造血干祖细胞移植的生物学基础
作者：唐佩弦
单位：军事医学科学院基础医学研究所， 北京 100039
关键词：
中国病理生理杂志001020 一、什么是造血干祖细胞最佳的移植物
造血干祖细胞移植(HSPCT)用于治疗造血干祖细胞缺陷性血液病、先天性免疫缺损、先天性贫血、各类自身免疫病等，也用于实体瘤的治疗，是一种重要的生物治疗或细胞治疗。实际上，不论来自骨髓、脐带血或动员的外周血，移植物中含的不仅是造血干细胞，还包括更多的早期造血祖细胞，所谓“造血干细胞移植(HSCT)”实际上是造血干祖细胞移植(HSPCT)。这是当前对“造血干细胞移植”含义崭新的理解。CD34+细胞中90%以上是早期和晚期祖细胞，干细胞只是很小一部分。CD34+细胞移植更应该是造血干祖细胞移植。干细胞的生存必须依赖其周围的祖细胞、淋巴、巨噬、成纤维、内皮和其它各类间质细胞构成的微环境。祖细胞在移植后，反映到外周血相的时间比干细胞早，产生临床效应快。因此，含有造血干细胞、大量祖细胞的CD34+细胞才是理想的移植物。作为造血干细胞临床移植物决不是越纯越好。模拟天然的骨髓中各类造血和间质细胞组成的移植物可能是最佳的。
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二、究竟造血干细胞是CD34阳性还是阴性?
近年来国际文献中有些报告发现CD34/Lin阴性细胞具有长期重建造血的活性，引起了广泛的注意。从发育生物学观点来看，CD34+Lin-细胞来自CD34Lin-的论点是合理可信的。已定向发育为造血系统的干细胞(即造血干细胞)都来自尚未定向的胚胎中胚层干细胞，所以CD34+Lin-细胞起源于CD34-Lin-细胞。当干细胞分化为各系的祖细胞，出现髓/淋巴各系的专一性标志，如淋巴系的CD19/CD7，粒系的CD33/13，红系的CD71，巨核系的CD41/61等等，统称为Lin阳性。当各系祖细胞分化为形态可辨认的骨髓各系原始和幼稚细胞时，CD34抗原标志也消失，成为CD34阴性Lin阳性的细胞。所以，CD34表面标志从无到有，又从有到无，是造血干祖细胞产生、发育、分化和成熟的过程。
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有的作者提出“真正的干细胞都是CD34阴性，而CD34阳性细胞全是祖细胞”等否认CD34+细胞群中含有干细胞的论点，是缺乏科学根据的。多年来，全世界的血液学实验室和大量的临床实践已经充分证明了：在CD34阳性细胞群体中含有可以长期重建髓系和淋巴系造血的干细胞及大量造血祖细胞。CD34阳性细胞已经是公认的理想的造血干祖细胞移植物。
三、嵌合型重建造血与抗肿瘤免疫
造血干祖细胞移植后，可能在宿主体内形成供者与宿主两种造血细胞的嵌合(D/R chimerism),即供者(D)的造血免疫细胞和宿主(R)的造血免疫细胞的嵌合而且又和宿主肿瘤细胞对持。这三者在同一宿主体内持续保持共存，必然有这两种嵌合的异基因淋巴细胞既相争又相容的平衡，这可能激活和增强这两种淋巴细胞对宿主肿瘤细胞的识别和监控，长期地使肿瘤微小残留病灶(minimal residual disease)不致扩增和发展，也就有效地制止肿瘤的临床复发。这就是GvT(GvL)效应。如果移植后在宿主体内没有嵌合型造血，而是全供者型的造血重建(full-donor type reconstitution)，其产生对抗肿瘤的免疫效应可能不如稳定性嵌合型的强。
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四、脐带血造血干祖细胞是婴幼儿患者的最佳选择
对婴幼儿患者进行造血干祖细胞移植的最优选择是未经体外扩增培养的、从脐带血一次分离所得的、含有丰富造血干祖细胞的单个核细胞。婴幼儿做脐带血移植，由于脐带血中缺乏免疫活性细胞又无肿瘤细胞的污染，所以没有必要用MACS二次分离纯化的CD34+细胞。但体外扩增祖细胞时不能用单个核细胞，必须用纯化的CD34+细胞。
