筛选转化生长因子诱导血管外膜成纤维细胞表型转化的差异片段
作者：高平进 朱鼎良 赵涵芳 徐洪
单位：高平进 朱鼎良(上海第二医科大学附属瑞金医院上海市高血压研究所，上海 200025)；赵涵芳 徐洪(上海第二医科大学生化教研室)
关键词：
中国病理生理杂志0010133
目的：血管外膜参与血管重塑的病变基础是细胞表型转化，其显著特征之一是外膜成纤维细胞(AF)被迅速激活并转化为肌成纤维细胞(MF)，后者兼有AF及平滑肌细胞的双重功能特性，增生并迁移至中膜及内膜。本研究应用差别显示聚合酶链反应(DD-PCR)技术筛选2种表型细胞间差别表达基因。方法：1.采用传统贴片法体外培养WKY大鼠胸主动脉外膜获AF，再用TGFβ1(20 ng/mL)处理AF24 h获MF。2.用免疫细胞化学分别检测AF及MF 2种表型细胞内α-SM肌动蛋白(αSM-actin)含量。3. 用透射电镜分别观察AF及MF 2种表型细胞超微结构。4.分别提取AF及MF 2种表型细胞的RNA，应用Beckman公司差异显示试剂盒3’末端12个锚定引物合成cDNA第一链，分别与5’末端4个随机引物进行PCR扩增。扩增产物加荧光染料经聚丙烯凝胶电泳及荧光成像系统扫描显示差异片段。切割差异片段凝胶，再扩增，回收纯化扩增产物，连接到pMD18-T载体，转化到JM109感受态细胞中扩增。经平板筛选单克隆，扩增后抽提质粒DNA。5.应用377DNA自动测序仪，对纯化后的克隆质粒进行序列分析，再与Genbank已知序列进行同源性比较。结果：αSM-actin免疫细胞化学显示：经TGFβ1处理的MF呈阳性显色，胞浆中见大量微肌丝；而未经TGFβ1处理的AF则呈阴性，胞浆基本未着色。透射电镜显示：经TGFβ1处理的MF包膜下大量微肌丝形成，且胞浆内见丰富的内质网；未经TGFβ1处理的AF包膜下几乎无微肌丝。2.mRNA差别显示：AF及MF 2种表型细胞用某些锚定引物扩增时大部分扩增片段基本相同，有些锚定引物可显示差异片段。比较2种表型细胞扩增产物，共发现22个200～900 bp差异片段，其中15条来自AF表型细胞，7条来自MF表型细胞。重组质粒经酶切显示，插入片段与原测序胶的片段大小相似，表明所有的cDNA均已克隆到载体中。3.测序结果大部分差异片段在GenBank查询中无同源性，其中一差异片段与NADH脱氢酶(NADH dehydrogenase subunit 5)基因完全同源。结论：本研究首次报道血管外膜成纤维细胞向肌成纤维表型转化过程中的差异片段，为进一步寻找与之相关的基因提供了可靠条件，实验中使用的荧光差别显示分析系统为研究提供了高分辨电泳，准确割胶等优势，将以往DD-PCR技术的高假阳性率降低到最低限度。此外，我们还发现一片段与NADH脱氢酶基因完全同源，后者为呼吸链的关键酶；且有报道该酶基因突变与体位性低血压有关，初步分析该基因片段在AF中表达增加可能为一保护机制。, 百拇医药
单位：高平进 朱鼎良(上海第二医科大学附属瑞金医院上海市高血压研究所，上海 200025)；赵涵芳 徐洪(上海第二医科大学生化教研室)
关键词：
中国病理生理杂志0010133
目的：血管外膜参与血管重塑的病变基础是细胞表型转化，其显著特征之一是外膜成纤维细胞(AF)被迅速激活并转化为肌成纤维细胞(MF)，后者兼有AF及平滑肌细胞的双重功能特性，增生并迁移至中膜及内膜。本研究应用差别显示聚合酶链反应(DD-PCR)技术筛选2种表型细胞间差别表达基因。方法：1.采用传统贴片法体外培养WKY大鼠胸主动脉外膜获AF，再用TGFβ1(20 ng/mL)处理AF24 h获MF。2.用免疫细胞化学分别检测AF及MF 2种表型细胞内α-SM肌动蛋白(αSM-actin)含量。3. 用透射电镜分别观察AF及MF 2种表型细胞超微结构。4.分别提取AF及MF 2种表型细胞的RNA，应用Beckman公司差异显示试剂盒3’末端12个锚定引物合成cDNA第一链，分别与5’末端4个随机引物进行PCR扩增。扩增产物加荧光染料经聚丙烯凝胶电泳及荧光成像系统扫描显示差异片段。切割差异片段凝胶，再扩增，回收纯化扩增产物，连接到pMD18-T载体，转化到JM109感受态细胞中扩增。经平板筛选单克隆，扩增后抽提质粒DNA。5.应用377DNA自动测序仪，对纯化后的克隆质粒进行序列分析，再与Genbank已知序列进行同源性比较。结果：αSM-actin免疫细胞化学显示：经TGFβ1处理的MF呈阳性显色，胞浆中见大量微肌丝；而未经TGFβ1处理的AF则呈阴性，胞浆基本未着色。透射电镜显示：经TGFβ1处理的MF包膜下大量微肌丝形成，且胞浆内见丰富的内质网；未经TGFβ1处理的AF包膜下几乎无微肌丝。2.mRNA差别显示：AF及MF 2种表型细胞用某些锚定引物扩增时大部分扩增片段基本相同，有些锚定引物可显示差异片段。比较2种表型细胞扩增产物，共发现22个200～900 bp差异片段，其中15条来自AF表型细胞，7条来自MF表型细胞。重组质粒经酶切显示，插入片段与原测序胶的片段大小相似，表明所有的cDNA均已克隆到载体中。3.测序结果大部分差异片段在GenBank查询中无同源性，其中一差异片段与NADH脱氢酶(NADH dehydrogenase subunit 5)基因完全同源。结论：本研究首次报道血管外膜成纤维细胞向肌成纤维表型转化过程中的差异片段，为进一步寻找与之相关的基因提供了可靠条件，实验中使用的荧光差别显示分析系统为研究提供了高分辨电泳，准确割胶等优势，将以往DD-PCR技术的高假阳性率降低到最低限度。此外，我们还发现一片段与NADH脱氢酶基因完全同源，后者为呼吸链的关键酶；且有报道该酶基因突变与体位性低血压有关，初步分析该基因片段在AF中表达增加可能为一保护机制。, 百拇医药