPS 6 h
6
6.52±2.81
62.77±3.23**
31.32±4.28**
204.00±107.01**
3.45±1.87*
, 百拇医药
LPS 24 h
6
9.30±4.97*
23.69± 17.96
73.50±18.63
82.33± 25.04
1.56±0.41*
Dexamethasone
+LPS
5
4.82±3.28
, 百拇医药
22.64± 16.88★★
69.97±28.35★
116.00±38.47★
2.88±0.19★
* P<0.05, ** P<0.01 vs control;★ P<0.05,★★ P<0.01 vs LPS 2 h group.表3 给LPS后2 h大鼠血浆TNF-α， NO2-/NO3-含量及肺组织iNOS活性变化
Tab 3 Alteration of serum level of TNF-α， NO2-/NO3- and iNOS after LPS injection for 2 h(±s) Group
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TNF-α(ng/L)
NO2-/NO3- (μmol/L)
iNOS
[nmol.g-1(protein).min-1]
Control
2.19±0.89(7)
2.10±0.34(6)
37.25±12.10(7)
LPS
, 百拇医药
3.00±0.49*(9)
3.12±0.88*(6)
109.87+50.28**(7)
Dexamethasone+LPS
2.00±0.71★★(8)
1.26±0.69★★(7)
40.77±6.91★★(5)
* P<0.05,** P<0.01 vs control; ★★ P<0.01 vs LPS group.()number of rats.
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五、血浆TNF-α，NO2-/NO3-含量及肺组织iNOS活性变化
ALI组大鼠血清中TNF-α，NO2-/NO3-含量明显高于对照组(P<0.05)，同时肺组织匀浆 iNOS活性显著高于对照组(P<0.01)，地塞米松组大鼠血中TNF-α，NO2-/NO3-含量及肺组织中iNOS活性明显低于ALI组(均P<0.01,见表3)。讨 论
LPS作为一种致病因素，可直接损伤VEC，改变其表型。本研究表明，LPS使血管通透性增加[7]，大量富含蛋白质的体液由肺血管内溢出，形成肺间质水肿，肺泡水肿，影响气体交换及血氧合功能，造成广泛的组织缺氧。有报道，在这个过程中，VEC与多形核白细胞(PMN)粘附是重要环节。LPS激活VEC使 ICAM-1mRNA表达增强，VEC与被激活的白细胞相粘附，使VEC长期暴露于白细胞释放的氧自由基与多种蛋白酶的毒性作用之下。提示肺血管内皮细胞的ICAM-1表达增强在ALI发生中起重要作用。此外，ALI大鼠血中TNF-α、NO含量，肺组织中iNOS活性升高，表明LPS可激活VEC，诱发其产生并释放多种有害的炎症介质，并可进入血管外间隙[8]。从而影响白细胞、血小板[9]、巨噬细胞、以及血管平滑肌细胞等实质细胞的形态与功能，促使全身炎症反应进一步发展。 若不阻断，可形成一个逐级放大的连锁反应，形成第二次打击。若预先给予地塞米松，LPS所致的变化显著减轻。据文献报道，包括地塞米松在内的类固醇抗炎药，具有稳定溶酶体膜，降低血管通透性，抑制白细胞运动，抑制免疫应答和肉芽组织形成等多种抗炎作用。 本实验结果提示糖皮质激素可能具有抑制白细胞与内皮细胞粘附的作用，从而保护内皮细胞不易被LPS激活，并通过减少中性粒细胞从血管内渗出，减少炎症介质释放，达到预防ALI发生的作用。此结果有助于对ALI发病机理的阐明，为寻找新的药物和措施，防治ALI提供广泛的应用前景。
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Tel: 010-65296476; E-mail: Nancyyh@263.net
[参 考 文 献]
[1] Bernard GR,Artigas A, Brighet KL， et al. Report of the American-European consensus conference on ARDS:definition,mechanisms,relevant outcomes and clinical trial coordination[J]. Intensive Care Med,1994, 20:225-232.
[2] Roger C,Charles J,Robert A ,et al .Sepsis:A new hypothesis for pathogenesis of the disease process[J]. Chest,1997,112:235-243.
, 百拇医药
[3] 金冬雁， 黎孟枫，等译. 分子克隆实验指南[M]. 北京： 科学出版社，1995. 55-56，19-24，259-262.