用胎盘脐带血中的造血干祖细胞做移植，有很多优点：操作简便，容易得到；无缘供者HLA可以1-3个位点不相合，IV度GvHD发生率很低(<5%)，使侯选的供者大大增加；脐带血中的造血干祖细胞，其重建造血和免疫的活力高于骨髓和外周血；脐带血中CD3+细胞极少，CD8+细胞更少。国外已有临床报告低温保存至少15年后移植仍有效，冻融后CD34+细胞回收率80%。但是，脐带血容量小，含有的造血干祖细胞数量太少。1999年9月Gluckman从临床实践中提出脐带血移植有效剂量为单个核细胞3.7×107/kg。低于这个剂量的，植入率也低。不足1×107/kg的无一例植入。一般一份脐带血的单个核细胞总量仅5-10×108，只够治疗一个婴儿或体重约20～30 kg的少儿。当脐带血移植的有效剂量被越来越多的学者所承认之后，脐带血用于成人也越来越少。一份脐带血单个核细胞总量多达2×109，才可以用于一个50 kg体重的病人。
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为了使脐带血移植于成人，人们探求在体外扩增脐带血CD34+细胞，甚至期求干细胞也扩增。但大量研究报告的结果表明CD34+祖细胞可几十或几百倍地扩增，但无法实现真正的干细胞扩增。少数作者误把祖细胞的扩增称为干细胞扩增。至今国际上还没有一例用脐带血CD34+细胞扩增后移植而在病人体内移植物能维持6个月以上的报告。有力地表明扩增的是祖细胞，而不是干细胞。扩增的CD34+细胞移植后，即使在受者体内长期维持重建造血，也只能说明移植物体外扩增后仍含有干细胞，也不能证明干细胞的扩增。
五、输注的细胞剂量是移植成败的关键
临床的实践证明：细胞剂量是脐带血移植成功的关键。美国Rubinstein认为脐带血有核细胞至少5.0×107/kg，而法国Gluckman提出脐带血有核细胞有效剂量为3.7×107/kg。笔者认为3.3-5.0×107/kg有核细胞为脐带血移植的有效剂量；而1×108/kg是优效剂量。因为1×108个有核细胞中，CD34+细胞才可能达到106。在临床选用供者时，要把细胞输注剂量放在首位。
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Welte报告半相合的有缘供者移植给35例小儿白血病、NHL，MDS等患者用G-CSF动员后经2次分离纯化所得的大剂量(megadose)外周血CD34+细胞2×107/kg移植，移植物中含CD3+细胞控制在2×104/kg以下，17/35存活，16/35无病生存3-38个月。平均第11 d中性粒细胞>500,无一例发生明显的GvHD。1999年欧洲好几个国家都报告用大剂量CD34(+)细胞即107/kg而CD3(+)控制在104/kg，即使3个位点不合的无血缘供者，竟也不出现GvHD，其植入率高，血象回升也早，这些不约而同而又令人振奋的临床报告，给干细胞移植生物学和GVHD的发生机制，提出一些值得研究的课题。
所谓大剂量CD34+细胞，其实主要是大剂量的祖细胞。因为，移植成功所需要的真正干细胞不是很多的。而祖细胞的大剂量输注一定会明显地提前血象的回升，提高干细胞的植入率。
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六、HLA检测分辨率的提高是开展非血缘移植的保证
国外非血缘HLA 3个位点不合而移植成功的报告已经不少。在那些找不到HLA全相合的又急需做造血干祖细胞移植的病人，应该慎重而积极地开展无血缘HLA不全相合的移植(unrelated mismatched transplant)，努力追上和国际间的差距，使更多的病人获救。欧洲的统计，白血病非血缘脐带血移植的病人中HLA 1个位点不合的占44%，2个位点不合的40%，而全相合的仅9%；欧洲白血病非血缘骨髓移植中全相合的占71%，1位点不合的占26%，2个位点不合3%。在应用非血缘供者做造血干细胞移植的经验方面，我国和发达国家之间有很大的差距。开展非血缘HLA 1-2位点不合的移植，HLA配型的技术是成败的关键。