钙调素拮抗剂与钙通道阻滞剂对离体大鼠心脏钙反常损伤心肌保护作用的研究
作者：宋东哲 姚璐 陈志周 岳远坤 孙海燕 刘成玉 谭润鸾 陆兴熠 刘丽秋
单位：宋东哲 陈志周 岳远坤(青岛大学医学院附属医院心内科， 山东 青岛 266003)；姚璐(青岛海军401医院， 山东 青岛 266071)；孙海燕 刘成玉 谭润鸾 陆兴熠 刘丽秋(青岛大学医学院诊断学教研室， 山东 青岛 266021)
关键词：三氟拉嗪；维拉帕米；心肌再灌注损伤；钙通道
中国病理生理杂志000915 [摘 要] 目的：观察钙调素拮抗剂三氟拉嗪(TFP)及钙通道阻滞剂异博定(VP)对缺钙-复钙损伤心肌的保护作用。方法：应用TFP与VP对离体大鼠心脏进行灌流。检测心肌钙含量、灌流液中乳酸脱氢酶(LDH)及心肌蛋白漏出量等指标。结果：TFP显著减少损伤心肌的钙含量、LDH及蛋白漏出量，与对照组相比差异显著(P<0.01)。VP灌注组与对照组相比各项指标差异无显著(P>0.05)。TFP与VP联合应用各项检测指标值明显低于单独应用TFP(P<0.01)。结论：TFP有效减轻钙反常心肌损伤的程度；VP对钙反常心肌无保护作用。联合应用TFP与VP的心肌保护效果更佳。钙反常时Ca2+大量内流主要通过钙调素介导，但慢钙通道在钙超载形成过程中也可能起一定作用。
, http://www.100md.com
[中图分类号] R33-33 [文献标识码] A
[文章编号] 1000-4718(2000)09-0828-06
Effects of calmodulin antagonist and slow calcium channel antagonist on
reperfusion injury of isolated rat hearts in calcium paradox
SONG Dong-zhe,CHEN Zhi-zhou, YUE Yuan-kun
(Department of Cardiology,The Affiliated Hospital of Qingdao Medical College,Qingdao University,Qingdao 266003, China)
, 百拇医药
SUN Hai-yan,LIU Cheng-yu,TAN Run-luan, LU Xin-yi,LIU Li-qiu
(Department of Diagnostics, Qingdao Medical College, Qingdao University,Qingdao 266021, China)
YAO Lu
(The 401 th Qingdao Naval Hospital, Qingdao 266071, China)
[Abstract] AIM: To observe the protective effect of calmodulin antagonist trifluoperazine(TFP) and slow calcium channel antagonist verapamil (VP) upon calcium overload injury. METHODS: The calcium content of the myocardium, lactate dehydrogenase (LDH) release, protein loss and coronary flow were measured after the isolated rat hearts were perfused by TFP and VP. RESULTS: TFP could significantly reduce the tissue calcium , LDH release and protein loss of the myocardium (P<0.01) while VP had no such effects.The above indexes were further reduced when TFP and VP were used simutaneously(P<0.01). CONCLUSIONS:TFP can effectively alleviate the severity of the myocardium injury during calcium paradox while VP has no such effects.The simultanous use of VP and TFP is more effective in preventing tissue damage of the heart than the use of TFP alone.The massive influx of Ca2+ in calcium paradox is mainly a calmodulin related process.
