TNFα引起的微血管内皮细胞功能障碍及其分子机制
作者：金惠铭 刘清行 张国平 张明 沙志一
单位：上海医科大学病理生理学教研室， 上海 200032
关键词：
中国病理生理杂志001025 血管内皮细胞是肿瘤坏死因子(TNFα)作用的靶细胞之一。由TNFα引起的血管内皮细胞损伤在很多心脑血管疾病和血栓性疾病的发病中具有重要意义。本工作主要研究不同浓度的mTNFα(简称TNF)引起微血管内皮细胞的功能、代谢的早期损伤以及其与微血管内皮细胞中原癌基因和凋亡相关基因表达的关系，试图从中说明TNF引起微血管内皮细胞功能障碍的部分分子机制。
1.细胞增殖动力学 在体外培养的肺微血管内皮细胞(PMVEC)中发现，加入TNF(20 ng/mL)后，细胞形态从圆形、多角形变成梭形，细胞的纵轴拉长，横轴缩小，此种变化从培养6 h开始，72 h最显著。光镜下未见明显细胞损伤表现，电镜下(透射电镜及扫描电镜)细胞器无明显改变，但见内皮细胞表面微绒毛减少。当TNF的浓度增高到40 ng/mL以上，将其与PMVEC共同孵育培养72 h后，TNF组内皮细胞总数比对照组(PBS组)显著减少(5.23±0.50减到4.30±0.34,P<0.01)，用流式细胞仪分析细胞增殖周期发现，TNF组处于G1期的细胞明显增多，S期和M期的细胞明显减少(P<0.05)。结果提示，高浓度TNF抑制内皮细胞增生，使细胞分裂延缓。
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2.PGI2和t-PA 前列腺素PGI2与组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)是内皮细胞合成、分泌的重要物质，也是反映内皮细胞代谢功能的重要指标。我们的实验发现，TNF浓度为20 ng/mL，培养72 h后内皮细胞培养上清液中6-酮-PGF1α(放免法)浓度明显低于对照组(P<0.01)，两者间比值达1∶3.7，但两组间的TXB2含量无显著差异。同时测定上清液中t-PA和PAI活性(发色底物法)，结果发现，在0～30 ng/mL TNF浓度下，培养48 h内t-PA浓度变化不显，但PAI活性逐渐上升，且呈时间-效应和剂量-效应依赖关系，差异显著(P<0.05)。结果说明较高浓度TNF有促凝作用，此作用与PGI2的减少、PAI活性升高有关。
3.粘附蛋白 细胞型纤维蛋白(Fn)是内皮细胞间、内皮细胞和基底膜间的一种粘连分子，它对保持微血管的完整性和正常通透性有重要作用。本工作用免疫荧光法观察发现TNF组(30 ng/mL) PMVEC表面Fn免疫荧光较对照组弱，经流式细胞仪对荧光强度进行定量测定，结果表明TNF组(668.0±53.6)较对照组(820.8±27.9)明显减弱(P<0.05)，而培养液中Fn合成明显抑制。由此可见，经TNF作用后内皮细胞表面Fn减少，其原因与合成抑制及表面脱落有关，此种脱落究竟是因Fn经TNF作用后分子结构和功能异常，还是内皮细胞表面Fn受体结合活性抑制，需进一步研究。
, 百拇医药
TNF对血管内皮细胞表面和中性白细胞表面的粘附蛋白也有明显的作用，体外实验发现，低浓度的TNF(<20 ng/mL)短时间培养即对微血管内皮细胞与白细胞间粘附影响不显，但浓度达40 ng/mL以上时可使PMVEC对中性白细胞的粘附率增加30.8%±4.5%，如在培养液中先加ICAM-1或CD11单抗，然后再加白细胞，则可明显地部分抑制白细胞的粘附，抑制幅度在31.2%～63.4%之间。由此可见，一定浓度的TNF能激活白细胞与/或PMVEC表面的粘附分子ICAM-1或CD11表达，从而促进PMVEC与白细胞之间的粘附。
4.信息分子NO 以大鼠肺微血管内皮细胞为材料，测定细胞培养上清液中NO2水平，并用RT/PCR技术检测PMVEC NOS mRNA表达水平，结果发现TNF (100 ng/mL)作用6 h后，培养上清液中NO2水平(代表NO水平)较对照组显著升高(P<0.05)，预先应用NO合酶抑制剂L-NMMA地塞米松或放线菌酮后，iNOS mRNA水平与对照组无明显差异(P>0.05)。同时eNOS mRNA较对照组显著降低，这种下降作用也可被放线菌酮阻断，但不受地塞米松影响，由此可见，TNF可诱导PMVEC iNOS mRNA表达，但抑制eNOS nRNA表达。TNF时间依赖性地诱导内皮细胞NO的生成。
