短期制动对兔膝内侧副韧带生物力学与形态学的影响
作者：张长杰 陈晓文
单位：湖南医科大学附属第二医院 长沙 410011
关键词：内侧副韧带；制动；生物力学；形态学
现代康复990819
摘要 目的：阐明制动对兔膝内侧副韧带生物力学与形态学的影响。方法：选用15只兔，10只行右后肢膝关节全屈曲位内固定4周。取内侧副韧带进行生物力学测试和形态学观察。结果：制动侧内侧副韧带横截面积、最大负荷、能量吸收较对侧和对照组减少，只有能量吸收与正常组存在显著差异(P<0.05)，最大应力、弹性模量比较无显著差异，材料常数χ1、χ2与对侧和正常组有显著性差异(P<0.05)。胶原纤维排列类似正常，细胞形态无明显变化，断裂方式全为胫骨止点撕脱。结论：制动4周，对膝内侧副韧带生物力学和形态学影响不明显。
, http://www.100md.com
Effect of Short-Term Immobilization on Biomechanics and morphology of Medial Collateral Ligament in the Knee of Rabbit
Zhang Changjie，Chen Xiaowen.
Department of Rehabilitation Medicine,The Second Affiliated Hospital,Hunan Medical University,Changsha 410011.
Abstract Objective:The paper was to elucidate effect of immobilization on biomechanics and morphology of medial collateral ligament (MCL)in the knee of rabbit.Methods:15 New Zealand White rabbits were assigned to two groups:GroupⅠ,10
, http://www.100md.com
rabbits were immobilized for four weeks;Group Ⅱ ,5 rabbits was served as age-matched normal control.The right hindlimb of each experimental rabbit was surgically immobilized in full flexion(170° )by threaded pin intenal fixation.The biomechanical testing、 histological and ultrastructural evaluation were used.Results:There are not signficantly changed in biomechanical properties of MCL.Histologically,after immobilization for four weeks,arrangement of collagen fibers of MCL was similar to those in normal control under microscope.There was not an alteration in the shape of fibroblast.The failure mode of MCL was by avalsion of tibia insertion sites .Conclusion: Effect of immobilization for four weeks on MCL of rabbit knee was not obvious.
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Key words Medial collateral ligament Immobilization Biomechanics Morphology
制动具有双重效应，一方面，制动作为一种治疗手段应用于临床已有数百年的历史，认为它有助于减轻疼痛，有利于损伤组织愈合。另一方面，人们也逐渐认识到制动对关节的活动和功能产生不利影响。而制动对关节组织的实际生理效应仅仅最近数十年才开始研究。韧带是关节外结缔组织成分之一，因其两端与骨连接构成骨-韧带-骨组合体，易于钳夹，在生物力学试验中具有优势。对膝周的交叉韧带、内侧副韧带已有一些研究，而韧带力学特性改变的机制还未阐明。本文拟选择兔的内侧副韧带(Medial CollateralLigament MCL)作为研究对象，从生物力学、组织形态学方面研究制动对MCL的影响，初步探讨制动后力学特性变化的机制。
1 材料与方法
, 百拇医药
1.1 实验动物及分组 新西兰大白兔15只，兔龄3～5月，体重2.2～2.7kg，随机分为2组，第
1组10只，制动4周，第2组5只，作正常对照。
