cDNA阵列和微阵列在鼻咽癌发生机制研究中的应用
作者：姚开泰 何志巍 谢鹭 任彩萍 张玲
单位：湖南医科大学卫生部癌变原理重点实验室，湖南 长沙 410078
关键词：
中国病理生理杂001016
cDNA阵列(cDNA array)或微阵列(microarray)是通过平面微细加工技术在固相表面构建的微流体分析单元和系统，它不但可高敏感地定量、定性检测基因表达水平，且其最大优点是彻底改变了传统的对单个或几个基因表达水平的研究，而可同时研究同一组织或不同组织中成百上千个基因的表达情况。该技术在分析速度成千上万倍提高的同时，所需样品及化学药品却成千上万倍地减少，被认为是生命研究领域中的一次革命。
我们采用该技术成功地对比研究了以下组织间的基因表达谱差异：(1)人胚胎鼻咽在不同发育时间上；(2)小鼠鼻咽与气管、食道、膀胱组织间；(3)成人正常鼻咽与鼻咽癌组织及(4)EBV感染前后及TPA处理前后转染人CR2和突变型鼠CR2的TMNE细胞和SP2/0细胞间。
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一、人胚胎鼻咽组织在不同发育时间上基因表达谱差异的研究
以水囊引产5、6、7、8个月人胚胎鼻咽组织总RNA逆转录标记cDNA探针，与代表588个基因的cDNA阵列进行杂交。该阵列包括A～G七个功能区，分别对应不同的基因。A区：瘤/抑瘤基因，细胞周期调节因子基因；B区：应激反应、离子通道及转运、细胞信号转号调节子及效应子基因；C区：凋亡相关、DNA合成及修复重建基因；D区：转录因子、DNA结合蛋白基因；E区：受体(生长因子及细胞因子、白介素、神经传递子)、细胞表达抗原及细胞粘附基因；F区：细胞间信息传递基因(如生长因子、激素等)；G区：看家基因，仅作为基因表达水平的对照。
结果发现从5月至8月胚胎鼻咽组织基因表达逐渐减少的有Fos相关抗原1、Myc原瘤基因、核因子NF-κB P105、早期生长反应蛋白1(EGRP1)、细胞粘附蛋白1(SQM1)、胰岛素生长因子Ⅱ、热休克27 kD蛋白1等；表达逐渐增加的基因有：热休克86 kD蛋白、泛蛋白、核敏感元素结合蛋白等；而c-Jun、 DNA结合蛋白NFX1等呈一过性表达；同时DNA修复蛋白RAD8、胸腺素β10等基因在鼻咽组织有较恒定水平的表达。
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结果表明：不同胎龄存在多个表达水平不同的基因及同一基因在不同时期表达水平也不一样，与细胞分裂增殖及细胞生长相关的基因早期明显高表达，而DNA修复蛋白基因的广泛表达与组织的抗损伤能力有关。这种在人胚鼻咽发育中的不同时间上基因表达的差异，反映出基因表达的时间性特征。
二、小鼠鼻咽与气管、食道、膀胱组织间基因表达谱差异的研究
如能成功构建小鼠鼻咽癌转基因动物模型，无疑是在研究肿瘤发生机制中的巨大突破，但该模型的构建因缺乏鼻咽癌特异表达的基因及其调控区而停滞不前。故我们采用Mouse AtlasTM cDNA Expression Arrays检测了小鼠的鼻咽、气管、食道和膀胱四种组织中588个基因的表达差异。
结果发现：在鼻咽部有11个基因明显较其余组织高表达，它们是：丁酸盐反应因子Ⅰ、转录因子Sim、神经螺旋-环-螺旋样蛋白、热休克基因转录因子1、视黄酸X受体作用蛋白、转录因子Ⅱ、热休克蛋白27、RNA活化蛋白激酶抑制子、抗细胞死亡Bcl-2结合蛋白、Nm23-M2(C-Myc相关转录因子)和钙结合蛋白，其中部分基因用RT-PCR及Northern blot杂交加以证实。但所筛选的基因范围有限，到底还存在哪些鼻咽部相对特异的基因高表达，值得深入研究。
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三、成人正常鼻咽与鼻咽癌组织间基因表达谱差异的研究
