荷S180小鼠血浆ET、NO水平与瘤重变化及相关研究
作者：郭辉 杨惠玲
单位：郭辉(中山医科大学病理生理学教研室，广东 广州 510089)；杨惠玲(中山医科大学病理生理学教研室，广东 广州 510089 E-mail:HLYang@GZSums.edu.cn)
关键词：肉瘤180；一氧化氮；内皮缩血管肽类；小鼠
中国病理生理杂志000907
[摘 要] 目的和方法：复制荷S180小鼠模型，采用放射免疫均相竞争法和硝酸还原酶法测定不同病期(荷瘤5 d、10 d和15 d)的小鼠血浆中ET和NO-2/NO-3水平，称取瘤重，在观察三者的变化规律基础上，探讨不同病期荷S180小鼠血浆ET、NO水平的变化，及其与肿瘤发展的关系。结果：不同病期荷瘤鼠血浆ET、NO-2/NO-3均显著高于对照组(P<0.05)。随病期延长，瘤重及NO-2/NO-3水平逐渐升高(P<0.05)，ET水平也有上升趋势。NO-2/NO-3水平与瘤重呈正相关(r=0.955，P<0.05)。NO-2/NO-3与ET的比值呈先下降后上升的变化。结论：ET、NO与S180肉瘤的发生发展有关，二者在肿瘤发展中可能有相互促进作用。
, 百拇医药
[中图分类号] R730.23 [文献标识码] A
[文章编号] 1000-4718(2000)09-0797-03
Study on changes of ET、NO level and tumor weight of mice
bearing S180 model and their relationships
GUO Hui， YANG Hui-ling
(Department of Pathophysiology, Sun Yat-Sen University of Medical Sciences,Guangzhou 510089, China)
, 百拇医药 [Abstract] AIM: To approach the changes of ET and NO levels of mice bearing sarcoma 180 (S180) during different period(5、10 and 15 days) and the relationship between ET、NO and tumor's development. METHODS: Adopting mice bearing S180 as the models, the levels of ET and NO-2/NO-3 in serum were detected, and the weight of isolated tumors was measured. On the basis of the regulation of these changes, their relationships were explored. RESULTS: The levels of ET and NO-2/NO-3 of mice bearing S180 were higher than that of the control group (not bearing tumor) (P<0.05). Along with the development of the tumors, the levels of NO-2/NO-3and tumors weight both increased (P<0.05). ET also had an increasing tendency. There was a positive correlation between the level of NO-2/NO-3 and tumor weight (r=0.995, P<0.05). Ratio value of (NO-2/NO-3)/ET decreased at first and then increased. CONCLUSION: ET and NO have links with the development of S180. There may be cooperation between ET and NO during the development of tumor.
, 百拇医药
[MeSH] Sarcoma 180; Nitric oxide; Endothelins; Mice
内皮素(endothelin，ET)与一氧化氮(nitric oxide，NO)是一对血管收缩和舒张的调节因子[1，2]。近年来的研究表明二者对肿瘤发生发展也具有一定的作用。ET具有生长因子的活性，可与其他因子共同调节肿瘤的生长[3]，而NO亦在肿瘤生物学方面具有多重效应[4]。ET、NO与肿瘤发生发展的关系及在肿瘤发展中两者的相互关系，目前尚未见有关报道。本实验以荷S180 小鼠为模型，通过测定不同病期荷瘤鼠血浆中ET和NO代谢产物NO-2/NO-3水平，并称取瘤重，在观察各项指标变化规律的基础上，研究ET、NO与肿瘤发生发展的相互关系，探讨其意义。