1.2 内固定制动方法[1] 术前在直径2.0mm的克氏钢针一端制作螺纹，拧上螺帽备用。3%戊巴比妥钠(1ml/kg体重)耳缘静脉注射麻醉。自胫骨上中1/3处切开皮肤，显露胫骨，用骨钻在胫骨上从前至后钻一个洞，将克氏钢针从洞中穿出并经皮肤皱折抵达股骨外侧面皮下，切小口伸出钢针，将钢针弯成一个钩套在股骨上并充分屈曲膝关节，通过螺帽调节屈曲角度使膝固定于屈曲170°位。左侧后肢不固定，作对侧对照。
1.3 肉眼观察 将兔放出笼外观察行走时右后肢负重情况及伤口有无感染。切取标本时观察膝关节及韧带的颜色、质地、有无粘连和组织萎缩。
1.4 形态学观察 麻醉下取内侧副韧带及其止点骨块，骨块脱钙，按组织学常规切片，HE和VG染色法染色。电镜标本将韧带切成为1mm×1mm×1mm大小的组织块，3%戊二醛液固定，0.1M磷酸缓冲液漂洗，锇酸后固定，丙酮脱水，环氧树脂618包埋，LKB4800型超薄切片机切出500～700A°超薄切片，醋酸铀和枸橼酸铅双重染色，JEM-1200EX透射电镜下观察制动后胶原原纤维的排列及成纤维细胞形状。
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1.5 生物力学试验试验 前将冷冻标本解冻，剥离除内侧副韧带外的所有软组织，获取完整的股骨-内侧副韧带-胫骨标本。用游标卡尺(测定精度定为0.02mm)测量MCL在无应力状态下的初始长度，共测3次，求平均值。MCL的横截面积参考Yamamoto等[2]的方法，使用软组织截面面积测微计测量。将试件固定在自制的夹具上，再把夹具固定在CSS-1102C型电子万能试验机上，使韧带的纵轴与拉力线方向一致。试件与夹具浸泡在充满0.9%生理盐水溶液的恒温水箱中，先进行预调，以5mm/min的加载速率，在0～2%应变范围内对试件进行循环加、卸载，进行5次，此时加、卸载曲线趋于重叠，得出的实验数据基本稳定。预调结束后进行拉伸试验及断裂试验，结果由计算机自动记录并打印。在软组织拉伸试验中，常采用Lagaraniar应力。根据实验数据类型，引一维应变能POW作为一维应变E的函数，它对应变E求导，得到一维应力S。
S=2(POW)/2E T=λS(1.5.1)
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其中E=(λ2-1)/2
POW=1/2.x.expx2(E2-E*2)(1.5.2)
其中x1、x2是材料常数，E*是相应在于某一选定的应力S*时的应变，Lagaranien应力T为：
T=x1.E.x2.EXPx2
(E2-E*2)
(1.5.3)
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上式表示MCL的非线性本构方程。
1.6 统计学处理 对结果进行显著性t检验统计学处理。
2 结果
2.1 肉眼观察 制动4周兔行走跳跃时制动侧部分负重，股四头肌有轻度压痕，韧带外观尚正常或有轻度粘连。
2.2 生物力学试验
2.2.1 初长值与横截面积比较 制动4周，MCL初长值(20.68mm)较对侧(20.87mm)，正常组(21.19mm)略短，比较无显著性差异(P>0.05)。MCL横截面积为2.57mm2，对侧为2.97mm2正常组为2.83mm2，与对侧和正常组比较无显著性差异。
, 百拇医药
2.2.2 制动后MCL最大负荷和能量吸收的变化 制动侧最大负荷和能量吸收比较对侧和正常对照减少(见表1)。
表1 制动对MCL最大负荷与能量吸收的影响(
±s) 指标
n
制动侧
对侧
正常组
最大负荷(N)
8
41.94±12.59
56.80±18.12
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56.16±6.17
能量吸收(N.mm)
8
100.28±36.17
149.63±50.47
146.53±6.75
制动侧与对侧和正常组比较P>0.05
2.2.3 制动后MCL材料特性的变化 制动侧最大应力、弹性模量减少，最大应变稍变小，与对侧和正常组差异不显著(P>0.05)(见表2)。
表2 制动对MCL材料特性的影响(±s) 指标
, 百拇医药
n
制动侧
对侧
正常组
最大应力(mPa)
8
16.11±3.47
19.74±6.16
19.91±1.82
最大应变(%)
8
18.03±4.64
21.00±6.87
, 百拇医药
22.41±1.13
弹性模量(mPa)
8
82.52±9.51
90.48±3.53
101.74±26.00
制动侧与对侧、正常组比较P>0.05
2.2.4 MCL的材料常数 制动4周，MCL的x1、x2值与对侧和正常组比较无显著差异(P>0.05)(见表3)。
表3 MCL的材料常数(无量纲) 常数
制动侧
, 百拇医药
对侧
正常组
x1
2.5402±0.5093
1.8764±0.8901
1.8238±0.6571
x2
23.0685±1.6466
31.5279±8.4676
32.4981±4.9762
与对侧和正常组比较P>0.05
, 百拇医药
2.2.5 制动后MCL应力-应变曲线的变化 制动4周，MCL应力-应变曲线与对侧和正常组接近。