采用588个基因的cDNA阵列对人胚胎鼻咽、成人正常鼻咽和鼻咽癌组织基因表达差异研究发现：有8个基因在人胚鼻咽高表达，如转录因子AP-1、 Fos相关抗原1等，其中4个在NPC中也高表达；6个基因在NPC组织中高表达，如转录因子ETR103、畸胎瘤衍化生长因子(TDGF3)等，其中4个基因在人胚鼻咽组织中也高表达，具有明显的细胞瘤变后的“胚胎化”趋向。
进而用含588个肿瘤相关基因cDNA阵列，建立了鼻咽癌、正常鼻咽及其他几种头颈部肿瘤的基因表达谱，并对与鼻咽癌发生密切相关的功能区：细胞周期/生长调节子、凋亡、瘤基因/抑瘤基因及生长因子/细胞因子相关基因进行了重点分析。结果发现：在细胞周期/生长调节子区的79个基因中，在鼻咽癌中差异表达的有9个。基中上调的基因有Cyclin A, Cyclin Bl, Cyclin D1, Cyclin D2等，显示较强的生长倾向。凋亡基因区包括69个基因，在鼻咽癌中差异表达的有13个，上调的基因中包括BCL-2相关蛋白A1、TRAF3(肿瘤坏死因子受体相关因子)、凋亡抑制蛋白1等，同时也包括凋亡通路作用子如TRAIL(Apo-2配体)，Caspase-1,Caspase-10等。可见在鼻咽癌中凋亡与抗凋亡因素并存，二者力量的消长可能与鼻咽癌的发生发展有密切关系。瘤基因/抑瘤基因区包括29个基因，鼻咽癌中差异表达的有5个。上调的基因有MDM2等，可能与P53在鼻咽癌中缺乏突变及无功能蛋白累积有一定关系。生长因子/细胞因子包括98个基因，鼻咽癌中差异表达的有19个。上调的包括EGR-1(早期生长应答蛋白1)，肝癌来源生长因子，IL-1β，SCF(干细胞因子)，TDGF1(畸胎瘤来源生长因子)，TGF-β，白细胞干扰素类受体基因及调节基因等。下调的基因则有TGF-β2，前B细胞刺激因子等。这一区存在的数目众多的差异表达基因显示出鼻咽癌中有大量淋巴细胞浸润这一特征，而且鼻咽癌浸润淋巴细胞分泌的细胞因子主要为Th1细胞型。以上结果中，从B区选取六个差异表达的基因作RT-PCR，证实基因表达谱结果具可靠性和可重复性，并选择出TRAIL、EGR1、TDGF1基因用免疫组织化学染色及荧光原位杂交(FISH)实验得到进一步证实。
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为进一步了解鼻咽癌与正常鼻咽组织间基因表达的差异，我们采用分别具有5184个基因或表达序列标签(ESTs)的两种微阵例GF200和GF201，与26例病理诊断为鼻咽低分化鳞状细胞癌和16例病理诊断为正常鼻咽组织(癌对侧组织)的总RNA，经逆转录[α-32P]-dCTP标记探针后别杂交，得到了成人正常鼻咽组织和NPC组织中10368个基因或EST的表达谱。再利用该公司所配套的分析软件Pathways 2.0对它们的杂交密度进行分析，得到这两种组织的10368个基因的密度分布图。
在GF200微阵列中密度值在200以上的已知功能基因及未知功能的ESTs在鼻咽癌有110个，鼻咽组织有158人；5个EST在鼻咽癌高表达但鼻咽癌低表达，3个EST在鼻咽癌高表达但正常鼻咽低表达。在GF201微阵列中密度值在200以上的ESTs鼻咽癌组织含有187个， 而鼻咽组织有307个；其中有38个ESTs在鼻咽组织高表达而在NPC中低表达；48个ESTs在鼻咽癌组织中高表达而在鼻咽组织中低表达。结果表明鼻咽癌与正常鼻咽组织存在差异表达基因，还有新基因在鼻咽癌发生中起作用；在此基础上，再根据这些ESTs的组织来源，进而得到了来源于脊椎动物嗅上皮且与在小鼠鼻腔侧部表达的基因Pluc同源的EST M27741。再用差异RT-PCR检测发现，该EST在14例NPC组织中占9/14低表达，仅2例有较高表达，而对照的正常鼻咽组织2/2均与GAPDH有较高表达；进而用Northern blot杂交验证了该EST确实在NPC组织中很低表达而在正常鼻咽中高表达；用原位杂交法也证实该EST在6例正常鼻咽组织及慢性炎症组织中有表达，且主要分布在上皮组织，包括柱状上皮、鳞状上皮和腺上皮，而6例NPC组织中低表达，仅1例有表达。在cDNA IMAGE克隆中筛选出含有该EST的cDNA克隆IMAGE 255754，对该克隆进行鉴定后，提取质粒DNA，再测序得到长度为1096 bp的cDNA，在Genebank，EMBL等数据库中比较表明该cDNA序列所代表的是一个新基因，含有完整的阅读框架，编码256个氨基酸，将之命名为YH1基因，Genbank收录序列号为AF158745。
