心脏组织血管紧张素Ⅱ形成双途径的转基因研究
作者：陈兰英
单位：中国医学科学院 中国协和医科大学 心血管病研究所 阜外心血管病医院， 北京 100037
关键词：
中国病理生理杂志001026
转基因动物自1980～1981年产生后，迅速发展。它克服了物种之间的生殖隔离，实现了动物物种之间遗传物质的交换和重组，这不仅为遗传物质的研究提供了新的手段，丰富了物种的基因库，也扩大了生命科学的视野。由于转基因动物技术具有分子及细胞水平操作、整体表达的特点，使得人们能从更完整的系统中去认识生物分子的作用，现已广泛应用于医药、农业及生物学领域。在医学领域已用于遗传病、肿瘤、心血管疾病、免疫性疾病的研究，包括建立疾病的病理模型，探讨其病因、发病机理和基因治疗方法，研究基因表达调控以及进行药物干预和新药的开发实验等。建立疾病的转基因动物模型是转基因动物技术应用于医学方面的一个重要研究内容。转基因技术可以在动物原来遗传背景的基础上，通过改变某种基因的表达水平，以建立人类疾病的动物模型。这种模型产生疾病的原因清楚(由转入的外源基因引起)，模型动物症状单一，接近于病人症状。在人类遗传病研究方面对单基因遗传病，已成功地建立了镰刀状细胞贫血、囊性纤维化、家族性高胆固醇血症和腺苷脱氧酶缺乏症等的转基因动物模型，以研究单个基因在遗传病发病中的作用。与此同时对于像高血压等多基因遗传病也广泛开展了建立转基因动物模型的研究，并取得很大的进展。
, 百拇医药
高血压转基因动物模型的研究始于八十年代末。已先后建立了用于高血压疾病研究的多种转基因动物模型。这些模型的主要优点：(1)遗传背景单纯、甚至仅有单基因异常，便于分析单一基因过度表达或缺陷后对血压调节的影响。(2)可通过组织表达特异的调控元件(启动子或增强子)的设计，有目的地检测外源基因在所要观察的特定组织中表达。(3)是从体内来研究基因功能，尤其是可用于一些不能在人身上进行的人类疾病相关基因的研究；而在转基因动物体内进行的基因功能的研究是判定基因功能的一种重要的方法，从某种意义上讲它比在体外进行基因分子生物学实验提供了更有参考价值的信息。总之，这些转基因动物模型的建立使高血压发病机制的研究进入了分子、细胞及整体水平相结合的新阶段。
循环肾素血管紧张素系统(renin angiotensin system, RAS)在血压调节及高血压病的发生中有重要作用，目前已有越来越多的证据表明心脏组织也存在着局部RAS并与心肌重塑密切相关。RAS的终产物血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)可直接对心肌细胞的收缩力、节律和肥大产生影响，也可和交感神经根部的AngⅡ高亲和力受体结合，间接对细胞产生影响。尽管循环RAS中血管紧张素转换酶(angiotensin converting enzyme, ACE)是AngⅡ的主要形成酶，但在心脏组织中除ACE外，AngⅡ的形成还存在着其它途径。已有的报道提示人心脏组织中AngⅡ的形成有糜酶和ACE两种途径，Urata等从体外的实验研究中更提出人心脏组织中的AngⅡ大于80%来源于糜酶，只有约15%来源于ACE。但该观点尚未在体内实验中被证实，也未在学者中达成共识。由于对心脏组织AngⅡ来源的了解，对心肌肥厚的研究与治疗有着重要的理论与临床意义，近10年来各国学者对人及动物心肌重塑过程中糜酶及ACE基因的表达情况进行了报道，但实验结果存在很大的差异。鉴于转基因动物是从体内研究基因功能最有力的工具，我们建立了糜酶转基因小鼠及ACE转基因大鼠，试图通过转基因动物心脏组织中糜酶或 ACE的过量表达对动物心脏结构与功能的影响，来说明心脏组织中AngⅡ形成的两种途径在心肌重塑中的地位及作用。
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一、转基因的构建
糜酶为肥大细胞分泌的蛋白水解酶，广泛分布于各组织；而ACE主要在肺血管内皮细胞中表达，为了能使人糜酶或ACE基因能在小鼠或大鼠心脏组织中特异性高表达，我们用大鼠肌球蛋白轻链2(myosin light chain 2, MLC2)启动子序列替换了人糜酶及ACE基因自身的启动子序列，得到了MLC2-糜酶及MLC2-ACE融合基因。细胞转染实验表明该融合基因可在乳鼠心肌细胞中高水平表达。
二、转基因动物的产生