2.2.6 制动后MCL的断裂方式 制动4周后韧带骨组合体断裂方式全为胫骨止点撕脱。
2.3 光镜观察结果 制动4周，MCL胶原纤维的排列、?韧带骨止点与正常MCL相似。
2.4 电镜观察结果 4周制动后，胶原原纤维排列、成纤维细胞形状、细胞内器均与正常类似。
3 讨论
短期制动对兔MCL的初长值和横截面积没有明显的影响，其他作者的研究结果与此相似。Walsh等[3]发现制动1月兔内侧副韧带横截面积稍小于正常，而正常稍小于对侧，但没有统计学的显著性差异。最大负荷和能量吸收反映骨_韧带_骨组合体的整体抗张特性。4周制动，MCL最大负荷和能量吸收减少，反映制动影响韧带骨组合体的抗张力能力，韧带的能量储备也降低。Tipton等报道将狗膝固定6周，骨-韧带组合体的最大负荷减少37%。韧带骨组合体结构特性的变化与韧带骨止点的改变有关。
, 百拇医药
制动除影响韧带的结构特性，也影响韧带的材料特性。制动4周，最大应力、弹性模量降低，Bindley等报道大鼠制动韧带的最大应力减少64.2%。韧带物质的材料常数正引起重视，在软组织生物力学试验中，有些作者导出组织的本构方程，据此求出组织的材料常数[4]，本文根据实验数据，推导出MCL的非线性本构方程，显示制动对材料常数x1、x2有明显影响。韧带材料特性的改变，与韧带胶原的代谢变化有关。Amiel等显示兔膝关节制动，MCL胶原合成和降解增加。
实验结果显示，MCL对侧和正常组生物力学指标之间存在差异，提示对侧对照不能代替正常对照。这种差异与制动后对侧的负重和动物全身状态改变有关。Walsh等[3]也观察到对侧MCL与年龄相匹配的正常动物的不同。
在本试验中，韧带试件浸泡在37℃的生理盐水溶液中，接近活体状态，所得出的结果类似于正常生理状态。以往进行软组织生物力学试验时，为防止试件失水，通常采用用棉签将试件浸湿的方法[5]，这增加了操作步骤，能否完全防失水也不能确定。将整个试件浸入特制的双层有机玻璃水箱中，其内充满0.9%的生理盐水溶液，使韧带不失水并保持等渗状态。
, 百拇医药
结果显示，制动4周后尽管生物力学指标已有改变，但并不特别明显，故在临床使用制动时，制动期的选择最好不要超过4周，此时，韧带等关节周围结缔组织的改变较轻微，组织恢复的可能性较大。
参考文献
1 Newton Po,Woosl,Mackenra DA,et al.Immobilization of the knee joint alters the mechanical and ultrastructulre properties of the abbit anterior crclciate ligament .Jorthop Res ,1995,13:191～200
2 Yamamoto N,Hayashi K,kuriyama H,et al.Mechanical properties of the rabbit patellar tendon.J Biomech Eng,1992,114:332～337
, http://www.100md.com
3 Walsh S,Frank C,Shrive N,et al. Knee immobilization inhibits biomechanical maturation of the rabbit medial collateral liga ment.Clin Orthop,1993,297:253～261
4 成海平.脐带静脉的非线性本构关系.湖北医学院学报，1990，11：191～196
5 Woo SL,Newton Po,mackenra DQ,et al.A Comparative evatu alion of the mechanical properties of the rabbit medial collatral and anlerior crdciate ligaments.J Biomech,1992,25:377～386
收稿日期：1998-12-15, 百拇医药
单位：湖南医科大学附属第二医院 长沙 410011
关键词：内侧副韧带；制动；生物力学；形态学
现代康复990819
摘要 目的：阐明制动对兔膝内侧副韧带生物力学与形态学的影响。方法：选用15只兔，10只行右后肢膝关节全屈曲位内固定4周。取内侧副韧带进行生物力学测试和形态学观察。结果：制动侧内侧副韧带横截面积、最大负荷、能量吸收较对侧和对照组减少，只有能量吸收与正常组存在显著差异(P<0.05)，最大应力、弹性模量比较无显著差异，材料常数χ1、χ2与对侧和正常组有显著性差异(P<0.05)。胶原纤维排列类似正常，细胞形态无明显变化，断裂方式全为胫骨止点撕脱。结论：制动4周，对膝内侧副韧带生物力学和形态学影响不明显。
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Effect of Short-Term Immobilization on Biomechanics and morphology of Medial Collateral Ligament in the Knee of Rabbit
Zhang Changjie，Chen Xiaowen.