, 百拇医药
[MeSH] Trifluoperazine;Verapamil; Myocardial reperfusion injury; Calcium channels
钙调素(calmodulin,CaM)是迄今发现的细胞内最重要的钙受体蛋白。生理条件下，CaM参与心肌细胞内Ca2+调节、能量代谢、信使传递等诸多功能的调控[1]。因而，有理由认为CaM在钙超载心肌损伤中可能起重要的中介作用。本实验用CaM拮抗剂三氟拉嗪(trifluoperazine,TFP)灌注钙反常心肌模型，以观察TFP及(verapamil,VP)对钙超载损伤心肌的保护作用，并对其机制加以探讨。
材 料 和 方 法
一、研究对象与分组
健康Wistar大鼠，雌雄不拘，体重250-300 g，随机分为5组(每组8只)：①正常对照组：含钙KH液灌流10 min后再以含钙KH液循环灌流15 min。②缺钙-复钙对照组：无钙KH液灌流10 min，含钙KH液循环灌流15 min。③TFP灌流缺钙-复钙组：无钙KH液灌流10 min，10 μmol/L TFP循环灌流15 min。④VP灌流缺钙-复钙组：无钙KH液灌流10 min，2×10-6 mol/L的VP循环灌流15 min。⑤TFP+VP灌流缺钙-复钙组：无钙KH液灌流10 min，2×10-6 mol/L VP+10 μmol/L TFP循环灌流15 min。(以上各组循环灌流的KH液体量为40 mL)。
, 百拇医药
二、实验方法
大鼠腹腔内注射肝素2 mg抗凝，20%戊巴比妥(40 mg/kg， ip)麻醉。15 min后，分离心脏。将其立即放入4 ℃ KH液中。于液面下行主动脉插管，丝线结扎固定。将心脏接入Lengendoff灌流装置上，用95% O2-5% CO2平衡的37℃、pH 7.4的KH液行主动脉逆行恒压灌流，灌流压力为80 cmH2O。预平衡15 min，待心跳稳定后再按分组灌流。收集最后15 min灌流液。灌流结束时用10 mL终止液(150 mmol/L LiCl,4 ℃)从主动脉逆行冲洗心脏。处理标本，检测各项指标。
三、观测指标
(一)心肌钙含量测定 参照Young等[2]的方法进行。结果以μmol/g dry w表示。
, 百拇医药 (二)LDH漏出量测定 按试剂盒说明的方法测出漏出液中LDH的浓度，再求出平均每克心肌LDH漏出量，结果以U/g ww表示。
(三)心肌蛋白漏出量的测定[4] 采用考马斯亮兰法测出漏出液中蛋白的浓度，再换算成每克心肌蛋白漏出量。结果以mg/g ww表示。
(四)冠脉流量测定 冠脉流量(mL.min-1.g-1)=V/15.ww,式中V为15 min总流量；ww为心肌湿重。
(五)心肌病理组织制片 灌流结束心肌称重后，取心尖部0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm大小心肌，放入10%中性福尔马林液中固定。然后制作HE染色病理切片。光镜下观察心肌组织学形态。
四、统计处理
, 百拇医药
实验结果以
±s表示。以方差分析和q检验进行统计学处理。
结 果
一、心肌组织钙含量各组间比较
缺钙-复钙组心肌钙含量显著高于正常对照组(P<0.01)；VP灌流组与缺钙-复钙对照组比较心肌钙含量差异无显著(P>0.05)。TFP灌流缺钙-复钙组的心肌钙含量明显低于缺钙-复钙对照组(P<0.01)；TFP+VP灌流缺钙-复钙组的心肌钙含量明显低于缺钙-复钙对照组(P<0.01)。
二、心肌LDH和蛋白漏出量的比较
缺钙-复钙对照组LDH及蛋白漏出量显著高于正常对照组(P<0.01)。VP灌流组与缺钙-复钙对照组比较心肌蛋白及LDH漏出量差异无显著(P>0.05)。TFP灌流缺钙-复钙组LDH及蛋白漏出量显著低于缺钙-复钙对照组(P<0.01)。联合应用TFP和VP组LDH及蛋白漏出量明显低于VP或TFP灌流组(P<0.01)。
, 百拇医药
三、对冠脉流量的影响
缺钙-复钙对照组冠脉流量明显少于正常对照组(P<0.01)。TFP灌流组冠脉流量大于缺钙-复钙对照组(P<0.05)；联合应用TFP和VP灌流组的冠脉流量明显大于TFP灌流组(P<0.01)。
四、光镜下心肌组织形态学所见
光镜下正常对照组心肌细胞结构完整，细胞边缘清晰。胞浆染色均匀，细胞核清晰可见。缺钙-复钙组及VP组镜下可见弥漫的心肌细胞溶解、碎裂。残存心肌细胞胞浆浓缩、胞核深染。TFP组及TFP+VP组大部分心肌细胞结构尚完整，但细胞边缘模糊，细胞结构不清，有少数细胞胞浆溶解,可见裸核。心肌损伤程度明显轻于缺钙-复钙对照组。
表1 不同灌注条件对各项检测指标的影响
Tab 1 The effects of TFP and VP on different parameters(±s. n=8) Group
, http://www.100md.com
