洛沙坦对急性心肌梗塞后大鼠心肌间质金属蛋白酶活性的影响
作者：潘静薇 秦永文 郑兴
单位：(第二军医大学附属长海医院心血管内科， 上海 200433)
关键词：金属蛋白酶类；溶组织梭菌胶原酶；心肌梗塞
中国病理生理杂志000908
[摘 要] 目的： 探讨急性心肌梗塞后，梗塞区心肌间质金属蛋白酶(MMPs)活性的动态变化及洛沙坦对其的影响。 方法： 结扎SD大鼠冠状动脉前降支复制急性心梗模型，随机分成对照组和用药组。采用MPA-V型多导生物信号分析系统监测血流动力学指标；采用酶谱法测定54 kD间质金属蛋白酶1(MMP-1)、58 kD和62 kD间质金属蛋白酶2 (MMP-2)的活性；采用氯氨T法测定胶原蛋白的含量。 结果： 梗塞区MMPs活性表现出-过性升高，第3 d比假手术组高4.5倍，第7 d高6.5倍达高峰，然后下降，第14 d降至2倍，第42 d仍高1.5倍。用药组MMP-1比同时间点对照组降低 33%，MMP-2低至50%；左室重量与体重之比(LVW/BW),第14 d和第42 d明显低于对照组(P<0.01);梗塞区胶原密度第42 d显著低于假手术组(P<0.01)。用药组心脏舒张末期压力于第3 d一过性高于对照组,第7、14、42 d均低于对照组。收缩压最大上升速度高于对照组(P<0.05)。结论：心肌梗塞后梗塞区MMPs被激活，加速胶原分解代谢；洛沙坦降低MMPs活性，降低胶原分解代谢，同时抑制胶原合成代谢，使心梗后期胶原含量降低，具有改善心脏功能，保护心肌的作用。
, 百拇医药
[中图分类号] R542.2+2 [文献标识码] A
[文章编号] 1000-4718(2000)09-0800-05
Effect of losartan on matrix metalloproteinases of myocardial
extracellular matrix after infarction in the rat
PAN Jing-wei, QIN Yong-wen, ZHENG Xing
(Department of Cardiovascular Physiology of Changhai Hospital,The Second Millitary Medical University, Shanghai 200433，China)
, 百拇医药
[Abstract] AIM: To study the change of the activity of matrix metalloproteinases(MMPs) in the infarcted intestitium of rat heart and the effect of Losartan on them. METHODS: 80 Adult male Sprague-Dawley rats underwent the left descending coronary artery ligation, then being divided randomly into control, treated groups and sham operation group. After hemodynamic parameters were obtained,animals of 8 groups were killed at 4 timepoints ( day 3, day 7,day 14, day 42 after infarction ).Matrix metalloproteinases(MMPs) activity in infarct zone was measured by zymography,so did collagen concentration in both ventricles by the method of chloramine T. RESULTS: The activity of MMPs in the infarcted zone showed a transient increase, which raiesd by 4.5 folds at day 3 (compared with the sham-operated group killed at day 3), 6.5 folds at day 7, and declined thereafter,being 2 folds at day 14, 1.5 folds at day 42. Losaran treatment was associated with significant attenuation of MMPs activity. The activity of MMP-1 (54 kD band) decreased 33%, so did the MMP-2 (58 kD and 62 kD bands) 50%. Compared with control groups, the hypertrophy of the left ventricle was regressed, the rate of LVW/BW dropped significantly at day 14 and day 42 (P<0.01) .The collagen concentration decreased at treated day 42 group(P<0.01).For the regression of heart dysfuncton in Losartan groups, LVEDP demonstrated a slightly raise at day 3, then decreased at day 7,14,42, all of three groups' systolic function are higher than that in the control (P<0.05). CONCLUSION： The latent MMPs were activated after infarction, which resulted in the demage of the fibrillar network and dalitation of the left ventricle.Losartan not only attenuates the activity of MMPs but also prevents collagen synthesis, decreases the total collagen in the necrosis zone at the late stage after infaction, thus regressing the progress dysfuction of the infarcted heart and protecting the myocardium.