(一)MLC2-糜酶转基因小鼠 供卵母鼠：雌性昆明白与雄性C57BL/6杂交第一代；种公鼠：雄性昆明白；假孕母鼠：雌性昆明白。显微注射100枚受精卵，得46只新生鼠，经Southern blot\, PCR及PCR产物测序鉴定出两只转基因阳性鼠，转基因可稳定遗传，经传代得纯合子。
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RT-PCR检测表明MLC2-糜酶融合基因可在转基因小鼠的心脏组织中特异表达，另在骨骼肌中也有低水平的表达；糜酶转基因小鼠心脏组织中糜酶活力较对照(0.274±0.071 U/mg vs 0.152±0.021 U/mg)显著升高而血管紧张素转换酶活力不变(0.172±0.029 U/mg vs 0.177±0.019 U/mg)；糜酶转基因小鼠心脏组织AngⅡ含量升高更明显，约为对照的3倍(1 984±184 pg/g vs 568±88 pg/g)，而血浆AngⅡ含量不变(218±106 pg/mL vs 234±66 pg/mL)；糜酶转基因小鼠心脏组织基质金属蛋白酶9活力及Ⅰ型胶原mRNA水平也显著升高(P<0.05)，而Ⅲ型胶原mRNA水平及Ⅰ/Ⅲ型胶原比改变不明显(P>0.05)；生理及形态学检查显示糜酶转基因小鼠的血压、心率、心重/体重比及心肌细胞直径无明显改变(P>0.05)。
(二)MLC2-hACE转基因大鼠 供卵鼠、 种公鼠及假孕鼠均为SD大鼠。显微注射138枚受精卵，得16只新生鼠，经Southern blot检测得4只转基因阳性鼠，其中2只可稳定传代，得纯合鼠系。
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MLC2-hACE融合基因可在转基因大鼠的心脏组织及骨骼肌中表达，而不在肺组织中表达；ACE活力在转基因大鼠左心室中升高了50倍，在右室中升高了28倍；转基因鼠循环中肾素、AngⅠ及AngⅡ水平没有明显改变(P>0.05)；转基因鼠心脏组织中胶原Ⅲ水平没有显著改变，血压、心率、心重/体重比及心肌细胞直径无明显改变(P>0.05)。用3×10-9-3×10-8mol/L AngⅠ灌注离体心脏，转基因鼠冠脉流量较对照显著降低，这种降低可用ACEI逆转。将转基因大鼠及对照鼠腹主动脉绑扎造成心肌肥厚模型，转基因大鼠的心肌肥厚更加显著。
三、糜酶、ACE双途径在心肌重塑中的意义
从实验结果可以看出，在小鼠或大鼠心脏中表达的人糜酶或ACE均可催化AngⅡ的生成，因而在人心脏中，AngⅡ形成的糜酶和ACE双途径是存在的。在我们建立的两个转基因鼠中，尽管糜酶或ACE活力与对照相比，均有显著提高，但无论是糜酶转基因小鼠还是ACE转基因大鼠均未发生心肌重塑现象。可能的原因是：在AngⅡ形成的酶联反应中，由肾素催化的血管紧张素原(AO)向AngⅠ的转化是限速步骤，在肾素活力及AngⅠ水平无显著提高情况下，仅仅糜酶或ACE活力的升高并不能使心脏组织AngⅡ水平有大幅度升高，达到足以刺激心脏发生重塑的浓度。在转基因大鼠心脏离体灌注实验中，灌注AngⅠ使得冠脉流量显著降低，而这种降低与AngⅡ的效应相同并可被ACEI逆转，不仅表明转入的ACE可将AngⅠ转化为AngⅡ，而且说明在大量AngⅠ存在下，ACE才能催化足够量的AngⅡ形成。在腹主动脉绑扎造成的心肌肥厚中，由于循环肾素及AngⅠ水平的升高，转ACE基因大鼠也更容易发生心肌肥厚。
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从糜酶转基因小鼠中还可看出，由于心脏糜酶活力的升高，心脏组织基质金属蛋白酶9的活力也明显升高。基质金属蛋白酶是心脏间质重塑中重要的蛋白水解酶，通过对基质成分的水解改变其结构与功能。基质金属蛋白酶常以前体形式存在，通过自身的部分水解而活化，糜酶是一种丝氨酸蛋白酶，可能对基质金属蛋白酶有活化作用。由于糜酶是肥大细胞分泌的蛋白酶，广泛存在于心脏间质，因而糜酶对心脏间质重塑的影响可能更强于对心肌细胞肥大的影响。
因此，在人心脏组织中AngⅡ的形成存在着糜酶及ACE两条途径，即糜酶和ACE均可通过升高心脏AngⅡ水平影响心肌重塑，但它们对AngⅡ水平的影响受肾素活力及AngⅠ水平的限制。糜酶除通过AngⅡ途径，还可通过活化基质金属蛋白酶加速心脏基质代谢，对心脏间质重塑产生影响。, 百拇医药
单位：中国医学科学院 中国协和医科大学 心血管病研究所 阜外心血管病医院， 北京 100037