[4] 戴顺龄,薛全福，王树山,等.山莨菪硷及川芎嗪预防大鼠肺水肿的实验研究[J].中国病理生理杂志，1989,5(6)：354-357.
[5] 强文安，刘 捷，吕芳玲,等.[3H]-精氨酸转化测定一氧化氮合酶活性[J].中华医学杂志，1996,76(8)：567-571.
[6] 苏慧慈，主编.原位杂交[M]. 北京： 中国科学技术出版社，1994. 59-90.
[7] Muller-Leisse C, Klosterhalfen B,Hauptann S,et al.Computed tomography and histologic results in the early stages of endotoxic-injuried pig lung as a model for adult respiratory distress syndrome[J]. Invest Radio，1993,28(1):39-45.
, 百拇医药
[8] Palace GP,Del Vecchio PJ,Horgan MJ,et al.Release of tumor necrosis factor after pulmonary artery after pulmonary artery occlusion and reperfusion[J]. Am Rev Respir Dis,1993,147(1):143-147.
[9] Goldsmith JA,Kavanagh BP,Pearl RG.Plasma potentiates the priming effects of endotoxin on platelet activating factor-induced pulmonary hypertension in the rabbit lung[J]. Anesth Analg,1996,83(2):242-246.
[收稿日期] 1999-06-03 [修回日期] 1999-10-27, 百拇医药
单位：(中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所病理生理室， 北京 100005)
关键词：肺；内皮，血管； 细胞； 内毒素类
中国病理生理杂志000916 [摘 要] 目的：观察肺血管内皮细胞受损在大鼠急性肺损伤发病中的作用及地塞米松的影响。方法：给Wistar 大鼠静脉注射脂多糖(LPS 5mg/kg BW)复制急性肺损伤模型。 采用ELISA、放射免疫、原位杂交等多种方法测定肺组织ICAM-1mRNA表达、iNOS活性、血中TNF-α、NO-2/NO3-、ACE含量及肺血管通透性、肺泡灌洗液中细胞数、蛋白含量等的变化。结果：注射LPS后，肺血管ICAM-1 mRNA表达增加，从1 h开始至24 h达高峰。肺组织匀浆iNOS活性升高、肺血管通透性升高、肺泡灌洗液中中性粒细胞数量增加，巨噬细胞数量减少、蛋白含量增加，血中TNF-α、NO2-/NO3-含量升高而ACE含量下降等变化多在注LPS后2 h明显。预先给予地塞米松对上述多种指标的变化有明显缓解作用。结论：提示LPS通过损伤肺血管内皮细胞导致急性肺损伤，地塞米松对其有一定保护作用。
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[中图分类号] R563 [文献标识码] A
[文章编号] 1000-4718(2000)09-0831-04
Effect of pulmonary vascular endothelial cells on the
development of acute lung injury in rats
YANG Hong, SI Qin, SUN Ren-yu
(Department of Pathophysiology,Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences,School of Basic Medicine,Peking Union Medical College,Beijing 100005， China)
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[Abstract] AIM: Effect of endothelial cell on the development of acute lung injury and the prevention of dexamethasone in acute lung injury were observed.METHODS:Rats were divided into three groups:1.Control group.2.LPS group:Venous injection with LPS(5mg/kg body weight),execute respectively at 1 h,2 h,6 h and 24 h after LPS injection. 3.dexamethasone group:intraperitoneal injection with dexamethasone ,1 h before LPS injection,execute after 2 hours after LPS injection.RESULTS: Serum NO,TNF-α levels,lung iNOS activity and lung ICAM-1mRNA expression were increased(P<0.05,P<0.01,vs control group),but serum ACE was decreased(P<0.01).Dexamethasone could improve all the changes above mentioned.CONCLUSION:Endothelial cell played a vital role in the development of acute lung injury and dexamethasone could prevent acute lung injury.