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[MeSH] Metalloproteinases; Clostridium histolyticum collagenase; Myocardial infarction
间质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)是一组存在于心肌间质中的蛋白酶系，正常情况下主要以无活性状态存在，激活后可分解胶原纤维，改变组织的形态结构。
急性心肌梗塞(acute myocardial infarction, AMI)后胶原代谢活跃一直被认为是导致心梗后心肌肥厚、心功能下降的主要因素之一。血管紧张素转换酶抑制剂(angiotensin converting enzyme inhibitor,ACEI)能够抑制全身和局部心肌组织中肾素—血管紧张素系统(renin-angiotensin system,RAS)的活性，减低心脏负荷、减少胶原含量。本研究旨在观察洛沙坦(losartan)对心梗后梗塞区胶原酶活性变化及胶原密度的影响，为临床防治心梗后心室重构提供实验依据。
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材 料 和 方 法
一、动物模型复制及分组
成年雄性 Sprague-Dawley(SD)大鼠88只(由中科院上海动物中心提供),初始体重为250-300g。乙醚吸入麻醉，连接微型人工呼吸器(江湾I
型),其中8只假手术组，80只结扎冠状动脉的左前降支近端(左心耳和肺动脉圆锥之间距主动脉根部2-3 mm),根据体表心电图Ⅱ导R波高尖，ST段抬高判断心梗模型的成功。将心梗大鼠随机分成给药组和实验组，各4组，每组10只，存活率为60%。将losartan(美国Merk公司提供)溶于生理盐水中，实验组经胃管喂给药，每只15 mg/kg*d-1,每天1次，直至各实验终点, 对照组给于等量的生理盐水。
二、心功能的测定及标本收集
, 百拇医药 用2%戊巴比妥钠(35 mg/kg， ip)麻醉，气管插管行人工呼吸，股动脉插管监测血压，右颈总动脉插管经二尖瓣至左心室,检测血流动力学指标。处死假手术组(开胸术后第3 d) 和8组(心梗术后第3、7、14、42 d 4个时点)心梗大鼠，取出心脏。于二尖瓣下2 mm处垂直心脏长轴，做心室短轴切片，厚约2～3 mm, HE染色验证左室游离壁颜色苍区为心梗区。采用颗粒分析系统测量心梗区长度及左室周长，二者之比表示心梗面积大小，剔除心梗面积小于20%的大鼠，本实验的梗塞面积为35%±14%。分别称取左、右室重量后，将左室梗塞区、非梗塞区和右室心肌分装入冻存管，分别置于液氮中保存。
三、提取心肌组织及其总蛋白的测定
称取约25 mg冻存的梗塞区心肌组织，冰盐水冲洗3-4次后，将其孵育在2 mL提取物缓冲液中(10 mmol/L二甲胂酸钠，pH5.0, 0.15 mol/L NaCl，1 μmol/L ZnCl2, 20 mmol/L CaCl2, 1.5 mmol/L NaN3, 0.01% Triton)。于4℃持续振荡24 h, 收集上清液，更换新的提取液重复振荡24 h。将两次上清液混合后，加入1 mol/L Tris(pH 8) 将混合液的pH值滴定到7.5。4 ℃下, 通过透析袋将提取液浓缩至1.5 mL。采用福林酚法测定提取物中蛋白浓度[1]。
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四、酶谱法测定胶原酶的活性
参照Suresh等人1993年提供的方法[2]，将1 g/L明胶0.8 mL加入8%的聚丙烯酰胺混合物中[3]，使其终浓度达到0.7 g/L制成分离胶，作为胶原酶的底物[4]。将含30 μg蛋白的提取物与加样缓冲液(10% SDS，4%蔗糖，0.25 mol/L Tris-Cl， pH6.8， 0.1%溴酚蓝)以3∶1的比例混合但不加热，立即上样于5%的堆积胶。在4℃，采用美国Bio-Rad 公司的垂直电泳仪，使堆积胶电流保持在15 mA,分离胶电流为20 mA。约4-5 h,溴酚蓝接近底线后，将胶样剥离并浸泡在2.5% Triton中，室温摇荡30 min，其间更换1次洗脱液。然后将胶样浸泡在底物缓冲液(50 mmol/L Tris-Cl， pH8，5 mmol/L CaCl2， 0.02% W/V NaN3)中，在37℃下孵育过夜。取出胶样采用0.05%考马斯蓝R250染色30 min，脱色后经美国UVP凝胶成像仪扫描及分析处理，所得不同时点对照组和给药组54 kD的MMP-1和58 kD、62 kD的MMP-2泳带的光密度吸收值，经同一对照值(假手术后第3 d左室心肌胶原酶活性)校正后进行比较。
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五、氯氨T法测定胶原的含量[5]
取左、右室心肌各100 mg，冰浴中研碎，置60℃烤干，滴加6 mol/L盐酸(0.12 L/g干重)在105 ℃下消化样品16 h。通过UV-756MC紫外可见光分析仪测定羟脯氨酸含量。将分析纯度的L-羟脯氨酸溶于1 mmol/L盐酸制成40 mmol/L标准储液，绘制标准曲线，依据文献间质胶原平均包含13.4%羟脯氨酸，间质胶原浓度等于羟脯氨酸含量乘以7.46，结果以mg/g干重心肌表示。
所有数据均以
±s表示，采用未配对的t检验判定均数差异显著性。
结 果
一、血液动力学测定结果(表1)
, http://www.100md.com 表1 心梗后给药组与对照组各实验时点血液动力学指标
Tab 1 The hemodynamic parameters at different timepoints of treated and control groups (±s) Time(d)