材 料 和 方 法
, 百拇医药
一、实验动物
昆明杂交系小鼠44只，由本校实验动物中心提供，体重18～22 g/只，雌雄兼用。随机分为4组(见表1)。(分组时考虑到荷瘤10 d和15 d组可能有动物死亡情况，将此二组动物数增加为12只，实验结束无动物死亡)
二、肿瘤模型复制
S180瘤株购自本校肿瘤防治研究所，腹水型传代，取接种6～8 d后的腹水，生理盐水稀释，制备瘤细胞悬液，浓度为2×109/L。3个种瘤组分别每隔5 d于右颈背部皮下接种瘤细胞悬液，0.2 mL/只。
三、样品制备
实验第16 d从小鼠眼眶取血，离心后取血浆。采血后处死小鼠，剥离肿瘤，称重。
, http://www.100md.com 四、血浆ET水平测定
ET放免测定试剂盒购自北京东亚放免试剂研究所。按操作说明加样，均相竞争法测定ET水平，XH-6010 γ计数仪计cpm数，根据标准曲线计算ET浓度。
五、血浆NO-2/NO-3水平测定
NO-2/NO-3为NO代谢后产物，其浓度间接反映NO的水平。NO-2/NO-3测试盒购自南京建成生物工程研究所，按说明加样，硝酸还原酶法测定，721分光光度计于530nm波长测定OD值，计算NO-2/NO-3浓度。
, 百拇医药
六、统计学处理
数据以
±s表示，采用SAS统计软件进行完全随机设计方差分析及直线相关分析。
结 果
一、瘤重
结果表明， 瘤重随病程延长而增加(P<0.05)。(见表1，图1)
表1 不同病期荷S180小鼠ET、NO-2/NO-3及瘤重的变化
Tab 1 Changes of ET、NO-2/NO-3 and tumor weight of mice bearing S180 in different period (±s)
, 百拇医药
Days ofbearing tumor
n
Tumor weight(g)
ET(ng/L)
NO-2/NO-3(μmol/L)
(NO-2/NO-3)/ET
(1)
No tumor
10
, 百拇医药 0
48.56±7.77
68.75±5.71
1.5
(2)
5
10
0.1560±0.1303*
68.25±5.35*
67.18±3.15*
1.0
(3)
, http://www.100md.com
10
12
0.5208±0.3844*△
72.23±8.24
83.88±12.26*△
1.1
(4)
15
12
0.8492±0.5193*△#
76.91±12.09*
, http://www.100md.com
113.03±8.71*△#
1.5
* P<0.05 vs group(1)；△ P<0.05 vs group(2)；# P<0.05 vs group(3).
Fig 1 The changes of tumor weight, ET and NO-2/NO-3 of the mice bearing S180 during different period.
图1 不同病期荷瘤鼠瘤重、ET及NO-2/NO-3的变化
, 百拇医药
二、血浆ET水平
结果表明，各病期荷瘤鼠血浆ET水平均高于正常组(P<0.05)。而且随病程延长，ET水平有升高趋势。(见表1，图1)
三、血浆NO-2/NO-3水平；结果表明，荷瘤各期小鼠血浆NO-2/NO-3水平均明显高于正常组(P<0.05)，且荷瘤15 d组与10 d及5 d组比较，均有显著升高(P<0.05)。(见表1，图1)
四、瘤重与血浆ET及NO-2/NO-3水平的相关分析
通过直线回归分析，结果发现NO-2/NO-3水平与瘤重呈正相关(r=0.955，P<0.05)，说明血浆NO水平与肿瘤的发展有关。
, 百拇医药
讨 论
近年来的研究发现ET、NO与肿瘤的发生发展有关。ET以自分泌和旁分泌的方式调节肿瘤细胞的生长[3]。NO除了作为活化巨噬细胞杀伤肿瘤的毒性效应分子外，也有促进肿瘤血管生成，有助于肿瘤生长和转移的作用，不同的效应与其在肿瘤组织中浓度有关[4，5]。本实验结果显示荷S180小鼠血浆ET和NO-2/NO-3水平随肿瘤病期的发展而增高，与我们前期的研究结果一致[6]，而且NO-2/NO-3水平与瘤重有正相关。
荷瘤鼠ET和NO水平升高的机制可能有：肿瘤细胞释放ET，作用于肿瘤组织及其间质血管，通过正反馈途径促进ET的生成[6]。实体瘤发展伴随血管生成过程，新生的血管内皮细胞可产生更多的ET。肿瘤细胞高表达iNOS，肿瘤环境中一些细胞因子(如IFN-γ)可诱导iNOS的活化，NO的生成增加[5，7]。ET对NO也有促进作用，ET与受体ETBR结合后，增加[Ca2+]内流，激活cNOS。导致NO合成增多[8]。本实验结果发现随肿瘤发展，ET和NO-2/NO-3水平均有增高，但以何者升高为主？笔者以对照组(NO-2/NO-3)/ET比值为基点，发现荷瘤组的比值变化为先下降后上升，荷瘤15天与对照组相同水平，说明肿瘤前期可能以ET的增加为主，由于ET对NO的促进作用，后期NO水平显著升高，两者在高水平上再次处于平衡，也提示两者在肿瘤发展过程中有协同作用。