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用该基因的编码框架875 bp作为探针与含有76种组织的Multiple Tissue Expression Array (MTETM)阵列杂交，通过在不同时间内的X片显影，表明在人气管组织有很高表达，具有相对组织特异性，另外在右心房、空肠、肺组织、唾液腺、胚胎肺组织也有一定量的低表达。该相对特异基因的克隆为建立鼻咽癌转基因动物模型奠定了十分重要的基础。
以上表明，NPC组织中存在多个已知及未知功能的新基因参与作用，这种复杂网络关系的阐明将有助于最终揭开NPC的发生机制。YH1组织相对特异基因的成功克隆为建立鼻咽癌转基因动物模型奠定了十分重要的基础，而该基因的表达下调有助于NPC的发生，为一个新的NPC负相关基因候选者。
四、EBV感染前后及TPA处理前后转染人CR2和突变型鼠CR2的TMNE细胞和SP2/0细胞间基因表达谱差异的研究
采用Mouse cDNA Expression Arrays，我们进一步对EBV进入前后和TPA处理前后细胞基因表达谱进行探讨。结果说明：不同转染细胞(TMNE和SP2/0)中EBV感染前后及TPA处理前后细胞基因表达谱有所不同，甚至某些基因的改变相反，但总的趋势相似。总的来说，通过直接或间接作用EBV感染细胞后基本上是上调细胞基因的表达，主要是激活MAPK信号途径，活化NF-κB、AP1活性，上调多种转录因子及转录增强子的表达，提高Ras、 MDM2瘤基因的活性，从而介导细胞增殖、细胞转化等生物学反应；上调细胞周期正调节子的表达，促进细胞进入细胞周期，加快细胞的分裂；上调白介素受体、整合素、血栓调节素、纤溶酶原活化子的抑制子等基因表达，这些可能都与EBV促进肿瘤的发生、发展有关。有意思的是EBV可以上调TMNE转染细胞中丁酸反应因子的表达，这是否揭示了丁酸可以促进EBV转化鼻咽上皮细胞能力的分子机制所在。TPA作用于转染细胞后可上调细胞中某些基因表达，如myc、myb、raf等多种瘤基因、CCNB2等细胞周期素，A10等转录因子，激活MAPK信号传导途径和蛋白激酶C；同时TPA可以明显下调BRCA、Rb等抑瘤基因的表达，降低细胞周期的负调节子如p27和凋亡相关蛋白CASP2等的活性；TPA还可以改变某些基因的表达如整合素、热休克蛋白、细胞骨架蛋白、胰岛素样生长因子、雌激素受体等。此外，在转染的SP2/0细胞中，TPA可明显上调harakiri凋亡激活子(activator of apoptosis hara-kiri, HRK)的表达，而在转染的TMNE细胞中TPA则可显著地降低HRK的表达，说明TPA对某些基因表达的影响具有组织特异性，也揭示了HRK表达的组织特异性，对于HRK基因功能的了解还有待于进一步探讨。通过比较，我们初步了解EBV和TPA对转染细胞表达谱，为我们进一步研究二者在肿瘤发生发展中的作用打下了良好的基础。
总之，采用cDNA阵列或微阵列对于在研究不同组织或同一组织在不同阶段上的基因表达谱差异方面无疑具有高效、快速的优势，从其差异表达的EST中进而克隆疾病相关基因也是一个十分有效和快速的方法。在鼻咽癌研究方面，我们已经作了以上这些工作，现正开展更大的规模和更深入的研究领域，可望在较短的时间内取得可喜的成绩。, http://www.100md.com