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[MeSH] Lung; Endothelium, vascular; Cells; Endotoxins
急性肺损伤(acute lung injury, ALI)是临床ICU中一类极常见且十分凶险的病症[1，2]，如不及时纠正并发症，极易引起病人转为急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS)导致死亡。我国尚无有关发病率的报道，美国每年有150 000人发病。过去，人们多集中在对中性粒细胞及其释放的炎症介质的研究，虽取得一定进展，但针对ALI这一类以血管通透性增加为特征的炎症综合征，最有效的方法莫过于直接观察血管内皮细胞(vascular endothelial cells， VEC)在ALI发生中的作用。本实验整体观察脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)对大鼠肺血管通透性的影响，肺泡灌洗液中细胞，蛋白的变化，肺血管ICAM-1mRNA表达，以及血中TNF-α、NO2-/NO3-、ACE含量和肺组织iNOS活性的变化，以探讨VEC在ALI发生中的作用。本研究还观察地塞米松对ALI大鼠上述指标变化的影响，为ALI的治疗提供一条思路。
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材 料 和 方 法
一、试剂
脂多糖(LPS O55B5 Sigma)，L-(2，3，4，5-[3H])arginine(37 MBq/mL,Amersham life science),NG-nitro-L-arginine, DIG labeling and Detection kit(Boehringer Mannheim),dextran sulfate,yeast extrant,Dowex 50w xg 200-400mesh(Sigma),TNF-α检测试剂盒，NO测试盒(购自邦定公司)，evans blue,地塞米松, 甲酰胺
二、 大鼠急性肺损伤模型及分组
雄性Wistar大鼠(200-350 g)共160只，购自中国预防医学科学院流行病研究所实验动物部，大鼠经腹腔注射乌拉坦麻醉后，舌下静脉注射LPS(5mg/kg BW)复制ALI模型。动物分组：(一)对照组：舌下静脉注射生理盐水，2 h后采集标本。 (二)ALI组：注射LPS后，分别于1、2、6及24 h采集样品。(三)地塞米松组：注射LPS前1 h，腹腔注射地塞米松(70 mg/kg BW)，注射LPS后2 h采集样品。各组肺组织标本行常规光镜包埋切片，冰冻切片(8 μm)备用。
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三、核酸探针制备[3]
大鼠ICAM-1 cDNA质粒由本所病理生理室薛全福，王立荣惠赠。含目的片段的质粒经常规转化、扩增、抽提、纯化后，得大量纯化的含目的基因的质粒，经PstI/KpnI酶切，玻璃丝法回收探针，随后使用Boehringer Mannheim公司生产的地高辛高效标记检测试剂盒标记。
四、肺组织湿重/干重及肺泡灌洗液中细胞计数、蛋白含量测定
开胸取出肺脏，称湿重后，置烤箱(80℃，20 h)烤至恒重，称干重，计算湿重/干重比值。另一批大鼠，开胸后，行肺泡灌洗,灌洗液在显微镜下计数细胞总数及细胞分类，测定蛋白含量，计算肺通透指数(肺泡灌洗液蛋白/血浆蛋白，lung permeability index LPI)
五、血清血管紧张素转换酶(angiotensin converting enzyme ACE)及血浆TNF-α、NO2-/NO3-含量测定
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血清样品加入底物缓冲液(0.1 mol/L K2HPO4 pH 8.3，0.3 mol/L NaCl,5 mmol/L hipparyl-L-histidyl-L-leucine)37℃,温育15 min，加入0.28 mol/L NaOH，1% OPT，10 min后，加3N HCl，离心10min(3 000 r/min), MPF-4荧光分光光度计比色(激发波长360 nm,发射波长500 nm)，测定ACE含量μmol/(L*min)。 按说明书操作,测定TNF-α(ng/L)及NO2-/NO3-含量(μmol)。
六、肺血管通透性变化[4]
各组动物均在注射LPS同时股静脉注射Evans 蓝(50 mg/kg BW),开胸后取出肺脏，剪去周围组织，将肺浸泡于甲酰胺溶液中(甲酰胺用量20 mL/100 g BW)置45～50℃温箱中温育72 h，待组织中色素与浸泡液中色素达到平衡，取出组织，离心，取上清液，用72型分光光度计λ620 nm进行比色，根据标准曲线计算Evans 蓝含量，以反映肺血管通透性的变化。