Calcium content
LDH release
Protein loss
Coronary flow
(μmol/g dry w)
(U/g ww)
(mg/g ww)
(mL.min-1.g-1)
Normal control
1.17±0.16
, 百拇医药
1.77±0.52
1.22±0.18
7.20±0.47
Injury control
22.89±4.78△
125.58±12.03△
10.68±1.97△
2.98±0.20△
TFP
9.06±3.61* *
, http://www.100md.com
77.12±11.38* *
3.68±0.27* *
3.37±0.27*
VP
22.17±4.56
123.17±12.02
10.33±2.10
3.10±0.14
TFP+VP
6.61±1.61* *▲▲ ##
, 百拇医药
43.66±10.29* *▲▲ ##
1.29±0.19* *▲▲ ##
3.86±0.25* *▲▲ ##
△ P<0.01 vs normal control group; *P<0.05， * * P<0.01 vs injury control group; ▲▲ P<0.01 vs TFP group；
## P<0.01 vs VP group.讨 论
生理条件下，慢钙通道是心肌细胞Ca2+内流的主要途径之一。理论上阻断慢钙通道可以阻止Ca2+的大量内流，从而起到防止钙超载及保护心肌的作用。VP是慢钙通道阻滞剂，其对钙反常时心肌的保护作用各家报道不一[3，4]。为进一步观察VP对钙反常心肌损伤的影响，我们应用1 mg/L (2×10-6 mol/L)的VP进行离体心脏灌流。结果提示VP不能阻止心肌钙超载的发生，对钙反常损伤心肌无保护作用。表明钙反常时细胞内积聚的大量Ca2+主要不是经由慢钙通道进入细胞的。实验结果支持Alto及Ruigrok等的观点。
, 百拇医药
CaM对钙通道的调节作用已得到许多研究的证实。本实验观察了特异性的CaM拮抗剂TFP对钙反常心肌损伤的作用，结果显示TFP对损伤心肌有显著的保护作用。其心肌保护机制主要是抑制CaM依赖的Na+-Ca2+交换[5-7]，从而减轻心肌钙超载。本实验结果显示：TFP并未完全阻止心肌钙超载的发生，表明TFP对细胞内损伤过程也有干预。TFP可通过阻断CaM，抑制细胞内各种CaM依赖酶，使细胞损伤减轻。另外，TFP组心肌冠脉流量明显高于缺钙-复钙对照组，提示TFP有较强的扩冠作用。这也是其心肌保护的重要机制之一。联合应用TFP与VP对心脏进行灌流较单独应用CaM拮抗剂心肌保护效果更为显著。推测可能与冠脉流量的进一步增加以及VP抑制了复钙早期起触发作用的Ca2+内流等因素有关。本研究结果表明，钙调素拮抗剂对防止与钙超载有关的心肌损伤具潜在临床应用价值，值得进一步研究和探讨。
[参 考 文 献]
, 百拇医药
[1] Cheung WY. Calmodulin plays a pivotal role in cellular regulation[J].Science, 1980， 207(4):19-27.
[2] Young W,DeCrescito V,Flamm ES,et al. Tissue Na+,K+ and Ca2+ changes in regional cerebral ischemia: their measurement and interpretation[J].Cent Nerv Syst Trauma,1986， 3:215-219.
[3] Ruigrok TJC, Boink ABJ, Slade A, et al.The effect of verapamil on the calcium paradox[J]. Am J Pathol, 1980， 98:761-782.
, 百拇医药
[4] Nayler W G, Grinwald P M. The effect of verapamil on calcium accumulation during the calcium paradox[J]. J Mol Cardiol, 1981，13:435-441.
[5] William H,Barray MD,John HB, et al.Intracellular calcium homeostasis in cardiac myocytes[J]. Circulation, 1993，87(6):1804-1806.
[6] Chapman R. A rise in intracellular sodium would seem to predispose the heart to the calcium paradox[J]. J Mol Cell Cardiol, 1990， 22：503-505.