Group
n
3
7
14
42
AMI
, 百拇医药
6
AMI+LOS
5
AMI
5
AMI+LOS
5
AMI
6
AMI+LOS
6
AMI
6
, 百拇医药
AMI+LOS
6
BPs(kPa)
17.3±0.7
17.2±3.0
16.0±1.5
14.7±2.1
14.7±1.6
12.2±2.2
18.6±0.8
16.6±1.5
BPd(kPa)
, 百拇医药
12.7±1.3
11.6±3.6
11.8±1.8
11.5±0.2
10.1±1.4
8.7±2.4
14.5±1.1
11.0±1.7
MBP (kPa)
14.2±1.1
13.5±3.4
13.6±1.2
, 百拇医药
12.8±0.3
11.6±1.4
10.3±2.4
15.9±1.0
12.8±2.2
HR(/min)
352±13
355±15
318±11
333±23
327±19
343±23
, 百拇医药
374±18
394±8
LVSP(kPa)
13.90±2.30
12.50±1.40
13.7±1.9
13.5±3.2
14.1±0.9
15.9±1.1
14.6±3.4
16.3±1.9
LVDP(kPa)
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0.53±0.07
2.43±0.24* *
1.07±0.21
1.03±0.18
0.71±0.16
0.67±0.09
4.10±0.50
1.90±0.20
LVEDP(kPa)
0.91±0.37
2.67±0.27* *
, 百拇医药
1.28±0.28
0.94±0.18*
1.53±0.14
0.92±0.09* *
4.40±0.18
2.70±0.30* *
+dp/dtmax
(kPa/s)
813.00±73.00
836.00±72.00
862.00±59.00
, 百拇医药
949.00±87.00*
992.00±55.00
1123.00±67.00*
526.00±49.00
926.00±66.00*
-dp/dtmax
(kPa/s)
658.00±64.00
705.00±68.00
691.00±47.00
, 百拇医药
633.00±59.00
502.00±48.00
723.00±48.00
597.00±76.00
403.00±32.00
*P<0.05, * * P<0.01 vs AMI;AMI: control groups； AMI+LOS: treated groups.
心梗后第3 d用药组LVDP和LVEDP均明显高于对照组(P<0.01)。其后用药组LVEDP开始下降，第7 d明显低于对照组(P<0.05)，第14、42 d非常显著(P<0.01)。第7、14、42 d收缩压最大上升速度(dp/dtmax)明显大于对照组(P<0.05)。
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二、间质金属蛋白酶活性变化(图1)(图2)
Fig 1 The activity change of the MMPs :The absorptance dense of the MMPs lytic bands in zymographic gel are scaned by the UVP gel grab instrument.The figures are analysised and compared between the treated and the control in day 3, 7, 14, 42 after infarction.±s. n= 5-6. * P<0.05 vs control.
图1 间质金属蛋白酶活性变化图
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心肌间质金属蛋白酶MMP-1、MMP-2于心梗后第3 d高于假手术组4.5倍，第7 d高6.5倍,达高峰，然后开始下降，第14 d高2倍，第42 d高1.5倍。给losartan组心肌梗塞后间质金属蛋白酶活性，比同时点对照组MMP-1低33%，MMP-2低50%。
三、心梗对照组和给药组不同时间体重及心重改变(表2)
两组体重差别无显著。左心室重量在第14、42 d给药组非常明显低于对照组，(P<0.01)。右室重量在第7 d给药组显著低于对照组(P<0.05)。给药组左室重量/体重(LVW/BW)在14、42 d明显低于对照组 (P<0.01)，右室重量/体重(RVW/BW)在第7 d、14 d均明显或非常明显低于对照组(P<0.05, P<0.01)。
Fig 2 Cardiac collagenases and the effects of Losartan on infarcted heart: Zymograghy of infarcted myocardium after operation at day 3,day7,day 14,day 42 (Lane 1,3,5,10), and of treated group of day 3, day7,day14,day42 (Lane2,4,9,11 ), and of sham-operated rat at day3(lane 6,8). Standard low marker was run in the right-hand(Lane7,12).Gelatinolytic activity were taken to represent respective cardiac collagenase 54 kD(MMP-1) and 58 kD、62 kD(MMP-2).