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七、 肺组织iNOS活性的测定[5]
断头处死大鼠，速取左肺，按1∶5(W/V)加入预冷的提取液，冰浴中匀浆，4℃，20 000 g离心60 min，收集上清液，即NOS提取液。用Lowry法测定NOS提取液蛋白含量，[3H]-精氨酸转化实验测定提取液NOS活性，以每min每g蛋白生成[3H]-胍氨酸的nmol数表示。
八、肺组织切片的原位杂交[6]
速取左肺，液氮速冻，恒冷切片，4%多聚甲醛PBS固定，PBS洗，梯度乙醇脱水，5 mmol/L MgCl2处理10 min,0.1 mol/L-甘氨酸-0.2 mol/L Tris(pH=7.5)10 min。再次用4%多聚甲醛固定，PBS洗，乙醇脱水。预杂交，digoxigenin标记的ICAM-1探针杂交,DIG detection Kit 显色，封片保存，光镜下观察、照相。灰度扫描，测反光度值(
±s)。, 百拇医药
九、数据处理
数据以平均值±标准差(
±s)表示，组间差异显著性比较用t检验。结 果
一、 病理形态改变及原位杂交结果
注LPS后1h组大鼠肺组织尤其是肺血管内中性粒细胞滞留、聚集。以后随时间延长的各组，中性粒细胞滞留、聚集现象更加明显，并有向毛细血管外移行增多趋势。此外，肺脏还呈现广泛的充血、水肿、肺泡膈增厚，肺泡腔积有渗出液。原位杂交结果：正常大鼠肺血管内皮细胞有微弱的ICAM-1 mRNA表达，ALI组大鼠主要是肺静脉VEC，其次是小血管和毛细血管VEC有ICAM-1 mRNA表达，表达逐渐加强，至24 h组达高峰。地塞米松组肺泡腔渗出少，肺脏充血、水肿减轻。同时肺VEC的ICAM-1 mRNA表达受抑制(见表1)。
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表1 给LPS后大鼠肺组织ICAM-1mRNA表达的变化
Tab 1 Alteration of lung ICAM-1mRNA expression after
LPS injection (
±s. n=5) GroupValue of reflect light
Control
9 596.5±1 139.6
LPS 1 h
3 709.9±1 988.4**
, http://www.100md.com
LPS 2 h
1 140.3±878.0**
LPS 6 h
1 848.7±419.3**
LPS 24 h
678.8±389.6**
Dexamethasone+LPS
3 180.5±825.9★★
** P<0.01 vs control; ★★ P<0.01 vs LPS 2h group.
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二、 肺组织湿重/干重，肺血管通透性变化
ALI组大鼠肺组织湿重/干重的比值显著高于对照组(P<0.01);同时肺组织浸泡液Evans蓝含量也明显高于对照组(P<0.01)。地塞米松组肺组织湿重/干重比值及肺组织浸泡液Evans蓝含量明显低于ALI组(P<0.01)。
三、血清ACE的变化
注LPS后2 h血清ACE含量由对照组的144.4 降至106.92 μmol/(L*min) (P<0.05)。而注LPS后1、6及24 h各组其血清ACE含量无明显变化，分别为154.1、117.7、及156.2 μmol/(L*min)。
四、肺泡灌洗液细胞计数，蛋白含量及 LPI变化
ALI组大鼠肺泡灌洗液中细胞计数，只有在给LPS后24 h组明显高于对照组(P<0.05)；细胞分类计数除给LPS后24 h组无明显差异外，给LPS后1、2及6 h各组中性粒细胞数均高于对照组(P<0.01)，巨噬细胞数均低于对照组(P<0.01)。给LPS后1、2及6 h各组肺泡灌洗液蛋白含量均明显高于对照组(分别P<0.05、P<0.01、P<0.01)，而各实验组LPI均高于对照组。地塞米松组肺泡灌洗液中中性粒细胞数，蛋白含量及LPI均低于ALI组(见表2)。
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表2 急性肺损伤大鼠肺泡灌洗液细胞计数及蛋白含量的变化
Tab 2 Alteration of cell count 、cell classification and protein content in bronchial alveolar lavage fluid(BALF) of ALI rats(
±s) Groupn
Cell
count(105)
Neutrophil
(%)
, 百拇医药 Macrophage
(%)
Protein content
(mg/L)
LPI(10-3)
Control
6
4.06±0.63
23.29±9. 84
71.56±9.56
62.17±19.13