[7] Matsuoka T,Saito K, Tanaka H. The role of the sodium ion in calcium-free solution on the mechanism of the calcium paradox in the guinea pig heart[J]. Jpn Circ J, 1992, 56(8): 855-860.
[收稿日期] 1999-05-10 [修回日期] 2000-01-07, 百拇医药
单位：宋东哲 陈志周 岳远坤(青岛大学医学院附属医院心内科， 山东 青岛 266003)；姚璐(青岛海军401医院， 山东 青岛 266071)；孙海燕 刘成玉 谭润鸾 陆兴熠 刘丽秋(青岛大学医学院诊断学教研室， 山东 青岛 266021)
关键词：三氟拉嗪；维拉帕米；心肌再灌注损伤；钙通道
中国病理生理杂志000915 [摘 要] 目的：观察钙调素拮抗剂三氟拉嗪(TFP)及钙通道阻滞剂异博定(VP)对缺钙-复钙损伤心肌的保护作用。方法：应用TFP与VP对离体大鼠心脏进行灌流。检测心肌钙含量、灌流液中乳酸脱氢酶(LDH)及心肌蛋白漏出量等指标。结果：TFP显著减少损伤心肌的钙含量、LDH及蛋白漏出量，与对照组相比差异显著(P<0.01)。VP灌注组与对照组相比各项指标差异无显著(P>0.05)。TFP与VP联合应用各项检测指标值明显低于单独应用TFP(P<0.01)。结论：TFP有效减轻钙反常心肌损伤的程度；VP对钙反常心肌无保护作用。联合应用TFP与VP的心肌保护效果更佳。钙反常时Ca2+大量内流主要通过钙调素介导，但慢钙通道在钙超载形成过程中也可能起一定作用。
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[中图分类号] R33-33 [文献标识码] A
[文章编号] 1000-4718(2000)09-0828-06
Effects of calmodulin antagonist and slow calcium channel antagonist on
reperfusion injury of isolated rat hearts in calcium paradox
SONG Dong-zhe,CHEN Zhi-zhou, YUE Yuan-kun
(Department of Cardiology,The Affiliated Hospital of Qingdao Medical College,Qingdao University,Qingdao 266003, China)
, 百拇医药
SUN Hai-yan,LIU Cheng-yu,TAN Run-luan, LU Xin-yi,LIU Li-qiu
(Department of Diagnostics, Qingdao Medical College, Qingdao University,Qingdao 266021, China)
YAO Lu
(The 401 th Qingdao Naval Hospital, Qingdao 266071, China)
[Abstract] AIM: To observe the protective effect of calmodulin antagonist trifluoperazine(TFP) and slow calcium channel antagonist verapamil (VP) upon calcium overload injury. METHODS: The calcium content of the myocardium, lactate dehydrogenase (LDH) release, protein loss and coronary flow were measured after the isolated rat hearts were perfused by TFP and VP. RESULTS: TFP could significantly reduce the tissue calcium , LDH release and protein loss of the myocardium (P<0.01) while VP had no such effects.The above indexes were further reduced when TFP and VP were used simutaneously(P<0.01). CONCLUSIONS:TFP can effectively alleviate the severity of the myocardium injury during calcium paradox while VP has no such effects.The simultanous use of VP and TFP is more effective in preventing tissue damage of the heart than the use of TFP alone.The massive influx of Ca2+ in calcium paradox is mainly a calmodulin related process.