Department of Rehabilitation Medicine,The Second Affiliated Hospital,Hunan Medical University,Changsha 410011.
Abstract Objective:The paper was to elucidate effect of immobilization on biomechanics and morphology of medial collateral ligament (MCL)in the knee of rabbit.Methods:15 New Zealand White rabbits were assigned to two groups:GroupⅠ,10
, http://www.100md.com
rabbits were immobilized for four weeks;Group Ⅱ ,5 rabbits was served as age-matched normal control.The right hindlimb of each experimental rabbit was surgically immobilized in full flexion(170° )by threaded pin intenal fixation.The biomechanical testing、 histological and ultrastructural evaluation were used.Results:There are not signficantly changed in biomechanical properties of MCL.Histologically,after immobilization for four weeks,arrangement of collagen fibers of MCL was similar to those in normal control under microscope.There was not an alteration in the shape of fibroblast.The failure mode of MCL was by avalsion of tibia insertion sites .Conclusion: Effect of immobilization for four weeks on MCL of rabbit knee was not obvious.
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Key words Medial collateral ligament Immobilization Biomechanics Morphology
制动具有双重效应，一方面，制动作为一种治疗手段应用于临床已有数百年的历史，认为它有助于减轻疼痛，有利于损伤组织愈合。另一方面，人们也逐渐认识到制动对关节的活动和功能产生不利影响。而制动对关节组织的实际生理效应仅仅最近数十年才开始研究。韧带是关节外结缔组织成分之一，因其两端与骨连接构成骨-韧带-骨组合体，易于钳夹，在生物力学试验中具有优势。对膝周的交叉韧带、内侧副韧带已有一些研究，而韧带力学特性改变的机制还未阐明。本文拟选择兔的内侧副韧带(Medial CollateralLigament MCL)作为研究对象，从生物力学、组织形态学方面研究制动对MCL的影响，初步探讨制动后力学特性变化的机制。
1 材料与方法
, 百拇医药
1.1 实验动物及分组 新西兰大白兔15只，兔龄3～5月，体重2.2～2.7kg，随机分为2组，第
1组10只，制动4周，第2组5只，作正常对照。
1.2 内固定制动方法[1] 术前在直径2.0mm的克氏钢针一端制作螺纹，拧上螺帽备用。3%戊巴比妥钠(1ml/kg体重)耳缘静脉注射麻醉。自胫骨上中1/3处切开皮肤，显露胫骨，用骨钻在胫骨上从前至后钻一个洞，将克氏钢针从洞中穿出并经皮肤皱折抵达股骨外侧面皮下，切小口伸出钢针，将钢针弯成一个钩套在股骨上并充分屈曲膝关节，通过螺帽调节屈曲角度使膝固定于屈曲170°位。左侧后肢不固定，作对侧对照。
1.3 肉眼观察 将兔放出笼外观察行走时右后肢负重情况及伤口有无感染。切取标本时观察膝关节及韧带的颜色、质地、有无粘连和组织萎缩。
1.4 形态学观察 麻醉下取内侧副韧带及其止点骨块，骨块脱钙，按组织学常规切片，HE和VG染色法染色。电镜标本将韧带切成为1mm×1mm×1mm大小的组织块，3%戊二醛液固定，0.1M磷酸缓冲液漂洗，锇酸后固定，丙酮脱水，环氧树脂618包埋，LKB4800型超薄切片机切出500～700A°超薄切片，醋酸铀和枸橼酸铅双重染色，JEM-1200EX透射电镜下观察制动后胶原原纤维的排列及成纤维细胞形状。