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中国病理生理杂志001026
转基因动物自1980～1981年产生后，迅速发展。它克服了物种之间的生殖隔离，实现了动物物种之间遗传物质的交换和重组，这不仅为遗传物质的研究提供了新的手段，丰富了物种的基因库，也扩大了生命科学的视野。由于转基因动物技术具有分子及细胞水平操作、整体表达的特点，使得人们能从更完整的系统中去认识生物分子的作用，现已广泛应用于医药、农业及生物学领域。在医学领域已用于遗传病、肿瘤、心血管疾病、免疫性疾病的研究，包括建立疾病的病理模型，探讨其病因、发病机理和基因治疗方法，研究基因表达调控以及进行药物干预和新药的开发实验等。建立疾病的转基因动物模型是转基因动物技术应用于医学方面的一个重要研究内容。转基因技术可以在动物原来遗传背景的基础上，通过改变某种基因的表达水平，以建立人类疾病的动物模型。这种模型产生疾病的原因清楚(由转入的外源基因引起)，模型动物症状单一，接近于病人症状。在人类遗传病研究方面对单基因遗传病，已成功地建立了镰刀状细胞贫血、囊性纤维化、家族性高胆固醇血症和腺苷脱氧酶缺乏症等的转基因动物模型，以研究单个基因在遗传病发病中的作用。与此同时对于像高血压等多基因遗传病也广泛开展了建立转基因动物模型的研究，并取得很大的进展。
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高血压转基因动物模型的研究始于八十年代末。已先后建立了用于高血压疾病研究的多种转基因动物模型。这些模型的主要优点：(1)遗传背景单纯、甚至仅有单基因异常，便于分析单一基因过度表达或缺陷后对血压调节的影响。(2)可通过组织表达特异的调控元件(启动子或增强子)的设计，有目的地检测外源基因在所要观察的特定组织中表达。(3)是从体内来研究基因功能，尤其是可用于一些不能在人身上进行的人类疾病相关基因的研究；而在转基因动物体内进行的基因功能的研究是判定基因功能的一种重要的方法，从某种意义上讲它比在体外进行基因分子生物学实验提供了更有参考价值的信息。总之，这些转基因动物模型的建立使高血压发病机制的研究进入了分子、细胞及整体水平相结合的新阶段。
循环肾素血管紧张素系统(renin angiotensin system, RAS)在血压调节及高血压病的发生中有重要作用，目前已有越来越多的证据表明心脏组织也存在着局部RAS并与心肌重塑密切相关。RAS的终产物血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)可直接对心肌细胞的收缩力、节律和肥大产生影响，也可和交感神经根部的AngⅡ高亲和力受体结合，间接对细胞产生影响。尽管循环RAS中血管紧张素转换酶(angiotensin converting enzyme, ACE)是AngⅡ的主要形成酶，但在心脏组织中除ACE外，AngⅡ的形成还存在着其它途径。已有的报道提示人心脏组织中AngⅡ的形成有糜酶和ACE两种途径，Urata等从体外的实验研究中更提出人心脏组织中的AngⅡ大于80%来源于糜酶，只有约15%来源于ACE。但该观点尚未在体内实验中被证实，也未在学者中达成共识。由于对心脏组织AngⅡ来源的了解，对心肌肥厚的研究与治疗有着重要的理论与临床意义，近10年来各国学者对人及动物心肌重塑过程中糜酶及ACE基因的表达情况进行了报道，但实验结果存在很大的差异。鉴于转基因动物是从体内研究基因功能最有力的工具，我们建立了糜酶转基因小鼠及ACE转基因大鼠，试图通过转基因动物心脏组织中糜酶或 ACE的过量表达对动物心脏结构与功能的影响，来说明心脏组织中AngⅡ形成的两种途径在心肌重塑中的地位及作用。
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一、转基因的构建
糜酶为肥大细胞分泌的蛋白水解酶，广泛分布于各组织；而ACE主要在肺血管内皮细胞中表达，为了能使人糜酶或ACE基因能在小鼠或大鼠心脏组织中特异性高表达，我们用大鼠肌球蛋白轻链2(myosin light chain 2, MLC2)启动子序列替换了人糜酶及ACE基因自身的启动子序列，得到了MLC2-糜酶及MLC2-ACE融合基因。细胞转染实验表明该融合基因可在乳鼠心肌细胞中高水平表达。