, 百拇医药
ET和NO在肿瘤发生发展中的作用比较复杂。两者除了通过作用于宿主血管以调节肿瘤的血液供应外，也对肿瘤细胞及其间质中血管内皮细胞以及一些免疫细胞发挥作用。许多肿瘤组织均有ET及其受体的表达，而肿瘤间质的血管和基质也有ET的产生[3，9]，ET与受体结合后可激活核内细胞增殖的相关基因，以自分泌和旁分泌的方式促进肿瘤细胞的增殖[3]。NO在肿瘤生物学中具有多重效应，高水平的NO可介导巨噬细胞的细胞毒作用，而低水平则对肿瘤血管生成有促进作用[4]。NO可抑制T细胞的增殖，降低机体对肿瘤细胞的免疫效应[10]。另外NO作为信号分子，介导肌动蛋白的解聚，抑制单核细胞的变形、游走、浸润和播散[3]，有利于肿瘤的生长。
肿瘤细胞、间质细胞以及浸润的免疫细胞之间相互影响，形成肿瘤生长的微环境。肿瘤环境中产生各种因子以维持肿瘤自身的发展平衡，例如本文所探讨的ET和NO。肿瘤如何根据自身需要进行环境因子的调控，如ET与NO的相互作用，以及不同水平的NO 对肿瘤不同作用的机制，需进行深入探讨。机体大环境中(如血浆)这些因子的变化机制也需进一步研究。
, 百拇医药
[基金项目] 国家自然科学基金(No. 39370781)；广东省自然科学基金资助(No. 920462)
[参 考 文 献]
[1] Yanagisawa M, Kurihara H, Tomobe Y, et al. A novel patent vascustrictor peptide by vascular endothelial cells[J]. Nature, 1988,332(6163): 411-415.
[2] Simonson MS, Dunn MJ. Endothelins: a family of regulatory peptides. State-of-the art lecture [J]. Hypertension, 1991,17(6pt2): 856-863.
[3] Shichiri M, Hirata Y, Nakajima T, et al. Endothelin-1 is an autocrine/paracrine growth factor for human cancer cell lines[J]. J Clin Invest, 1991,87(5):1867-1871.
, http://www.100md.com
[4] 王立明, 郑 灵. 一氧化氮对肿瘤细胞生长的影响[J]. 国外医学.临床生物化学与检验学分册， 1997,18(6)： 266-269.
[5] Orucevic A, Bechberger J, Green AM, et al. Nitric oxide production by murine mammany adenocarcinoma cells promotes tumor cell invasiveness[J]. Int J Cancer, 1999, 81(6):889-896.
[6] 杨惠玲, 郭禹标, 马志楷, 等. 小鼠S180血浆内皮素含量和瘤重变化的相关研究[J]. 中国肿瘤临床， 1996,23(suppl):1-2.
[7] Thomson LL, Miles DW, Happerfield L, et al. Nitric oxide synthase activity, in human breast cancer[J]. Br J Cancer. 1995,72(1):41-44.
, http://www.100md.com
[8] Srivastava KD, Magazine HI. Thrombin receptor inhibits monocyte spreading by induction of ET(B)R coupled nitric oxide release[J]. J Immunol, 1998,161(9):5093-5044.
[9] Zhao YD, Springall DR, Hamid Q, et al. Localization and characterization of endothelin-1 receptor binding in the blood vessels of human pulmonary tumors[J]. J Cardiovasc Pharmacol, 1995,26(suppl3): s341-s345.
[10] Lejeune P, Lagadec P, Onier N, et al. Nitric oxide involvement in tumor-induced immunosuppression[J]. J Immunol, 1994,152(10):5077-5083.