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图2 心肌间质金属蛋白酶
表2 心梗后给药组与对照组不同时间点体重和心脏重量
Tab 2 The body and heart weight of treated and control groups after myocardic infarction(mg/kg.±s) Time(d)
Group
n
3
7
14
42
, 百拇医药
AMI
6
AMI+LOS
5
AMI
5
AMI+LOS
5
AMI
6
AMI+LOS
6
AMI
, 百拇医药
6
AMI+LOS
6
BW
235.00±8.00
235.00±13.00
266.00±9.00
263.00±10.00
295.00±7.00
292.00±14.00
411.00±17.00
411.00±17.00
, 百拇医药
LVW
0.57±0.03
0.56±0.04
0.65±0.04
0.63±0.07
0.78±0.03
0.67±0.04* *
0.89±0.03
0.70±0.02* *
RVW
0.18±0.01
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0.19±0.02
0.20±0.02
0.16±0.03*
0.26±0.04
0.19±0.03
0.30±0.04
0.28±0.03
LVW/BW
2.43±0.06
2.36±0.07
2.43±0.06
, 百拇医药 2.35±0.07
2.65±0.09
2.43±0.09* *
2.16±0.06
1.70±0.04* *
(mg/kg)
RVW/BW
0.77±0.04
0.79±0.04
0.75±0.04
0.61±0.10*
, 百拇医药
0.87±0.10
0.64±0.08* *
0.73±0.07
0.68±0.10
(mg/kg)
* P<0.05, * * P<0.01 vs AMI; AMI: control group; AMI+LOS: treated group.表3 心梗后给药组与对照组不同时点梗塞区和右室胶原含量
Tab 3 The collagen concentration of infarcted and noninfarcted zones of the treated
, 百拇医药
and the control at different timepoints after myocardiac infarction(±s. mg/g d.co.) Time(d)
Group
n
3
7
14
42
AMI
AMI+LOS
AMI
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AMI+LOS
AMI
AMI+LOS
AMI
AMI+LOS
< 6
5
5
5
6
6
6
6
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IZ
14.58±1.15
13.12±1.83
26.85±2.93
23.10±2.67
37.32±2.64
31.84±4.00*
57.18±3.13
46.78±2.58* *
NIZ
8.73±0.46
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8.41±0.41
8.79±0.67
8.59±0.59
9.21±1.02
8.77±0.80
15.77±1.80
11.65±1.96
*P<0.05,* * P<0.01 vs NIZ; IZ:infarcted zone; NIZ:non-infarcted zone; AMI:control; AMI+LOS; treated group.
四、梗塞区和非梗塞区胶原密度的变化(表3)
, 百拇医药
给药组梗塞区(infarcted zone,IZ)和非梗塞区(non-infarcted zone,NIZ)胶原含量在第14、42 d显著低于对照组(P<0.05)。讨 论
心肌梗塞后的愈合是一个动态过程。很多实验显示复制大鼠心梗模型后，其血液和心肌组织中肾素—血管紧张素—醛固酮系统(RAAS)被激活，直接引起心脏胶原合成代谢增强,胶原沉积。另一方面,心肌梗塞后胶原酶(MMP-1)被激活，降解心肌间质胶原蛋白肽链的三螺旋结构，在距肽链C末端1/4处将其分解为两个片段后，激活的明胶酶(MMP-2、MMP-9)等参与完成其后的非特异分解代谢。本实验通过复制大鼠心肌梗塞模型，进而采用酶谱法证明Jack等报告的心肌梗塞后MMPs活性升高，并呈现动态变化[6]。但是发现MMPs的活性在第14 d虽然较第7 d低，却未完全回降至正常，在第42 d仍高于假手术组，这不同于Jack 的结论。仔细对照二者所采用的方法步骤，发现在心肌组织提取时本实验采用的是二甲胂酸钠而后者采用的是二甲胂酸；在酶谱电泳时分离胶浓度及底物明胶的浓度略有不同；此外提取物浓缩方法不同。以上可能是造成二者结果不同的原因。但是本结果与Ian等[7]的研究结果相似，这提示心梗晚期MMPs仍参与心肌间质代谢。
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激活的胶原酶降解心肌间质，可导致心肌细胞的滑动、拉长(离心性肥大),进一步导致心脏支持结构的缺失、组织结构的变形、坚硬度的降低，使心室壁变薄、心脏扩张甚至破裂。尽管许多学者[6，8]推测胶原降解在心脏扩张、左室功能不全及充血性心功衰竭方面起着一定作用，但是尚无研究可以证明这些假设。MMPs的有害作用主要围绕其控制胶原的降解，因此有两条途径可降低胶原分解。第一，抑制MMPs的合成及激活；第二，抑制已激活的MMPs。本实验根据AT1受体拮抗剂可以减低心梗面积、非梗塞区胶原含量和AngII受体密度[9]。给予心梗大鼠losartan，发现它不仅可以降低心梗后中晚期(第14 d后)梗塞区胶原含量，抑制心梗后心室肥厚。而且明显降低MMPs的活性，对心肌有保护作用。同时发现，losartan虽使心梗后早期(第3 d)大鼠左心室舒张功能进一步降低，但是显著改善心梗后中晚期(第7 d后)左室舒张、收缩功能。这与近来临床发现的过早应用ACEI类药物会加重心梗后心功能不全现象相符合，提示应在心梗超急期后用药更有利于心功能恢复。但是本实验无法回答心肌梗塞后AT1受体拮抗剂的适应症、时机和剂量，这有待于进一步的临床研究。
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[参 考 文 献]
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[收稿日期] 1999-10-18 [修回日期] 2000-04-03, 百拇医药