单位：湖南医科大学卫生部癌变原理重点实验室，湖南 长沙 410078
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中国病理生理杂001016
cDNA阵列(cDNA array)或微阵列(microarray)是通过平面微细加工技术在固相表面构建的微流体分析单元和系统，它不但可高敏感地定量、定性检测基因表达水平，且其最大优点是彻底改变了传统的对单个或几个基因表达水平的研究，而可同时研究同一组织或不同组织中成百上千个基因的表达情况。该技术在分析速度成千上万倍提高的同时，所需样品及化学药品却成千上万倍地减少，被认为是生命研究领域中的一次革命。
我们采用该技术成功地对比研究了以下组织间的基因表达谱差异：(1)人胚胎鼻咽在不同发育时间上；(2)小鼠鼻咽与气管、食道、膀胱组织间；(3)成人正常鼻咽与鼻咽癌组织及(4)EBV感染前后及TPA处理前后转染人CR2和突变型鼠CR2的TMNE细胞和SP2/0细胞间。
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一、人胚胎鼻咽组织在不同发育时间上基因表达谱差异的研究
以水囊引产5、6、7、8个月人胚胎鼻咽组织总RNA逆转录标记cDNA探针，与代表588个基因的cDNA阵列进行杂交。该阵列包括A～G七个功能区，分别对应不同的基因。A区：瘤/抑瘤基因，细胞周期调节因子基因；B区：应激反应、离子通道及转运、细胞信号转号调节子及效应子基因；C区：凋亡相关、DNA合成及修复重建基因；D区：转录因子、DNA结合蛋白基因；E区：受体(生长因子及细胞因子、白介素、神经传递子)、细胞表达抗原及细胞粘附基因；F区：细胞间信息传递基因(如生长因子、激素等)；G区：看家基因，仅作为基因表达水平的对照。
结果发现从5月至8月胚胎鼻咽组织基因表达逐渐减少的有Fos相关抗原1、Myc原瘤基因、核因子NF-κB P105、早期生长反应蛋白1(EGRP1)、细胞粘附蛋白1(SQM1)、胰岛素生长因子Ⅱ、热休克27 kD蛋白1等；表达逐渐增加的基因有：热休克86 kD蛋白、泛蛋白、核敏感元素结合蛋白等；而c-Jun、 DNA结合蛋白NFX1等呈一过性表达；同时DNA修复蛋白RAD8、胸腺素β10等基因在鼻咽组织有较恒定水平的表达。
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结果表明：不同胎龄存在多个表达水平不同的基因及同一基因在不同时期表达水平也不一样，与细胞分裂增殖及细胞生长相关的基因早期明显高表达，而DNA修复蛋白基因的广泛表达与组织的抗损伤能力有关。这种在人胚鼻咽发育中的不同时间上基因表达的差异，反映出基因表达的时间性特征。
二、小鼠鼻咽与气管、食道、膀胱组织间基因表达谱差异的研究
如能成功构建小鼠鼻咽癌转基因动物模型，无疑是在研究肿瘤发生机制中的巨大突破，但该模型的构建因缺乏鼻咽癌特异表达的基因及其调控区而停滞不前。故我们采用Mouse AtlasTM cDNA Expression Arrays检测了小鼠的鼻咽、气管、食道和膀胱四种组织中588个基因的表达差异。
结果发现：在鼻咽部有11个基因明显较其余组织高表达，它们是：丁酸盐反应因子Ⅰ、转录因子Sim、神经螺旋-环-螺旋样蛋白、热休克基因转录因子1、视黄酸X受体作用蛋白、转录因子Ⅱ、热休克蛋白27、RNA活化蛋白激酶抑制子、抗细胞死亡Bcl-2结合蛋白、Nm23-M2(C-Myc相关转录因子)和钙结合蛋白，其中部分基因用RT-PCR及Northern blot杂交加以证实。但所筛选的基因范围有限，到底还存在哪些鼻咽部相对特异的基因高表达，值得深入研究。
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三、成人正常鼻咽与鼻咽癌组织间基因表达谱差异的研究