1.09±0.28
, 百拇医药
LPS 1 h
6
4.71±1.07
55.47±7.58**
37.06±8.25**
180.83±117.70*
3.67±2.29*
LPS 2 h
6
3.78±1.91
49.21± 8.58**
, 百拇医药
36.23±13.75**
240.33±109.62**
4.78±1.90**
LPS 6 h
6
6.52±2.81
62.77±3.23**
31.32±4.28**
204.00±107.01**
3.45±1.87*
, 百拇医药
LPS 24 h
6
9.30±4.97*
23.69± 17.96
73.50±18.63
82.33± 25.04
1.56±0.41*
Dexamethasone
+LPS
5
4.82±3.28
, 百拇医药
22.64± 16.88★★
69.97±28.35★
116.00±38.47★
2.88±0.19★
* P<0.05, ** P<0.01 vs control;★ P<0.05,★★ P<0.01 vs LPS 2 h group.表3 给LPS后2 h大鼠血浆TNF-α， NO2-/NO3-含量及肺组织iNOS活性变化
Tab 3 Alteration of serum level of TNF-α， NO2-/NO3- and iNOS after LPS injection for 2 h(
±s) Group, http://www.100md.com
TNF-α(ng/L)
NO2-/NO3- (μmol/L)
iNOS
[nmol.g-1(protein).min-1]
Control
2.19±0.89(7)
2.10±0.34(6)
37.25±12.10(7)
LPS
, 百拇医药
3.00±0.49*(9)
3.12±0.88*(6)
109.87+50.28**(7)
Dexamethasone+LPS
2.00±0.71★★(8)
1.26±0.69★★(7)
40.77±6.91★★(5)
* P<0.05,** P<0.01 vs control; ★★ P<0.01 vs LPS group.()number of rats.
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五、血浆TNF-α，NO2-/NO3-含量及肺组织iNOS活性变化
ALI组大鼠血清中TNF-α，NO2-/NO3-含量明显高于对照组(P<0.05)，同时肺组织匀浆 iNOS活性显著高于对照组(P<0.01)，地塞米松组大鼠血中TNF-α，NO2-/NO3-含量及肺组织中iNOS活性明显低于ALI组(均P<0.01,见表3)。讨 论
LPS作为一种致病因素，可直接损伤VEC，改变其表型。本研究表明，LPS使血管通透性增加[7]，大量富含蛋白质的体液由肺血管内溢出，形成肺间质水肿，肺泡水肿，影响气体交换及血氧合功能，造成广泛的组织缺氧。有报道，在这个过程中，VEC与多形核白细胞(PMN)粘附是重要环节。LPS激活VEC使 ICAM-1mRNA表达增强，VEC与被激活的白细胞相粘附，使VEC长期暴露于白细胞释放的氧自由基与多种蛋白酶的毒性作用之下。提示肺血管内皮细胞的ICAM-1表达增强在ALI发生中起重要作用。此外，ALI大鼠血中TNF-α、NO含量，肺组织中iNOS活性升高，表明LPS可激活VEC，诱发其产生并释放多种有害的炎症介质，并可进入血管外间隙[8]。从而影响白细胞、血小板[9]、巨噬细胞、以及血管平滑肌细胞等实质细胞的形态与功能，促使全身炎症反应进一步发展。 若不阻断，可形成一个逐级放大的连锁反应，形成第二次打击。若预先给予地塞米松，LPS所致的变化显著减轻。据文献报道，包括地塞米松在内的类固醇抗炎药，具有稳定溶酶体膜，降低血管通透性，抑制白细胞运动，抑制免疫应答和肉芽组织形成等多种抗炎作用。 本实验结果提示糖皮质激素可能具有抑制白细胞与内皮细胞粘附的作用，从而保护内皮细胞不易被LPS激活，并通过减少中性粒细胞从血管内渗出，减少炎症介质释放，达到预防ALI发生的作用。此结果有助于对ALI发病机理的阐明，为寻找新的药物和措施，防治ALI提供广泛的应用前景。
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Tel: 010-65296476; E-mail: Nancyyh@263.net
[参 考 文 献]
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[4] 戴顺龄,薛全福，王树山,等.山莨菪硷及川芎嗪预防大鼠肺水肿的实验研究[J].中国病理生理杂志，1989,5(6)：354-357.
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[收稿日期] 1999-06-03 [修回日期] 1999-10-27, 百拇医药