单位：(第二军医大学附属长海医院心血管内科， 上海 200433)
关键词：金属蛋白酶类；溶组织梭菌胶原酶；心肌梗塞
中国病理生理杂志000908
[摘 要] 目的： 探讨急性心肌梗塞后，梗塞区心肌间质金属蛋白酶(MMPs)活性的动态变化及洛沙坦对其的影响。 方法： 结扎SD大鼠冠状动脉前降支复制急性心梗模型，随机分成对照组和用药组。采用MPA-V型多导生物信号分析系统监测血流动力学指标；采用酶谱法测定54 kD间质金属蛋白酶1(MMP-1)、58 kD和62 kD间质金属蛋白酶2 (MMP-2)的活性；采用氯氨T法测定胶原蛋白的含量。 结果： 梗塞区MMPs活性表现出-过性升高，第3 d比假手术组高4.5倍，第7 d高6.5倍达高峰，然后下降，第14 d降至2倍，第42 d仍高1.5倍。用药组MMP-1比同时间点对照组降低 33%，MMP-2低至50%；左室重量与体重之比(LVW/BW),第14 d和第42 d明显低于对照组(P<0.01);梗塞区胶原密度第42 d显著低于假手术组(P<0.01)。用药组心脏舒张末期压力于第3 d一过性高于对照组,第7、14、42 d均低于对照组。收缩压最大上升速度高于对照组(P<0.05)。结论：心肌梗塞后梗塞区MMPs被激活，加速胶原分解代谢；洛沙坦降低MMPs活性，降低胶原分解代谢，同时抑制胶原合成代谢，使心梗后期胶原含量降低，具有改善心脏功能，保护心肌的作用。
, 百拇医药
[中图分类号] R542.2+2 [文献标识码] A
[文章编号] 1000-4718(2000)09-0800-05
Effect of losartan on matrix metalloproteinases of myocardial
extracellular matrix after infarction in the rat
PAN Jing-wei, QIN Yong-wen, ZHENG Xing
(Department of Cardiovascular Physiology of Changhai Hospital,The Second Millitary Medical University, Shanghai 200433，China)
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[Abstract] AIM: To study the change of the activity of matrix metalloproteinases(MMPs) in the infarcted intestitium of rat heart and the effect of Losartan on them. METHODS: 80 Adult male Sprague-Dawley rats underwent the left descending coronary artery ligation, then being divided randomly into control, treated groups and sham operation group. After hemodynamic parameters were obtained,animals of 8 groups were killed at 4 timepoints ( day 3, day 7,day 14, day 42 after infarction ).Matrix metalloproteinases(MMPs) activity in infarct zone was measured by zymography,so did collagen concentration in both ventricles by the method of chloramine T. RESULTS: The activity of MMPs in the infarcted zone showed a transient increase, which raiesd by 4.5 folds at day 3 (compared with the sham-operated group killed at day 3), 6.5 folds at day 7, and declined thereafter,being 2 folds at day 14, 1.5 folds at day 42. Losaran treatment was associated with significant attenuation of MMPs activity. The activity of MMP-1 (54 kD band) decreased 33%, so did the MMP-2 (58 kD and 62 kD bands) 50%. Compared with control groups, the hypertrophy of the left ventricle was regressed, the rate of LVW/BW dropped significantly at day 14 and day 42 (P<0.01) .The collagen concentration decreased at treated day 42 group(P<0.01).For the regression of heart dysfuncton in Losartan groups, LVEDP demonstrated a slightly raise at day 3, then decreased at day 7,14,42, all of three groups' systolic function are higher than that in the control (P<0.05). CONCLUSION： The latent MMPs were activated after infarction, which resulted in the demage of the fibrillar network and dalitation of the left ventricle.Losartan not only attenuates the activity of MMPs but also prevents collagen synthesis, decreases the total collagen in the necrosis zone at the late stage after infaction, thus regressing the progress dysfuction of the infarcted heart and protecting the myocardium.