[收稿日期] 2000-01-28 [修回日期] 2000-06-22, 百拇医药
单位：郭辉(中山医科大学病理生理学教研室，广东 广州 510089)；杨惠玲(中山医科大学病理生理学教研室，广东 广州 510089 E-mail:HLYang@GZSums.edu.cn)
关键词：肉瘤180；一氧化氮；内皮缩血管肽类；小鼠
中国病理生理杂志000907
[摘 要] 目的和方法：复制荷S180小鼠模型，采用放射免疫均相竞争法和硝酸还原酶法测定不同病期(荷瘤5 d、10 d和15 d)的小鼠血浆中ET和NO-2/NO-3水平，称取瘤重，在观察三者的变化规律基础上，探讨不同病期荷S180小鼠血浆ET、NO水平的变化，及其与肿瘤发展的关系。结果：不同病期荷瘤鼠血浆ET、NO-2/NO-3均显著高于对照组(P<0.05)。随病期延长，瘤重及NO-2/NO-3水平逐渐升高(P<0.05)，ET水平也有上升趋势。NO-2/NO-3水平与瘤重呈正相关(r=0.955，P<0.05)。NO-2/NO-3与ET的比值呈先下降后上升的变化。结论：ET、NO与S180肉瘤的发生发展有关，二者在肿瘤发展中可能有相互促进作用。
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[中图分类号] R730.23 [文献标识码] A
[文章编号] 1000-4718(2000)09-0797-03
Study on changes of ET、NO level and tumor weight of mice
bearing S180 model and their relationships
GUO Hui， YANG Hui-ling
(Department of Pathophysiology, Sun Yat-Sen University of Medical Sciences,Guangzhou 510089, China)
, 百拇医药 [Abstract] AIM: To approach the changes of ET and NO levels of mice bearing sarcoma 180 (S180) during different period(5、10 and 15 days) and the relationship between ET、NO and tumor's development. METHODS: Adopting mice bearing S180 as the models, the levels of ET and NO-2/NO-3 in serum were detected, and the weight of isolated tumors was measured. On the basis of the regulation of these changes, their relationships were explored. RESULTS: The levels of ET and NO-2/NO-3 of mice bearing S180 were higher than that of the control group (not bearing tumor) (P<0.05). Along with the development of the tumors, the levels of NO-2/NO-3and tumors weight both increased (P<0.05). ET also had an increasing tendency. There was a positive correlation between the level of NO-2/NO-3 and tumor weight (r=0.995, P<0.05). Ratio value of (NO-2/NO-3)/ET decreased at first and then increased. CONCLUSION: ET and NO have links with the development of S180. There may be cooperation between ET and NO during the development of tumor.
, 百拇医药
[MeSH] Sarcoma 180; Nitric oxide; Endothelins; Mice
内皮素(endothelin，ET)与一氧化氮(nitric oxide，NO)是一对血管收缩和舒张的调节因子[1，2]。近年来的研究表明二者对肿瘤发生发展也具有一定的作用。ET具有生长因子的活性，可与其他因子共同调节肿瘤的生长[3]，而NO亦在肿瘤生物学方面具有多重效应[4]。ET、NO与肿瘤发生发展的关系及在肿瘤发展中两者的相互关系，目前尚未见有关报道。本实验以荷S180 小鼠为模型，通过测定不同病期荷瘤鼠血浆中ET和NO代谢产物NO-2/NO-3水平，并称取瘤重，在观察各项指标变化规律的基础上，研究ET、NO与肿瘤发生发展的相互关系，探讨其意义。