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5.原癌基因 为了在分子水平上进一步探讨引起上述变化的基因机制，我们应用免疫组化(ABC法)法和原位杂交法结合图像灰度定量处理处理观察了c-fos、c-jun等早期反应原癌基因表达的变化，结果发现(ABC法)TNF (20 ng/mL)作用12 h后c-fos和c-jun表达明显增强，24 h时达高峰，以后逐渐回落。用DIG标记的寡核苷酸c-fos探针(5’TTCTCGGGCTTCAACGCAACGCAGAC3’)对上述细胞做原位杂交，结果发现经TNF作用4 h开始c-fos表达已明显增强，12～24 h持续高表达，24 h逐渐回落。c-fos的表达与细胞表面的Fn表达间呈显著的负相关(Y=-9.012 7 X+942.64,r=-0.748,P<0.05)。由此可见，此类基因在大剂量TNF引起体外培养的血管内皮细胞的早期损伤的发生上有重要意义，它可能对其它各种决定细胞损伤表现的特异性基因的调控起着一个“开关”作用。
6.凋亡与凋亡相关基因 TNF是细胞凋亡的诱导因素之一。本工作在经TNF(10～80 ng/mL)作用的培养内此细胞中用电镜观察、流式细胞仪检测凋亡细胞峰(PI和Annexin V双染色)、TUNEL染色、DNA碎片的梯形电泳等方法证实在高浓度的TNF(>60 ng/mL)作用下培养12 h后即可导致PMVEC凋亡，此作用无明显时间-效应和剂量-效应依赖关系，凋亡仍然发展。与此同时，凋亡相关基因Bcl-2mRNA的表达(Northern blot)抑制，Fas mRNA的表达增强，FADD、caspase 3、caspase 8 (ABC法)表达均增强，因此TNFα引起的凋亡，其信号可能沿Fas→FADD→caspase 8→caspase 3级联放大途径传递。
上述结果表明，应该重视TNF引起的光镜下不易发现的微血管内皮细胞代谢的损伤和功能障碍，此种损伤虽受多种基因组成的复杂“网络”控制，但是原癌基因c-fos、c-jun的表达加强在其早期调控中起“开关”作用，高浓度的TNF可引起内皮细胞凋亡，细胞凋亡过程受基因调控，一旦启动，即无法逆转，上述变化是很多疾病发病中的共同环节。
国家自科学基金；美国中华医学基金资助, 百拇医药
单位：上海医科大学病理生理学教研室， 上海 200032
关键词：
中国病理生理杂志001025 血管内皮细胞是肿瘤坏死因子(TNFα)作用的靶细胞之一。由TNFα引起的血管内皮细胞损伤在很多心脑血管疾病和血栓性疾病的发病中具有重要意义。本工作主要研究不同浓度的mTNFα(简称TNF)引起微血管内皮细胞的功能、代谢的早期损伤以及其与微血管内皮细胞中原癌基因和凋亡相关基因表达的关系，试图从中说明TNF引起微血管内皮细胞功能障碍的部分分子机制。
1.细胞增殖动力学 在体外培养的肺微血管内皮细胞(PMVEC)中发现，加入TNF(20 ng/mL)后，细胞形态从圆形、多角形变成梭形，细胞的纵轴拉长，横轴缩小，此种变化从培养6 h开始，72 h最显著。光镜下未见明显细胞损伤表现，电镜下(透射电镜及扫描电镜)细胞器无明显改变，但见内皮细胞表面微绒毛减少。当TNF的浓度增高到40 ng/mL以上，将其与PMVEC共同孵育培养72 h后，TNF组内皮细胞总数比对照组(PBS组)显著减少(5.23±0.50减到4.30±0.34,P<0.01)，用流式细胞仪分析细胞增殖周期发现，TNF组处于G1期的细胞明显增多，S期和M期的细胞明显减少(P<0.05)。结果提示，高浓度TNF抑制内皮细胞增生，使细胞分裂延缓。
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2.PGI2和t-PA 前列腺素PGI2与组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)是内皮细胞合成、分泌的重要物质，也是反映内皮细胞代谢功能的重要指标。我们的实验发现，TNF浓度为20 ng/mL，培养72 h后内皮细胞培养上清液中6-酮-PGF1α(放免法)浓度明显低于对照组(P<0.01)，两者间比值达1∶3.7，但两组间的TXB2含量无显著差异。同时测定上清液中t-PA和PAI活性(发色底物法)，结果发现，在0～30 ng/mL TNF浓度下，培养48 h内t-PA浓度变化不显，但PAI活性逐渐上升，且呈时间-效应和剂量-效应依赖关系，差异显著(P<0.05)。结果说明较高浓度TNF有促凝作用，此作用与PGI2的减少、PAI活性升高有关。