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[MeSH] Trifluoperazine;Verapamil; Myocardial reperfusion injury; Calcium channels
钙调素(calmodulin,CaM)是迄今发现的细胞内最重要的钙受体蛋白。生理条件下，CaM参与心肌细胞内Ca2+调节、能量代谢、信使传递等诸多功能的调控[1]。因而，有理由认为CaM在钙超载心肌损伤中可能起重要的中介作用。本实验用CaM拮抗剂三氟拉嗪(trifluoperazine,TFP)灌注钙反常心肌模型，以观察TFP及(verapamil,VP)对钙超载损伤心肌的保护作用，并对其机制加以探讨。
材 料 和 方 法
一、研究对象与分组
健康Wistar大鼠，雌雄不拘，体重250-300 g，随机分为5组(每组8只)：①正常对照组：含钙KH液灌流10 min后再以含钙KH液循环灌流15 min。②缺钙-复钙对照组：无钙KH液灌流10 min，含钙KH液循环灌流15 min。③TFP灌流缺钙-复钙组：无钙KH液灌流10 min，10 μmol/L TFP循环灌流15 min。④VP灌流缺钙-复钙组：无钙KH液灌流10 min，2×10-6 mol/L的VP循环灌流15 min。⑤TFP+VP灌流缺钙-复钙组：无钙KH液灌流10 min，2×10-6 mol/L VP+10 μmol/L TFP循环灌流15 min。(以上各组循环灌流的KH液体量为40 mL)。
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二、实验方法
大鼠腹腔内注射肝素2 mg抗凝，20%戊巴比妥(40 mg/kg， ip)麻醉。15 min后，分离心脏。将其立即放入4 ℃ KH液中。于液面下行主动脉插管，丝线结扎固定。将心脏接入Lengendoff灌流装置上，用95% O2-5% CO2平衡的37℃、pH 7.4的KH液行主动脉逆行恒压灌流，灌流压力为80 cmH2O。预平衡15 min，待心跳稳定后再按分组灌流。收集最后15 min灌流液。灌流结束时用10 mL终止液(150 mmol/L LiCl,4 ℃)从主动脉逆行冲洗心脏。处理标本，检测各项指标。
三、观测指标
(一)心肌钙含量测定 参照Young等[2]的方法进行。结果以μmol/g dry w表示。
, 百拇医药 (二)LDH漏出量测定 按试剂盒说明的方法测出漏出液中LDH的浓度，再求出平均每克心肌LDH漏出量，结果以U/g ww表示。
(三)心肌蛋白漏出量的测定[4] 采用考马斯亮兰法测出漏出液中蛋白的浓度，再换算成每克心肌蛋白漏出量。结果以mg/g ww表示。
(四)冠脉流量测定 冠脉流量(mL.min-1.g-1)=V/15.ww,式中V为15 min总流量；ww为心肌湿重。
(五)心肌病理组织制片 灌流结束心肌称重后，取心尖部0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm大小心肌，放入10%中性福尔马林液中固定。然后制作HE染色病理切片。光镜下观察心肌组织学形态。
四、统计处理
, 百拇医药
实验结果以
±s表示。以方差分析和q检验进行统计学处理。结 果
一、心肌组织钙含量各组间比较
缺钙-复钙组心肌钙含量显著高于正常对照组(P<0.01)；VP灌流组与缺钙-复钙对照组比较心肌钙含量差异无显著(P>0.05)。TFP灌流缺钙-复钙组的心肌钙含量明显低于缺钙-复钙对照组(P<0.01)；TFP+VP灌流缺钙-复钙组的心肌钙含量明显低于缺钙-复钙对照组(P<0.01)。
二、心肌LDH和蛋白漏出量的比较
缺钙-复钙对照组LDH及蛋白漏出量显著高于正常对照组(P<0.01)。VP灌流组与缺钙-复钙对照组比较心肌蛋白及LDH漏出量差异无显著(P>0.05)。TFP灌流缺钙-复钙组LDH及蛋白漏出量显著低于缺钙-复钙对照组(P<0.01)。联合应用TFP和VP组LDH及蛋白漏出量明显低于VP或TFP灌流组(P<0.01)。
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三、对冠脉流量的影响
缺钙-复钙对照组冠脉流量明显少于正常对照组(P<0.01)。TFP灌流组冠脉流量大于缺钙-复钙对照组(P<0.05)；联合应用TFP和VP灌流组的冠脉流量明显大于TFP灌流组(P<0.01)。
四、光镜下心肌组织形态学所见
光镜下正常对照组心肌细胞结构完整，细胞边缘清晰。胞浆染色均匀，细胞核清晰可见。缺钙-复钙组及VP组镜下可见弥漫的心肌细胞溶解、碎裂。残存心肌细胞胞浆浓缩、胞核深染。TFP组及TFP+VP组大部分心肌细胞结构尚完整，但细胞边缘模糊，细胞结构不清，有少数细胞胞浆溶解,可见裸核。心肌损伤程度明显轻于缺钙-复钙对照组。
表1 不同灌注条件对各项检测指标的影响
Tab 1 The effects of TFP and VP on different parameters(
±s. n=8) Group, http://www.100md.com
Calcium content
LDH release
Protein loss
Coronary flow
(μmol/g dry w)
(U/g ww)
(mg/g ww)
(mL.min-1.g-1)
Normal control
1.17±0.16