二、转基因动物的产生
(一)MLC2-糜酶转基因小鼠 供卵母鼠：雌性昆明白与雄性C57BL/6杂交第一代；种公鼠：雄性昆明白；假孕母鼠：雌性昆明白。显微注射100枚受精卵，得46只新生鼠，经Southern blot\, PCR及PCR产物测序鉴定出两只转基因阳性鼠，转基因可稳定遗传，经传代得纯合子。
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RT-PCR检测表明MLC2-糜酶融合基因可在转基因小鼠的心脏组织中特异表达，另在骨骼肌中也有低水平的表达；糜酶转基因小鼠心脏组织中糜酶活力较对照(0.274±0.071 U/mg vs 0.152±0.021 U/mg)显著升高而血管紧张素转换酶活力不变(0.172±0.029 U/mg vs 0.177±0.019 U/mg)；糜酶转基因小鼠心脏组织AngⅡ含量升高更明显，约为对照的3倍(1 984±184 pg/g vs 568±88 pg/g)，而血浆AngⅡ含量不变(218±106 pg/mL vs 234±66 pg/mL)；糜酶转基因小鼠心脏组织基质金属蛋白酶9活力及Ⅰ型胶原mRNA水平也显著升高(P<0.05)，而Ⅲ型胶原mRNA水平及Ⅰ/Ⅲ型胶原比改变不明显(P>0.05)；生理及形态学检查显示糜酶转基因小鼠的血压、心率、心重/体重比及心肌细胞直径无明显改变(P>0.05)。
(二)MLC2-hACE转基因大鼠 供卵鼠、 种公鼠及假孕鼠均为SD大鼠。显微注射138枚受精卵，得16只新生鼠，经Southern blot检测得4只转基因阳性鼠，其中2只可稳定传代，得纯合鼠系。
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MLC2-hACE融合基因可在转基因大鼠的心脏组织及骨骼肌中表达，而不在肺组织中表达；ACE活力在转基因大鼠左心室中升高了50倍，在右室中升高了28倍；转基因鼠循环中肾素、AngⅠ及AngⅡ水平没有明显改变(P>0.05)；转基因鼠心脏组织中胶原Ⅲ水平没有显著改变，血压、心率、心重/体重比及心肌细胞直径无明显改变(P>0.05)。用3×10-9-3×10-8mol/L AngⅠ灌注离体心脏，转基因鼠冠脉流量较对照显著降低，这种降低可用ACEI逆转。将转基因大鼠及对照鼠腹主动脉绑扎造成心肌肥厚模型，转基因大鼠的心肌肥厚更加显著。
三、糜酶、ACE双途径在心肌重塑中的意义
从实验结果可以看出，在小鼠或大鼠心脏中表达的人糜酶或ACE均可催化AngⅡ的生成，因而在人心脏中，AngⅡ形成的糜酶和ACE双途径是存在的。在我们建立的两个转基因鼠中，尽管糜酶或ACE活力与对照相比，均有显著提高，但无论是糜酶转基因小鼠还是ACE转基因大鼠均未发生心肌重塑现象。可能的原因是：在AngⅡ形成的酶联反应中，由肾素催化的血管紧张素原(AO)向AngⅠ的转化是限速步骤，在肾素活力及AngⅠ水平无显著提高情况下，仅仅糜酶或ACE活力的升高并不能使心脏组织AngⅡ水平有大幅度升高，达到足以刺激心脏发生重塑的浓度。在转基因大鼠心脏离体灌注实验中，灌注AngⅠ使得冠脉流量显著降低，而这种降低与AngⅡ的效应相同并可被ACEI逆转，不仅表明转入的ACE可将AngⅠ转化为AngⅡ，而且说明在大量AngⅠ存在下，ACE才能催化足够量的AngⅡ形成。在腹主动脉绑扎造成的心肌肥厚中，由于循环肾素及AngⅠ水平的升高，转ACE基因大鼠也更容易发生心肌肥厚。
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从糜酶转基因小鼠中还可看出，由于心脏糜酶活力的升高，心脏组织基质金属蛋白酶9的活力也明显升高。基质金属蛋白酶是心脏间质重塑中重要的蛋白水解酶，通过对基质成分的水解改变其结构与功能。基质金属蛋白酶常以前体形式存在，通过自身的部分水解而活化，糜酶是一种丝氨酸蛋白酶，可能对基质金属蛋白酶有活化作用。由于糜酶是肥大细胞分泌的蛋白酶，广泛存在于心脏间质，因而糜酶对心脏间质重塑的影响可能更强于对心肌细胞肥大的影响。
因此，在人心脏组织中AngⅡ的形成存在着糜酶及ACE两条途径，即糜酶和ACE均可通过升高心脏AngⅡ水平影响心肌重塑，但它们对AngⅡ水平的影响受肾素活力及AngⅠ水平的限制。糜酶除通过AngⅡ途径，还可通过活化基质金属蛋白酶加速心脏基质代谢，对心脏间质重塑产生影响。, 百拇医药