采用588个基因的cDNA阵列对人胚胎鼻咽、成人正常鼻咽和鼻咽癌组织基因表达差异研究发现：有8个基因在人胚鼻咽高表达，如转录因子AP-1、 Fos相关抗原1等，其中4个在NPC中也高表达；6个基因在NPC组织中高表达，如转录因子ETR103、畸胎瘤衍化生长因子(TDGF3)等，其中4个基因在人胚鼻咽组织中也高表达，具有明显的细胞瘤变后的“胚胎化”趋向。
进而用含588个肿瘤相关基因cDNA阵列，建立了鼻咽癌、正常鼻咽及其他几种头颈部肿瘤的基因表达谱，并对与鼻咽癌发生密切相关的功能区：细胞周期/生长调节子、凋亡、瘤基因/抑瘤基因及生长因子/细胞因子相关基因进行了重点分析。结果发现：在细胞周期/生长调节子区的79个基因中，在鼻咽癌中差异表达的有9个。基中上调的基因有Cyclin A, Cyclin Bl, Cyclin D1, Cyclin D2等，显示较强的生长倾向。凋亡基因区包括69个基因，在鼻咽癌中差异表达的有13个，上调的基因中包括BCL-2相关蛋白A1、TRAF3(肿瘤坏死因子受体相关因子)、凋亡抑制蛋白1等，同时也包括凋亡通路作用子如TRAIL(Apo-2配体)，Caspase-1,Caspase-10等。可见在鼻咽癌中凋亡与抗凋亡因素并存，二者力量的消长可能与鼻咽癌的发生发展有密切关系。瘤基因/抑瘤基因区包括29个基因，鼻咽癌中差异表达的有5个。上调的基因有MDM2等，可能与P53在鼻咽癌中缺乏突变及无功能蛋白累积有一定关系。生长因子/细胞因子包括98个基因，鼻咽癌中差异表达的有19个。上调的包括EGR-1(早期生长应答蛋白1)，肝癌来源生长因子，IL-1β，SCF(干细胞因子)，TDGF1(畸胎瘤来源生长因子)，TGF-β，白细胞干扰素类受体基因及调节基因等。下调的基因则有TGF-β2，前B细胞刺激因子等。这一区存在的数目众多的差异表达基因显示出鼻咽癌中有大量淋巴细胞浸润这一特征，而且鼻咽癌浸润淋巴细胞分泌的细胞因子主要为Th1细胞型。以上结果中，从B区选取六个差异表达的基因作RT-PCR，证实基因表达谱结果具可靠性和可重复性，并选择出TRAIL、EGR1、TDGF1基因用免疫组织化学染色及荧光原位杂交(FISH)实验得到进一步证实。
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为进一步了解鼻咽癌与正常鼻咽组织间基因表达的差异，我们采用分别具有5184个基因或表达序列标签(ESTs)的两种微阵例GF200和GF201，与26例病理诊断为鼻咽低分化鳞状细胞癌和16例病理诊断为正常鼻咽组织(癌对侧组织)的总RNA，经逆转录[α-32P]-dCTP标记探针后别杂交，得到了成人正常鼻咽组织和NPC组织中10368个基因或EST的表达谱。再利用该公司所配套的分析软件Pathways 2.0对它们的杂交密度进行分析，得到这两种组织的10368个基因的密度分布图。
在GF200微阵列中密度值在200以上的已知功能基因及未知功能的ESTs在鼻咽癌有110个，鼻咽组织有158人；5个EST在鼻咽癌高表达但鼻咽癌低表达，3个EST在鼻咽癌高表达但正常鼻咽低表达。在GF201微阵列中密度值在200以上的ESTs鼻咽癌组织含有187个， 而鼻咽组织有307个；其中有38个ESTs在鼻咽组织高表达而在NPC中低表达；48个ESTs在鼻咽癌组织中高表达而在鼻咽组织中低表达。结果表明鼻咽癌与正常鼻咽组织存在差异表达基因，还有新基因在鼻咽癌发生中起作用；在此基础上，再根据这些ESTs的组织来源，进而得到了来源于脊椎动物嗅上皮且与在小鼠鼻腔侧部表达的基因Pluc同源的EST M27741。再用差异RT-PCR检测发现，该EST在14例NPC组织中占9/14低表达，仅2例有较高表达，而对照的正常鼻咽组织2/2均与GAPDH有较高表达；进而用Northern blot杂交验证了该EST确实在NPC组织中很低表达而在正常鼻咽中高表达；用原位杂交法也证实该EST在6例正常鼻咽组织及慢性炎症组织中有表达，且主要分布在上皮组织，包括柱状上皮、鳞状上皮和腺上皮，而6例NPC组织中低表达，仅1例有表达。在cDNA IMAGE克隆中筛选出含有该EST的cDNA克隆IMAGE 255754，对该克隆进行鉴定后，提取质粒DNA，再测序得到长度为1096 bp的cDNA，在Genebank，EMBL等数据库中比较表明该cDNA序列所代表的是一个新基因，含有完整的阅读框架，编码256个氨基酸，将之命名为YH1基因，Genbank收录序列号为AF158745。