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1.77±0.52
1.22±0.18
7.20±0.47
Injury control
22.89±4.78△
125.58±12.03△
10.68±1.97△
2.98±0.20△
TFP
9.06±3.61* *
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77.12±11.38* *
3.68±0.27* *
3.37±0.27*
VP
22.17±4.56
123.17±12.02
10.33±2.10
3.10±0.14
TFP+VP
6.61±1.61* *▲▲ ##
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43.66±10.29* *▲▲ ##
1.29±0.19* *▲▲ ##
3.86±0.25* *▲▲ ##
△ P<0.01 vs normal control group; *P<0.05， * * P<0.01 vs injury control group; ▲▲ P<0.01 vs TFP group；
## P<0.01 vs VP group.讨 论
生理条件下，慢钙通道是心肌细胞Ca2+内流的主要途径之一。理论上阻断慢钙通道可以阻止Ca2+的大量内流，从而起到防止钙超载及保护心肌的作用。VP是慢钙通道阻滞剂，其对钙反常时心肌的保护作用各家报道不一[3，4]。为进一步观察VP对钙反常心肌损伤的影响，我们应用1 mg/L (2×10-6 mol/L)的VP进行离体心脏灌流。结果提示VP不能阻止心肌钙超载的发生，对钙反常损伤心肌无保护作用。表明钙反常时细胞内积聚的大量Ca2+主要不是经由慢钙通道进入细胞的。实验结果支持Alto及Ruigrok等的观点。
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CaM对钙通道的调节作用已得到许多研究的证实。本实验观察了特异性的CaM拮抗剂TFP对钙反常心肌损伤的作用，结果显示TFP对损伤心肌有显著的保护作用。其心肌保护机制主要是抑制CaM依赖的Na+-Ca2+交换[5-7]，从而减轻心肌钙超载。本实验结果显示：TFP并未完全阻止心肌钙超载的发生，表明TFP对细胞内损伤过程也有干预。TFP可通过阻断CaM，抑制细胞内各种CaM依赖酶，使细胞损伤减轻。另外，TFP组心肌冠脉流量明显高于缺钙-复钙对照组，提示TFP有较强的扩冠作用。这也是其心肌保护的重要机制之一。联合应用TFP与VP对心脏进行灌流较单独应用CaM拮抗剂心肌保护效果更为显著。推测可能与冠脉流量的进一步增加以及VP抑制了复钙早期起触发作用的Ca2+内流等因素有关。本研究结果表明，钙调素拮抗剂对防止与钙超载有关的心肌损伤具潜在临床应用价值，值得进一步研究和探讨。
[参 考 文 献]
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[1] Cheung WY. Calmodulin plays a pivotal role in cellular regulation[J].Science, 1980， 207(4):19-27.
[2] Young W,DeCrescito V,Flamm ES,et al. Tissue Na+,K+ and Ca2+ changes in regional cerebral ischemia: their measurement and interpretation[J].Cent Nerv Syst Trauma,1986， 3:215-219.
[3] Ruigrok TJC, Boink ABJ, Slade A, et al.The effect of verapamil on the calcium paradox[J]. Am J Pathol, 1980， 98:761-782.
, 百拇医药
[4] Nayler W G, Grinwald P M. The effect of verapamil on calcium accumulation during the calcium paradox[J]. J Mol Cardiol, 1981，13:435-441.
[5] William H,Barray MD,John HB, et al.Intracellular calcium homeostasis in cardiac myocytes[J]. Circulation, 1993，87(6):1804-1806.
[6] Chapman R. A rise in intracellular sodium would seem to predispose the heart to the calcium paradox[J]. J Mol Cell Cardiol, 1990， 22：503-505.
[7] Matsuoka T,Saito K, Tanaka H. The role of the sodium ion in calcium-free solution on the mechanism of the calcium paradox in the guinea pig heart[J]. Jpn Circ J, 1992, 56(8): 855-860.
[收稿日期] 1999-05-10 [修回日期] 2000-01-07, 百拇医药