材 料 和 方 法
, 百拇医药
一、实验动物
昆明杂交系小鼠44只，由本校实验动物中心提供，体重18～22 g/只，雌雄兼用。随机分为4组(见表1)。(分组时考虑到荷瘤10 d和15 d组可能有动物死亡情况，将此二组动物数增加为12只，实验结束无动物死亡)
二、肿瘤模型复制
S180瘤株购自本校肿瘤防治研究所，腹水型传代，取接种6～8 d后的腹水，生理盐水稀释，制备瘤细胞悬液，浓度为2×109/L。3个种瘤组分别每隔5 d于右颈背部皮下接种瘤细胞悬液，0.2 mL/只。
三、样品制备
实验第16 d从小鼠眼眶取血，离心后取血浆。采血后处死小鼠，剥离肿瘤，称重。
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ET放免测定试剂盒购自北京东亚放免试剂研究所。按操作说明加样，均相竞争法测定ET水平，XH-6010 γ计数仪计cpm数，根据标准曲线计算ET浓度。
五、血浆NO-2/NO-3水平测定
NO-2/NO-3为NO代谢后产物，其浓度间接反映NO的水平。NO-2/NO-3测试盒购自南京建成生物工程研究所，按说明加样，硝酸还原酶法测定，721分光光度计于530nm波长测定OD值，计算NO-2/NO-3浓度。
, 百拇医药
六、统计学处理
数据以
±s表示，采用SAS统计软件进行完全随机设计方差分析及直线相关分析。结 果
一、瘤重
结果表明， 瘤重随病程延长而增加(P<0.05)。(见表1，图1)
表1 不同病期荷S180小鼠ET、NO-2/NO-3及瘤重的变化
Tab 1 Changes of ET、NO-2/NO-3 and tumor weight of mice bearing S180 in different period (
±s), 百拇医药
Days ofbearing tumor
n
Tumor weight(g)
ET(ng/L)
NO-2/NO-3(μmol/L)
(NO-2/NO-3)/ET
(1)
No tumor
10
, 百拇医药 0
48.56±7.77
68.75±5.71
1.5
(2)
5
10
0.1560±0.1303*
68.25±5.35*
67.18±3.15*
1.0
(3)
, http://www.100md.com
10
12
0.5208±0.3844*△
72.23±8.24
83.88±12.26*△
1.1
(4)
15
12
0.8492±0.5193*△#
76.91±12.09*
, http://www.100md.com
113.03±8.71*△#
1.5
* P<0.05 vs group(1)；△ P<0.05 vs group(2)；# P<0.05 vs group(3).
Fig 1 The changes of tumor weight, ET and NO-2/NO-3 of the mice bearing S180 during different period.
图1 不同病期荷瘤鼠瘤重、ET及NO-2/NO-3的变化
, 百拇医药
二、血浆ET水平
结果表明，各病期荷瘤鼠血浆ET水平均高于正常组(P<0.05)。而且随病程延长，ET水平有升高趋势。(见表1，图1)
三、血浆NO-2/NO-3水平；结果表明，荷瘤各期小鼠血浆NO-2/NO-3水平均明显高于正常组(P<0.05)，且荷瘤15 d组与10 d及5 d组比较，均有显著升高(P<0.05)。(见表1，图1)
四、瘤重与血浆ET及NO-2/NO-3水平的相关分析
通过直线回归分析，结果发现NO-2/NO-3水平与瘤重呈正相关(r=0.955，P<0.05)，说明血浆NO水平与肿瘤的发展有关。
, 百拇医药
讨 论
近年来的研究发现ET、NO与肿瘤的发生发展有关。ET以自分泌和旁分泌的方式调节肿瘤细胞的生长[3]。NO除了作为活化巨噬细胞杀伤肿瘤的毒性效应分子外，也有促进肿瘤血管生成，有助于肿瘤生长和转移的作用，不同的效应与其在肿瘤组织中浓度有关[4，5]。本实验结果显示荷S180小鼠血浆ET和NO-2/NO-3水平随肿瘤病期的发展而增高，与我们前期的研究结果一致[6]，而且NO-2/NO-3水平与瘤重有正相关。
荷瘤鼠ET和NO水平升高的机制可能有：肿瘤细胞释放ET，作用于肿瘤组织及其间质血管，通过正反馈途径促进ET的生成[6]。实体瘤发展伴随血管生成过程，新生的血管内皮细胞可产生更多的ET。肿瘤细胞高表达iNOS，肿瘤环境中一些细胞因子(如IFN-γ)可诱导iNOS的活化，NO的生成增加[5，7]。ET对NO也有促进作用，ET与受体ETBR结合后，增加[Ca2+]内流，激活cNOS。导致NO合成增多[8]。本实验结果发现随肿瘤发展，ET和NO-2/NO-3水平均有增高，但以何者升高为主？笔者以对照组(NO-2/NO-3)/ET比值为基点，发现荷瘤组的比值变化为先下降后上升，荷瘤15天与对照组相同水平，说明肿瘤前期可能以ET的增加为主，由于ET对NO的促进作用，后期NO水平显著升高，两者在高水平上再次处于平衡，也提示两者在肿瘤发展过程中有协同作用。