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用该基因的编码框架875 bp作为探针与含有76种组织的Multiple Tissue Expression Array (MTETM)阵列杂交，通过在不同时间内的X片显影，表明在人气管组织有很高表达，具有相对组织特异性，另外在右心房、空肠、肺组织、唾液腺、胚胎肺组织也有一定量的低表达。该相对特异基因的克隆为建立鼻咽癌转基因动物模型奠定了十分重要的基础。
以上表明，NPC组织中存在多个已知及未知功能的新基因参与作用，这种复杂网络关系的阐明将有助于最终揭开NPC的发生机制。YH1组织相对特异基因的成功克隆为建立鼻咽癌转基因动物模型奠定了十分重要的基础，而该基因的表达下调有助于NPC的发生，为一个新的NPC负相关基因候选者。
四、EBV感染前后及TPA处理前后转染人CR2和突变型鼠CR2的TMNE细胞和SP2/0细胞间基因表达谱差异的研究
采用Mouse cDNA Expression Arrays，我们进一步对EBV进入前后和TPA处理前后细胞基因表达谱进行探讨。结果说明：不同转染细胞(TMNE和SP2/0)中EBV感染前后及TPA处理前后细胞基因表达谱有所不同，甚至某些基因的改变相反，但总的趋势相似。总的来说，通过直接或间接作用EBV感染细胞后基本上是上调细胞基因的表达，主要是激活MAPK信号途径，活化NF-κB、AP1活性，上调多种转录因子及转录增强子的表达，提高Ras、 MDM2瘤基因的活性，从而介导细胞增殖、细胞转化等生物学反应；上调细胞周期正调节子的表达，促进细胞进入细胞周期，加快细胞的分裂；上调白介素受体、整合素、血栓调节素、纤溶酶原活化子的抑制子等基因表达，这些可能都与EBV促进肿瘤的发生、发展有关。有意思的是EBV可以上调TMNE转染细胞中丁酸反应因子的表达，这是否揭示了丁酸可以促进EBV转化鼻咽上皮细胞能力的分子机制所在。TPA作用于转染细胞后可上调细胞中某些基因表达，如myc、myb、raf等多种瘤基因、CCNB2等细胞周期素，A10等转录因子，激活MAPK信号传导途径和蛋白激酶C；同时TPA可以明显下调BRCA、Rb等抑瘤基因的表达，降低细胞周期的负调节子如p27和凋亡相关蛋白CASP2等的活性；TPA还可以改变某些基因的表达如整合素、热休克蛋白、细胞骨架蛋白、胰岛素样生长因子、雌激素受体等。此外，在转染的SP2/0细胞中，TPA可明显上调harakiri凋亡激活子(activator of apoptosis hara-kiri, HRK)的表达，而在转染的TMNE细胞中TPA则可显著地降低HRK的表达，说明TPA对某些基因表达的影响具有组织特异性，也揭示了HRK表达的组织特异性，对于HRK基因功能的了解还有待于进一步探讨。通过比较，我们初步了解EBV和TPA对转染细胞表达谱，为我们进一步研究二者在肿瘤发生发展中的作用打下了良好的基础。
总之，采用cDNA阵列或微阵列对于在研究不同组织或同一组织在不同阶段上的基因表达谱差异方面无疑具有高效、快速的优势，从其差异表达的EST中进而克隆疾病相关基因也是一个十分有效和快速的方法。在鼻咽癌研究方面，我们已经作了以上这些工作，现正开展更大的规模和更深入的研究领域，可望在较短的时间内取得可喜的成绩。, http://www.100md.com