国外HLA配型不论Ⅰ或Ⅱ类抗原都已经采用了探针做基因配型(genotyping)。然而，国内目前多数还用表型配型(phenotyping)即血清学配型来检测Ⅰ类抗原。近10年来，用DNA序列又新发现500多个等位基因(alleles)，而新发现的等位基因还不断在增加，使基因配型的分辨率和准确率大大高于血清学配型。同样一对供者和受者样品，用血清方法测出14%不相合，而用分子探针法可测出74%不相合。这可以解释我国一些‘全相合’的移植为什么竟会死于严重的GVHD。总之，基因配型的精确性大大超过血清配型。高精度的HLA配型无疑会显著地提高非血缘不相合移植的成功率。
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七、造血干祖细胞移植研究的新方向
造血干祖细胞以及构成造血微环境的各类间质细胞都来自更早的胚胎干细胞或间叶干干细胞(mesenchyma stem cell, MSC)。发展组织工程新技术，可在体外诱导MSC分化为造血干祖细胞和各类间质细胞，成为理想的重建造血的移植物。胚胎干细胞或间叶干细胞都是CD34阴性细胞，而且Lin标志也阴性。目前有关CD34阴性细胞的研究，如果解决了CD34阴性细胞的纯化技术，将使胚胎干细胞或间叶干细胞诱导分化为造血干祖细胞和各类间质细胞的研究更快地获得成功。
造血干祖细胞移植研究另一个新的发展方向，是用造血干祖细胞做基因治疗。也就是用修饰过基因的造血干细胞进行移植。干细胞是治疗基因在病人体内永久表达的理想宿主细胞。祖细胞也可用来做短期表达治疗基因的宿主细胞。先天性单基因缺损的疾病，糖尿病，高血压病，艾滋病，帕金森病，自身免疫病和恶性肿瘤的基因治疗都可以用造血干细胞做宿主细胞，在病人体内长期表达所转导的治疗基因。如果在造血祖细胞内导入多药耐药基因，便可以大大提高肿瘤的化疗剂量。这类基因治疗，应该用造血祖细胞做宿主细胞，而不是干细胞。因为干细胞大部分处于G0期，对化疗药物并不敏感。要保护的是祖细胞。又因为chemoprotoection也用不着长期，只要求化疗期间短期的效应。用造血干细胞做基因治疗的研究，目前最大的困难是人类造血干细胞的基因导入率非常低。因为，人的造血干细胞表面缺乏装载治疗基因的重组逆转录病毒载体的受体。而且，人的造血干细胞大部分处于G0静止期，用重组逆转录病毒载体装载的治疗基因很难整合到静止期细胞染色体的基因组中去。现在，国外不少先进的实验室正在大力研究。一旦这些难题得到解决，造血干细胞移植治疗的适应症可以大大扩展；肿瘤的治疗也会出现一个新的纪元。, 百拇医药
单位：军事医学科学院基础医学研究所， 北京 100039
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中国病理生理杂志001020 一、什么是造血干祖细胞最佳的移植物
造血干祖细胞移植(HSPCT)用于治疗造血干祖细胞缺陷性血液病、先天性免疫缺损、先天性贫血、各类自身免疫病等，也用于实体瘤的治疗，是一种重要的生物治疗或细胞治疗。实际上，不论来自骨髓、脐带血或动员的外周血，移植物中含的不仅是造血干细胞，还包括更多的早期造血祖细胞，所谓“造血干细胞移植(HSCT)”实际上是造血干祖细胞移植(HSPCT)。这是当前对“造血干细胞移植”含义崭新的理解。CD34+细胞中90%以上是早期和晚期祖细胞，干细胞只是很小一部分。CD34+细胞移植更应该是造血干祖细胞移植。干细胞的生存必须依赖其周围的祖细胞、淋巴、巨噬、成纤维、内皮和其它各类间质细胞构成的微环境。祖细胞在移植后，反映到外周血相的时间比干细胞早，产生临床效应快。因此，含有造血干细胞、大量祖细胞的CD34+细胞才是理想的移植物。作为造血干细胞临床移植物决不是越纯越好。模拟天然的骨髓中各类造血和间质细胞组成的移植物可能是最佳的。
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二、究竟造血干细胞是CD34阳性还是阴性?