, 百拇医药
ET和NO在肿瘤发生发展中的作用比较复杂。两者除了通过作用于宿主血管以调节肿瘤的血液供应外，也对肿瘤细胞及其间质中血管内皮细胞以及一些免疫细胞发挥作用。许多肿瘤组织均有ET及其受体的表达，而肿瘤间质的血管和基质也有ET的产生[3，9]，ET与受体结合后可激活核内细胞增殖的相关基因，以自分泌和旁分泌的方式促进肿瘤细胞的增殖[3]。NO在肿瘤生物学中具有多重效应，高水平的NO可介导巨噬细胞的细胞毒作用，而低水平则对肿瘤血管生成有促进作用[4]。NO可抑制T细胞的增殖，降低机体对肿瘤细胞的免疫效应[10]。另外NO作为信号分子，介导肌动蛋白的解聚，抑制单核细胞的变形、游走、浸润和播散[3]，有利于肿瘤的生长。
肿瘤细胞、间质细胞以及浸润的免疫细胞之间相互影响，形成肿瘤生长的微环境。肿瘤环境中产生各种因子以维持肿瘤自身的发展平衡，例如本文所探讨的ET和NO。肿瘤如何根据自身需要进行环境因子的调控，如ET与NO的相互作用，以及不同水平的NO 对肿瘤不同作用的机制，需进行深入探讨。机体大环境中(如血浆)这些因子的变化机制也需进一步研究。
, 百拇医药
[基金项目] 国家自然科学基金(No. 39370781)；广东省自然科学基金资助(No. 920462)
[参 考 文 献]
[1] Yanagisawa M, Kurihara H, Tomobe Y, et al. A novel patent vascustrictor peptide by vascular endothelial cells[J]. Nature, 1988,332(6163): 411-415.
[2] Simonson MS, Dunn MJ. Endothelins: a family of regulatory peptides. State-of-the art lecture [J]. Hypertension, 1991,17(6pt2): 856-863.
[3] Shichiri M, Hirata Y, Nakajima T, et al. Endothelin-1 is an autocrine/paracrine growth factor for human cancer cell lines[J]. J Clin Invest, 1991,87(5):1867-1871.
, http://www.100md.com
[4] 王立明, 郑 灵. 一氧化氮对肿瘤细胞生长的影响[J]. 国外医学.临床生物化学与检验学分册， 1997,18(6)： 266-269.
[5] Orucevic A, Bechberger J, Green AM, et al. Nitric oxide production by murine mammany adenocarcinoma cells promotes tumor cell invasiveness[J]. Int J Cancer, 1999, 81(6):889-896.
[6] 杨惠玲, 郭禹标, 马志楷, 等. 小鼠S180血浆内皮素含量和瘤重变化的相关研究[J]. 中国肿瘤临床， 1996,23(suppl):1-2.
[7] Thomson LL, Miles DW, Happerfield L, et al. Nitric oxide synthase activity, in human breast cancer[J]. Br J Cancer. 1995,72(1):41-44.
, http://www.100md.com
[8] Srivastava KD, Magazine HI. Thrombin receptor inhibits monocyte spreading by induction of ET(B)R coupled nitric oxide release[J]. J Immunol, 1998,161(9):5093-5044.
[9] Zhao YD, Springall DR, Hamid Q, et al. Localization and characterization of endothelin-1 receptor binding in the blood vessels of human pulmonary tumors[J]. J Cardiovasc Pharmacol, 1995,26(suppl3): s341-s345.
[10] Lejeune P, Lagadec P, Onier N, et al. Nitric oxide involvement in tumor-induced immunosuppression[J]. J Immunol, 1994,152(10):5077-5083.
[收稿日期] 2000-01-28 [修回日期] 2000-06-22, 百拇医药