反义阻断hREV3基因表达抑制MNNG诱发的非定标性突变的发生率
作者：宋韬 余应年 徐方
单位：浙江大学医学院病理生理教研室，浙江 杭州 310031
关键词：
中国病理生理杂志0010178
目的：REV3基因是酵母中发现的具有跨损伤修复活性的DNA聚合酶，参与真菌易误性复制后修复通路。本研究采用反义核酸技术建立hREV3基因表达阻断的人胚肾细胞系，研究它与非定标突变形成的关系。方法：1.hREV3基因片段从pBS-hREV3反向重组入载体pMAMneo-amp构建真核反义诱导表达质粒。2.重组质粒转染HEK293细胞，G418全培养基筛选建立hREV3基因表达阻断细胞系。3.细胞系生长速率及MNNG敏感性检测：以hREV3基因表达反义阻断细胞系为实验组，转染有空载体的细胞系以及母本细胞系为对照组，分别根据计数结果计算细胞群体培增时间(TD)；作MNNG浓度对相对存活细胞数的剂量效应曲线进行直线回归并分别计算抑制细胞存活的半数抑制浓度(IC50)。4.MNNG诱发细胞系非定标突变发生率的测定：5×105密度接种培养细胞24 h，地塞米松(10 μmol/L)作用6 h诱导反义表达，随后分别以含0.2 μmol/L MNNG和同体积DMSO的DMEM培养基处理2.5 h，换新鲜全培养基培养12 h，瞬时转染穿梭粒pZ189并复制48 h，Hirt氏法回收，DpnI内切酶除去未在细胞中复制的质粒，然后转化大肠杆菌MBM7070，检出突变子，计算非定标突变率，采用χ2检验进行统计分析。结果：经酶切鉴定，获得真核诱导表达重组体pMAMneo-amp-hREV3；并获得细胞系293-pMANneo-amp-hREV3(简作293-M-hREV3)以及转染空载体对照的细胞系293-pMANneo-amp(简作293-M)；测得细胞系之间生长速率无明显差异，细胞系293，293-M，293-M-hREV3的TD值均为1.3。反义阻断细胞系对MNNG的细胞毒作用较母本293细胞为敏感，293，293-M，293-M-hREV3细胞系IC50的95%可信区间分别为0.28-0.20 μM,0.23-0.15 μM，0.13-0.07 μM；hREV3基因反义阻断可明显降低MNNG诱发HEK293细胞系非定标性突变的发生，经卡方检验存在明显差异(P<0.025)，细胞系293，293-M，293-M-hREV3由0.2 μmol/L MNNG诱发的非定标突变率分别为7.37×10-4，5.81×10-4，1.52×10-4；溶剂对照组的非定标突变发生率分别为1.26×10-4，1.30×10-4，2.29×10-4。结论：hREV3基因的编码产物非细胞生长所必需而可能在细胞DNA损伤修复中起作用与非定标突变发生、遗传不稳定形成有重要关系。
国家自然科学基金重点项目(No.39830210)资助, 百拇医药
单位：浙江大学医学院病理生理教研室，浙江 杭州 310031
关键词：
中国病理生理杂志0010178
目的：REV3基因是酵母中发现的具有跨损伤修复活性的DNA聚合酶，参与真菌易误性复制后修复通路。本研究采用反义核酸技术建立hREV3基因表达阻断的人胚肾细胞系，研究它与非定标突变形成的关系。方法：1.hREV3基因片段从pBS-hREV3反向重组入载体pMAMneo-amp构建真核反义诱导表达质粒。2.重组质粒转染HEK293细胞，G418全培养基筛选建立hREV3基因表达阻断细胞系。3.细胞系生长速率及MNNG敏感性检测：以hREV3基因表达反义阻断细胞系为实验组，转染有空载体的细胞系以及母本细胞系为对照组，分别根据计数结果计算细胞群体培增时间(TD)；作MNNG浓度对相对存活细胞数的剂量效应曲线进行直线回归并分别计算抑制细胞存活的半数抑制浓度(IC50)。4.MNNG诱发细胞系非定标突变发生率的测定：5×105密度接种培养细胞24 h，地塞米松(10 μmol/L)作用6 h诱导反义表达，随后分别以含0.2 μmol/L MNNG和同体积DMSO的DMEM培养基处理2.5 h，换新鲜全培养基培养12 h，瞬时转染穿梭粒pZ189并复制48 h，Hirt氏法回收，DpnI内切酶除去未在细胞中复制的质粒，然后转化大肠杆菌MBM7070，检出突变子，计算非定标突变率，采用χ2检验进行统计分析。结果：经酶切鉴定，获得真核诱导表达重组体pMAMneo-amp-hREV3；并获得细胞系293-pMANneo-amp-hREV3(简作293-M-hREV3)以及转染空载体对照的细胞系293-pMANneo-amp(简作293-M)；测得细胞系之间生长速率无明显差异，细胞系293，293-M，293-M-hREV3的TD值均为1.3。反义阻断细胞系对MNNG的细胞毒作用较母本293细胞为敏感，293，293-M，293-M-hREV3细胞系IC50的95%可信区间分别为0.28-0.20 μM,0.23-0.15 μM，0.13-0.07 μM；hREV3基因反义阻断可明显降低MNNG诱发HEK293细胞系非定标性突变的发生，经卡方检验存在明显差异(P<0.025)，细胞系293，293-M，293-M-hREV3由0.2 μmol/L MNNG诱发的非定标突变率分别为7.37×10-4，5.81×10-4，1.52×10-4；溶剂对照组的非定标突变发生率分别为1.26×10-4，1.30×10-4，2.29×10-4。结论：hREV3基因的编码产物非细胞生长所必需而可能在细胞DNA损伤修复中起作用与非定标突变发生、遗传不稳定形成有重要关系。
国家自然科学基金重点项目(No.39830210)资助, 百拇医药