近年来国际文献中有些报告发现CD34/Lin阴性细胞具有长期重建造血的活性，引起了广泛的注意。从发育生物学观点来看，CD34+Lin-细胞来自CD34Lin-的论点是合理可信的。已定向发育为造血系统的干细胞(即造血干细胞)都来自尚未定向的胚胎中胚层干细胞，所以CD34+Lin-细胞起源于CD34-Lin-细胞。当干细胞分化为各系的祖细胞，出现髓/淋巴各系的专一性标志，如淋巴系的CD19/CD7，粒系的CD33/13，红系的CD71，巨核系的CD41/61等等，统称为Lin阳性。当各系祖细胞分化为形态可辨认的骨髓各系原始和幼稚细胞时，CD34抗原标志也消失，成为CD34阴性Lin阳性的细胞。所以，CD34表面标志从无到有，又从有到无，是造血干祖细胞产生、发育、分化和成熟的过程。
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有的作者提出“真正的干细胞都是CD34阴性，而CD34阳性细胞全是祖细胞”等否认CD34+细胞群中含有干细胞的论点，是缺乏科学根据的。多年来，全世界的血液学实验室和大量的临床实践已经充分证明了：在CD34阳性细胞群体中含有可以长期重建髓系和淋巴系造血的干细胞及大量造血祖细胞。CD34阳性细胞已经是公认的理想的造血干祖细胞移植物。
三、嵌合型重建造血与抗肿瘤免疫
造血干祖细胞移植后，可能在宿主体内形成供者与宿主两种造血细胞的嵌合(D/R chimerism),即供者(D)的造血免疫细胞和宿主(R)的造血免疫细胞的嵌合而且又和宿主肿瘤细胞对持。这三者在同一宿主体内持续保持共存，必然有这两种嵌合的异基因淋巴细胞既相争又相容的平衡，这可能激活和增强这两种淋巴细胞对宿主肿瘤细胞的识别和监控，长期地使肿瘤微小残留病灶(minimal residual disease)不致扩增和发展，也就有效地制止肿瘤的临床复发。这就是GvT(GvL)效应。如果移植后在宿主体内没有嵌合型造血，而是全供者型的造血重建(full-donor type reconstitution)，其产生对抗肿瘤的免疫效应可能不如稳定性嵌合型的强。
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四、脐带血造血干祖细胞是婴幼儿患者的最佳选择
对婴幼儿患者进行造血干祖细胞移植的最优选择是未经体外扩增培养的、从脐带血一次分离所得的、含有丰富造血干祖细胞的单个核细胞。婴幼儿做脐带血移植，由于脐带血中缺乏免疫活性细胞又无肿瘤细胞的污染，所以没有必要用MACS二次分离纯化的CD34+细胞。但体外扩增祖细胞时不能用单个核细胞，必须用纯化的CD34+细胞。
用胎盘脐带血中的造血干祖细胞做移植，有很多优点：操作简便，容易得到；无缘供者HLA可以1-3个位点不相合，IV度GvHD发生率很低(<5%)，使侯选的供者大大增加；脐带血中的造血干祖细胞，其重建造血和免疫的活力高于骨髓和外周血；脐带血中CD3+细胞极少，CD8+细胞更少。国外已有临床报告低温保存至少15年后移植仍有效，冻融后CD34+细胞回收率80%。但是，脐带血容量小，含有的造血干祖细胞数量太少。1999年9月Gluckman从临床实践中提出脐带血移植有效剂量为单个核细胞3.7×107/kg。低于这个剂量的，植入率也低。不足1×107/kg的无一例植入。一般一份脐带血的单个核细胞总量仅5-10×108，只够治疗一个婴儿或体重约20～30 kg的少儿。当脐带血移植的有效剂量被越来越多的学者所承认之后，脐带血用于成人也越来越少。一份脐带血单个核细胞总量多达2×109，才可以用于一个50 kg体重的病人。
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为了使脐带血移植于成人，人们探求在体外扩增脐带血CD34+细胞，甚至期求干细胞也扩增。但大量研究报告的结果表明CD34+祖细胞可几十或几百倍地扩增，但无法实现真正的干细胞扩增。少数作者误把祖细胞的扩增称为干细胞扩增。至今国际上还没有一例用脐带血CD34+细胞扩增后移植而在病人体内移植物能维持6个月以上的报告。有力地表明扩增的是祖细胞，而不是干细胞。扩增的CD34+细胞移植后，即使在受者体内长期维持重建造血，也只能说明移植物体外扩增后仍含有干细胞，也不能证明干细胞的扩增。
五、输注的细胞剂量是移植成败的关键
临床的实践证明：细胞剂量是脐带血移植成功的关键。美国Rubinstein认为脐带血有核细胞至少5.0×107/kg，而法国Gluckman提出脐带血有核细胞有效剂量为3.7×107/kg。笔者认为3.3-5.0×107/kg有核细胞为脐带血移植的有效剂量；而1×108/kg是优效剂量。因为1×108个有核细胞中，CD34+细胞才可能达到106。在临床选用供者时，要把细胞输注剂量放在首位。