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[MeSH] Metalloproteinases; Clostridium histolyticum collagenase; Myocardial infarction
间质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)是一组存在于心肌间质中的蛋白酶系，正常情况下主要以无活性状态存在，激活后可分解胶原纤维，改变组织的形态结构。
急性心肌梗塞(acute myocardial infarction, AMI)后胶原代谢活跃一直被认为是导致心梗后心肌肥厚、心功能下降的主要因素之一。血管紧张素转换酶抑制剂(angiotensin converting enzyme inhibitor,ACEI)能够抑制全身和局部心肌组织中肾素—血管紧张素系统(renin-angiotensin system,RAS)的活性，减低心脏负荷、减少胶原含量。本研究旨在观察洛沙坦(losartan)对心梗后梗塞区胶原酶活性变化及胶原密度的影响，为临床防治心梗后心室重构提供实验依据。
, 百拇医药
材 料 和 方 法
一、动物模型复制及分组
成年雄性 Sprague-Dawley(SD)大鼠88只(由中科院上海动物中心提供),初始体重为250-300g。乙醚吸入麻醉，连接微型人工呼吸器(江湾I
型),其中8只假手术组，80只结扎冠状动脉的左前降支近端(左心耳和肺动脉圆锥之间距主动脉根部2-3 mm),根据体表心电图Ⅱ导R波高尖，ST段抬高判断心梗模型的成功。将心梗大鼠随机分成给药组和实验组，各4组，每组10只，存活率为60%。将losartan(美国Merk公司提供)溶于生理盐水中，实验组经胃管喂给药，每只15 mg/kg*d-1,每天1次，直至各实验终点, 对照组给于等量的生理盐水。
二、心功能的测定及标本收集
, 百拇医药 用2%戊巴比妥钠(35 mg/kg， ip)麻醉，气管插管行人工呼吸，股动脉插管监测血压，右颈总动脉插管经二尖瓣至左心室,检测血流动力学指标。处死假手术组(开胸术后第3 d) 和8组(心梗术后第3、7、14、42 d 4个时点)心梗大鼠，取出心脏。于二尖瓣下2 mm处垂直心脏长轴，做心室短轴切片，厚约2～3 mm, HE染色验证左室游离壁颜色苍区为心梗区。采用颗粒分析系统测量心梗区长度及左室周长，二者之比表示心梗面积大小，剔除心梗面积小于20%的大鼠，本实验的梗塞面积为35%±14%。分别称取左、右室重量后，将左室梗塞区、非梗塞区和右室心肌分装入冻存管，分别置于液氮中保存。
三、提取心肌组织及其总蛋白的测定
称取约25 mg冻存的梗塞区心肌组织，冰盐水冲洗3-4次后，将其孵育在2 mL提取物缓冲液中(10 mmol/L二甲胂酸钠，pH5.0, 0.15 mol/L NaCl，1 μmol/L ZnCl2, 20 mmol/L CaCl2, 1.5 mmol/L NaN3, 0.01% Triton)。于4℃持续振荡24 h, 收集上清液，更换新的提取液重复振荡24 h。将两次上清液混合后，加入1 mol/L Tris(pH 8) 将混合液的pH值滴定到7.5。4 ℃下, 通过透析袋将提取液浓缩至1.5 mL。采用福林酚法测定提取物中蛋白浓度[1]。
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四、酶谱法测定胶原酶的活性
参照Suresh等人1993年提供的方法[2]，将1 g/L明胶0.8 mL加入8%的聚丙烯酰胺混合物中[3]，使其终浓度达到0.7 g/L制成分离胶，作为胶原酶的底物[4]。将含30 μg蛋白的提取物与加样缓冲液(10% SDS，4%蔗糖，0.25 mol/L Tris-Cl， pH6.8， 0.1%溴酚蓝)以3∶1的比例混合但不加热，立即上样于5%的堆积胶。在4℃，采用美国Bio-Rad 公司的垂直电泳仪，使堆积胶电流保持在15 mA,分离胶电流为20 mA。约4-5 h,溴酚蓝接近底线后，将胶样剥离并浸泡在2.5% Triton中，室温摇荡30 min，其间更换1次洗脱液。然后将胶样浸泡在底物缓冲液(50 mmol/L Tris-Cl， pH8，5 mmol/L CaCl2， 0.02% W/V NaN3)中，在37℃下孵育过夜。取出胶样采用0.05%考马斯蓝R250染色30 min，脱色后经美国UVP凝胶成像仪扫描及分析处理，所得不同时点对照组和给药组54 kD的MMP-1和58 kD、62 kD的MMP-2泳带的光密度吸收值，经同一对照值(假手术后第3 d左室心肌胶原酶活性)校正后进行比较。
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五、氯氨T法测定胶原的含量[5]
取左、右室心肌各100 mg，冰浴中研碎，置60℃烤干，滴加6 mol/L盐酸(0.12 L/g干重)在105 ℃下消化样品16 h。通过UV-756MC紫外可见光分析仪测定羟脯氨酸含量。将分析纯度的L-羟脯氨酸溶于1 mmol/L盐酸制成40 mmol/L标准储液，绘制标准曲线，依据文献间质胶原平均包含13.4%羟脯氨酸，间质胶原浓度等于羟脯氨酸含量乘以7.46，结果以mg/g干重心肌表示。
所有数据均以
±s表示，采用未配对的t检验判定均数差异显著性。结 果
一、血液动力学测定结果(表1)
, http://www.100md.com 表1 心梗后给药组与对照组各实验时点血液动力学指标
Tab 1 The hemodynamic parameters at different timepoints of treated and control groups (
±s) Time(d)Group
n
3
7
14
42
AMI
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6
AMI+LOS
5
AMI
5
AMI+LOS
5
AMI
6
AMI+LOS
6
AMI
6
, 百拇医药
AMI+LOS
6
BPs(kPa)
17.3±0.7
17.2±3.0
16.0±1.5