3.粘附蛋白 细胞型纤维蛋白(Fn)是内皮细胞间、内皮细胞和基底膜间的一种粘连分子，它对保持微血管的完整性和正常通透性有重要作用。本工作用免疫荧光法观察发现TNF组(30 ng/mL) PMVEC表面Fn免疫荧光较对照组弱，经流式细胞仪对荧光强度进行定量测定，结果表明TNF组(668.0±53.6)较对照组(820.8±27.9)明显减弱(P<0.05)，而培养液中Fn合成明显抑制。由此可见，经TNF作用后内皮细胞表面Fn减少，其原因与合成抑制及表面脱落有关，此种脱落究竟是因Fn经TNF作用后分子结构和功能异常，还是内皮细胞表面Fn受体结合活性抑制，需进一步研究。
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TNF对血管内皮细胞表面和中性白细胞表面的粘附蛋白也有明显的作用，体外实验发现，低浓度的TNF(<20 ng/mL)短时间培养即对微血管内皮细胞与白细胞间粘附影响不显，但浓度达40 ng/mL以上时可使PMVEC对中性白细胞的粘附率增加30.8%±4.5%，如在培养液中先加ICAM-1或CD11单抗，然后再加白细胞，则可明显地部分抑制白细胞的粘附，抑制幅度在31.2%～63.4%之间。由此可见，一定浓度的TNF能激活白细胞与/或PMVEC表面的粘附分子ICAM-1或CD11表达，从而促进PMVEC与白细胞之间的粘附。
4.信息分子NO 以大鼠肺微血管内皮细胞为材料，测定细胞培养上清液中NO2水平，并用RT/PCR技术检测PMVEC NOS mRNA表达水平，结果发现TNF (100 ng/mL)作用6 h后，培养上清液中NO2水平(代表NO水平)较对照组显著升高(P<0.05)，预先应用NO合酶抑制剂L-NMMA地塞米松或放线菌酮后，iNOS mRNA水平与对照组无明显差异(P>0.05)。同时eNOS mRNA较对照组显著降低，这种下降作用也可被放线菌酮阻断，但不受地塞米松影响，由此可见，TNF可诱导PMVEC iNOS mRNA表达，但抑制eNOS nRNA表达。TNF时间依赖性地诱导内皮细胞NO的生成。
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5.原癌基因 为了在分子水平上进一步探讨引起上述变化的基因机制，我们应用免疫组化(ABC法)法和原位杂交法结合图像灰度定量处理处理观察了c-fos、c-jun等早期反应原癌基因表达的变化，结果发现(ABC法)TNF (20 ng/mL)作用12 h后c-fos和c-jun表达明显增强，24 h时达高峰，以后逐渐回落。用DIG标记的寡核苷酸c-fos探针(5’TTCTCGGGCTTCAACGCAACGCAGAC3’)对上述细胞做原位杂交，结果发现经TNF作用4 h开始c-fos表达已明显增强，12～24 h持续高表达，24 h逐渐回落。c-fos的表达与细胞表面的Fn表达间呈显著的负相关(Y=-9.012 7 X+942.64,r=-0.748,P<0.05)。由此可见，此类基因在大剂量TNF引起体外培养的血管内皮细胞的早期损伤的发生上有重要意义，它可能对其它各种决定细胞损伤表现的特异性基因的调控起着一个“开关”作用。
6.凋亡与凋亡相关基因 TNF是细胞凋亡的诱导因素之一。本工作在经TNF(10～80 ng/mL)作用的培养内此细胞中用电镜观察、流式细胞仪检测凋亡细胞峰(PI和Annexin V双染色)、TUNEL染色、DNA碎片的梯形电泳等方法证实在高浓度的TNF(>60 ng/mL)作用下培养12 h后即可导致PMVEC凋亡，此作用无明显时间-效应和剂量-效应依赖关系，凋亡仍然发展。与此同时，凋亡相关基因Bcl-2mRNA的表达(Northern blot)抑制，Fas mRNA的表达增强，FADD、caspase 3、caspase 8 (ABC法)表达均增强，因此TNFα引起的凋亡，其信号可能沿Fas→FADD→caspase 8→caspase 3级联放大途径传递。
上述结果表明，应该重视TNF引起的光镜下不易发现的微血管内皮细胞代谢的损伤和功能障碍，此种损伤虽受多种基因组成的复杂“网络”控制，但是原癌基因c-fos、c-jun的表达加强在其早期调控中起“开关”作用，高浓度的TNF可引起内皮细胞凋亡，细胞凋亡过程受基因调控，一旦启动，即无法逆转，上述变化是很多疾病发病中的共同环节。
国家自科学基金；美国中华医学基金资助, 百拇医药