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Welte报告半相合的有缘供者移植给35例小儿白血病、NHL，MDS等患者用G-CSF动员后经2次分离纯化所得的大剂量(megadose)外周血CD34+细胞2×107/kg移植，移植物中含CD3+细胞控制在2×104/kg以下，17/35存活，16/35无病生存3-38个月。平均第11 d中性粒细胞>500,无一例发生明显的GvHD。1999年欧洲好几个国家都报告用大剂量CD34(+)细胞即107/kg而CD3(+)控制在104/kg，即使3个位点不合的无血缘供者，竟也不出现GvHD，其植入率高，血象回升也早，这些不约而同而又令人振奋的临床报告，给干细胞移植生物学和GVHD的发生机制，提出一些值得研究的课题。
所谓大剂量CD34+细胞，其实主要是大剂量的祖细胞。因为，移植成功所需要的真正干细胞不是很多的。而祖细胞的大剂量输注一定会明显地提前血象的回升，提高干细胞的植入率。
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六、HLA检测分辨率的提高是开展非血缘移植的保证
国外非血缘HLA 3个位点不合而移植成功的报告已经不少。在那些找不到HLA全相合的又急需做造血干祖细胞移植的病人，应该慎重而积极地开展无血缘HLA不全相合的移植(unrelated mismatched transplant)，努力追上和国际间的差距，使更多的病人获救。欧洲的统计，白血病非血缘脐带血移植的病人中HLA 1个位点不合的占44%，2个位点不合的40%，而全相合的仅9%；欧洲白血病非血缘骨髓移植中全相合的占71%，1位点不合的占26%，2个位点不合3%。在应用非血缘供者做造血干细胞移植的经验方面，我国和发达国家之间有很大的差距。开展非血缘HLA 1-2位点不合的移植，HLA配型的技术是成败的关键。国外HLA配型不论Ⅰ或Ⅱ类抗原都已经采用了探针做基因配型(genotyping)。然而，国内目前多数还用表型配型(phenotyping)即血清学配型来检测Ⅰ类抗原。近10年来，用DNA序列又新发现500多个等位基因(alleles)，而新发现的等位基因还不断在增加，使基因配型的分辨率和准确率大大高于血清学配型。同样一对供者和受者样品，用血清方法测出14%不相合，而用分子探针法可测出74%不相合。这可以解释我国一些‘全相合’的移植为什么竟会死于严重的GVHD。总之，基因配型的精确性大大超过血清配型。高精度的HLA配型无疑会显著地提高非血缘不相合移植的成功率。
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七、造血干祖细胞移植研究的新方向
造血干祖细胞以及构成造血微环境的各类间质细胞都来自更早的胚胎干细胞或间叶干干细胞(mesenchyma stem cell, MSC)。发展组织工程新技术，可在体外诱导MSC分化为造血干祖细胞和各类间质细胞，成为理想的重建造血的移植物。胚胎干细胞或间叶干细胞都是CD34阴性细胞，而且Lin标志也阴性。目前有关CD34阴性细胞的研究，如果解决了CD34阴性细胞的纯化技术，将使胚胎干细胞或间叶干细胞诱导分化为造血干祖细胞和各类间质细胞的研究更快地获得成功。
造血干祖细胞移植研究另一个新的发展方向，是用造血干祖细胞做基因治疗。也就是用修饰过基因的造血干细胞进行移植。干细胞是治疗基因在病人体内永久表达的理想宿主细胞。祖细胞也可用来做短期表达治疗基因的宿主细胞。先天性单基因缺损的疾病，糖尿病，高血压病，艾滋病，帕金森病，自身免疫病和恶性肿瘤的基因治疗都可以用造血干细胞做宿主细胞，在病人体内长期表达所转导的治疗基因。如果在造血祖细胞内导入多药耐药基因，便可以大大提高肿瘤的化疗剂量。这类基因治疗，应该用造血祖细胞做宿主细胞，而不是干细胞。因为干细胞大部分处于G0期，对化疗药物并不敏感。要保护的是祖细胞。又因为chemoprotoection也用不着长期，只要求化疗期间短期的效应。用造血干细胞做基因治疗的研究，目前最大的困难是人类造血干细胞的基因导入率非常低。因为，人的造血干细胞表面缺乏装载治疗基因的重组逆转录病毒载体的受体。而且，人的造血干细胞大部分处于G0静止期，用重组逆转录病毒载体装载的治疗基因很难整合到静止期细胞染色体的基因组中去。现在，国外不少先进的实验室正在大力研究。一旦这些难题得到解决，造血干细胞移植治疗的适应症可以大大扩展；肿瘤的治疗也会出现一个新的纪元。, 百拇医药