14.7±2.1
14.7±1.6
12.2±2.2
18.6±0.8
16.6±1.5
BPd(kPa)
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12.7±1.3
11.6±3.6
11.8±1.8
11.5±0.2
10.1±1.4
8.7±2.4
14.5±1.1
11.0±1.7
MBP (kPa)
14.2±1.1
13.5±3.4
13.6±1.2
, 百拇医药
12.8±0.3
11.6±1.4
10.3±2.4
15.9±1.0
12.8±2.2
HR(/min)
352±13
355±15
318±11
333±23
327±19
343±23
, 百拇医药
374±18
394±8
LVSP(kPa)
13.90±2.30
12.50±1.40
13.7±1.9
13.5±3.2
14.1±0.9
15.9±1.1
14.6±3.4
16.3±1.9
LVDP(kPa)
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0.53±0.07
2.43±0.24* *
1.07±0.21
1.03±0.18
0.71±0.16
0.67±0.09
4.10±0.50
1.90±0.20
LVEDP(kPa)
0.91±0.37
2.67±0.27* *
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1.28±0.28
0.94±0.18*
1.53±0.14
0.92±0.09* *
4.40±0.18
2.70±0.30* *
+dp/dtmax
(kPa/s)
813.00±73.00
836.00±72.00
862.00±59.00
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949.00±87.00*
992.00±55.00
1123.00±67.00*
526.00±49.00
926.00±66.00*
-dp/dtmax
(kPa/s)
658.00±64.00
705.00±68.00
691.00±47.00
, 百拇医药
633.00±59.00
502.00±48.00
723.00±48.00
597.00±76.00
403.00±32.00
*P<0.05, * * P<0.01 vs AMI;AMI: control groups； AMI+LOS: treated groups.
心梗后第3 d用药组LVDP和LVEDP均明显高于对照组(P<0.01)。其后用药组LVEDP开始下降，第7 d明显低于对照组(P<0.05)，第14、42 d非常显著(P<0.01)。第7、14、42 d收缩压最大上升速度(dp/dtmax)明显大于对照组(P<0.05)。
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二、间质金属蛋白酶活性变化(图1)(图2)
Fig 1 The activity change of the MMPs :The absorptance dense of the MMPs lytic bands in zymographic gel are scaned by the UVP gel grab instrument.The figures are analysised and compared between the treated and the control in day 3, 7, 14, 42 after infarction.
±s. n= 5-6. * P<0.05 vs control.图1 间质金属蛋白酶活性变化图
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心肌间质金属蛋白酶MMP-1、MMP-2于心梗后第3 d高于假手术组4.5倍，第7 d高6.5倍,达高峰，然后开始下降，第14 d高2倍，第42 d高1.5倍。给losartan组心肌梗塞后间质金属蛋白酶活性，比同时点对照组MMP-1低33%，MMP-2低50%。
三、心梗对照组和给药组不同时间体重及心重改变(表2)
两组体重差别无显著。左心室重量在第14、42 d给药组非常明显低于对照组，(P<0.01)。右室重量在第7 d给药组显著低于对照组(P<0.05)。给药组左室重量/体重(LVW/BW)在14、42 d明显低于对照组 (P<0.01)，右室重量/体重(RVW/BW)在第7 d、14 d均明显或非常明显低于对照组(P<0.05, P<0.01)。
Fig 2 Cardiac collagenases and the effects of Losartan on infarcted heart: Zymograghy of infarcted myocardium after operation at day 3,day7,day 14,day 42 (Lane 1,3,5,10), and of treated group of day 3, day7,day14,day42 (Lane2,4,9,11 ), and of sham-operated rat at day3(lane 6,8). Standard low marker was run in the right-hand(Lane7,12).Gelatinolytic activity were taken to represent respective cardiac collagenase 54 kD(MMP-1) and 58 kD、62 kD(MMP-2).
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图2 心肌间质金属蛋白酶
表2 心梗后给药组与对照组不同时间点体重和心脏重量
Tab 2 The body and heart weight of treated and control groups after myocardic infarction(mg/kg.
±s) Time(d)Group
n
3
7
14
42
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AMI
6
AMI+LOS
5
AMI
5
AMI+LOS
5
AMI
6
AMI+LOS
6
AMI
, 百拇医药
6
AMI+LOS
6
BW
235.00±8.00
235.00±13.00
266.00±9.00
263.00±10.00
295.00±7.00
292.00±14.00
411.00±17.00
411.00±17.00
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LVW
0.57±0.03
0.56±0.04
0.65±0.04
0.63±0.07
0.78±0.03
0.67±0.04* *
0.89±0.03
0.70±0.02* *
RVW
0.18±0.01
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0.19±0.02
0.20±0.02
0.16±0.03*
0.26±0.04
0.19±0.03
0.30±0.04
0.28±0.03
LVW/BW
2.43±0.06
2.36±0.07
2.43±0.06
, 百拇医药 2.35±0.07
2.65±0.09
2.43±0.09* *
2.16±0.06
1.70±0.04* *
(mg/kg)
RVW/BW
0.77±0.04
0.79±0.04
0.75±0.04
0.61±0.10*
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0.87±0.10
0.64±0.08* *
0.73±0.07
0.68±0.10
(mg/kg)
* P<0.05, * * P<0.01 vs AMI; AMI: control group; AMI+LOS: treated group.表3 心梗后给药组与对照组不同时点梗塞区和右室胶原含量
Tab 3 The collagen concentration of infarcted and noninfarcted zones of the treated
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and the control at different timepoints after myocardiac infarction(
±s. mg/g d.co.) Time(d)Group
n
3
7
14
42
AMI
AMI+LOS
AMI
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AMI+LOS
AMI
AMI+LOS
AMI
AMI+LOS
< 6
5
5
5
6
6
6
6
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IZ
14.58±1.15
13.12±1.83
26.85±2.93
23.10±2.67
37.32±2.64
31.84±4.00*
57.18±3.13
46.78±2.58* *
NIZ
8.73±0.46
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8.41±0.41
8.79±0.67
8.59±0.59
9.21±1.02
8.77±0.80
15.77±1.80
11.65±1.96
*P<0.05,* * P<0.01 vs NIZ; IZ:infarcted zone; NIZ:non-infarcted zone; AMI:control; AMI+LOS; treated group.
四、梗塞区和非梗塞区胶原密度的变化(表3)
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给药组梗塞区(infarcted zone,IZ)和非梗塞区(non-infarcted zone,NIZ)胶原含量在第14、42 d显著低于对照组(P<0.05)。讨 论
心肌梗塞后的愈合是一个动态过程。很多实验显示复制大鼠心梗模型后，其血液和心肌组织中肾素—血管紧张素—醛固酮系统(RAAS)被激活，直接引起心脏胶原合成代谢增强,胶原沉积。另一方面,心肌梗塞后胶原酶(MMP-1)被激活，降解心肌间质胶原蛋白肽链的三螺旋结构，在距肽链C末端1/4处将其分解为两个片段后，激活的明胶酶(MMP-2、MMP-9)等参与完成其后的非特异分解代谢。本实验通过复制大鼠心肌梗塞模型，进而采用酶谱法证明Jack等报告的心肌梗塞后MMPs活性升高，并呈现动态变化[6]。但是发现MMPs的活性在第14 d虽然较第7 d低，却未完全回降至正常，在第42 d仍高于假手术组，这不同于Jack 的结论。仔细对照二者所采用的方法步骤，发现在心肌组织提取时本实验采用的是二甲胂酸钠而后者采用的是二甲胂酸；在酶谱电泳时分离胶浓度及底物明胶的浓度略有不同；此外提取物浓缩方法不同。以上可能是造成二者结果不同的原因。但是本结果与Ian等[7]的研究结果相似，这提示心梗晚期MMPs仍参与心肌间质代谢。
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激活的胶原酶降解心肌间质，可导致心肌细胞的滑动、拉长(离心性肥大),进一步导致心脏支持结构的缺失、组织结构的变形、坚硬度的降低，使心室壁变薄、心脏扩张甚至破裂。尽管许多学者[6，8]推测胶原降解在心脏扩张、左室功能不全及充血性心功衰竭方面起着一定作用，但是尚无研究可以证明这些假设。MMPs的有害作用主要围绕其控制胶原的降解，因此有两条途径可降低胶原分解。第一，抑制MMPs的合成及激活；第二，抑制已激活的MMPs。本实验根据AT1受体拮抗剂可以减低心梗面积、非梗塞区胶原含量和AngII受体密度[9]。给予心梗大鼠losartan，发现它不仅可以降低心梗后中晚期(第14 d后)梗塞区胶原含量，抑制心梗后心室肥厚。而且明显降低MMPs的活性，对心肌有保护作用。同时发现，losartan虽使心梗后早期(第3 d)大鼠左心室舒张功能进一步降低，但是显著改善心梗后中晚期(第7 d后)左室舒张、收缩功能。这与近来临床发现的过早应用ACEI类药物会加重心梗后心功能不全现象相符合，提示应在心梗超急期后用药更有利于心功能恢复。但是本实验无法回答心肌梗塞后AT1受体拮抗剂的适应症、时机和剂量，这有待于进一步的临床研究。
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[参 考 文 献]
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[收稿日期] 1999-10-18 [修回日期] 2000-04-03, 百拇医药