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1.5 生物力学试验试验 前将冷冻标本解冻，剥离除内侧副韧带外的所有软组织，获取完整的股骨-内侧副韧带-胫骨标本。用游标卡尺(测定精度定为0.02mm)测量MCL在无应力状态下的初始长度，共测3次，求平均值。MCL的横截面积参考Yamamoto等[2]的方法，使用软组织截面面积测微计测量。将试件固定在自制的夹具上，再把夹具固定在CSS-1102C型电子万能试验机上，使韧带的纵轴与拉力线方向一致。试件与夹具浸泡在充满0.9%生理盐水溶液的恒温水箱中，先进行预调，以5mm/min的加载速率，在0～2%应变范围内对试件进行循环加、卸载，进行5次，此时加、卸载曲线趋于重叠，得出的实验数据基本稳定。预调结束后进行拉伸试验及断裂试验，结果由计算机自动记录并打印。在软组织拉伸试验中，常采用Lagaraniar应力。根据实验数据类型，引一维应变能POW作为一维应变E的函数，它对应变E求导，得到一维应力S。
S=2(POW)/2E T=λS(1.5.1)
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其中E=(λ2-1)/2
POW=1/2.x.expx2(E2-E*2)(1.5.2)
其中x1、x2是材料常数，E*是相应在于某一选定的应力S*时的应变，Lagaranien应力T为：
T=x1.E.x2.EXPx2
(E2-E*2)(1.5.3), http://www.100md.com
上式表示MCL的非线性本构方程。
1.6 统计学处理 对结果进行显著性t检验统计学处理。
2 结果
2.1 肉眼观察 制动4周兔行走跳跃时制动侧部分负重，股四头肌有轻度压痕，韧带外观尚正常或有轻度粘连。
2.2 生物力学试验
2.2.1 初长值与横截面积比较 制动4周，MCL初长值(20.68mm)较对侧(20.87mm)，正常组(21.19mm)略短，比较无显著性差异(P>0.05)。MCL横截面积为2.57mm2，对侧为2.97mm2正常组为2.83mm2，与对侧和正常组比较无显著性差异。
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2.2.2 制动后MCL最大负荷和能量吸收的变化 制动侧最大负荷和能量吸收比较对侧和正常对照减少(见表1)。
表1 制动对MCL最大负荷与能量吸收的影响(
±s) 指标n
制动侧
对侧
正常组
最大负荷(N)
8
41.94±12.59
56.80±18.12
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56.16±6.17
能量吸收(N.mm)
8
100.28±36.17
149.63±50.47
146.53±6.75
制动侧与对侧和正常组比较P>0.05
2.2.3 制动后MCL材料特性的变化 制动侧最大应力、弹性模量减少，最大应变稍变小，与对侧和正常组差异不显著(P>0.05)(见表2)。
表2 制动对MCL材料特性的影响(
±s) 指标, 百拇医药
n
制动侧
对侧
正常组
最大应力(mPa)
8
16.11±3.47
19.74±6.16
19.91±1.82
最大应变(%)
8
18.03±4.64
21.00±6.87
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22.41±1.13
弹性模量(mPa)
8
82.52±9.51
90.48±3.53
101.74±26.00
制动侧与对侧、正常组比较P>0.05
2.2.4 MCL的材料常数 制动4周，MCL的x1、x2值与对侧和正常组比较无显著差异(P>0.05)(见表3)。
表3 MCL的材料常数(无量纲) 常数
制动侧
, 百拇医药
对侧
正常组
x1
2.5402±0.5093
1.8764±0.8901
1.8238±0.6571
x2
23.0685±1.6466
31.5279±8.4676
32.4981±4.9762
与对侧和正常组比较P>0.05
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2.2.5 制动后MCL应力-应变曲线的变化 制动4周，MCL应力-应变曲线与对侧和正常组接近。
2.2.6 制动后MCL的断裂方式 制动4周后韧带骨组合体断裂方式全为胫骨止点撕脱。
2.3 光镜观察结果 制动4周，MCL胶原纤维的排列、?韧带骨止点与正常MCL相似。
2.4 电镜观察结果 4周制动后，胶原原纤维排列、成纤维细胞形状、细胞内器均与正常类似。
3 讨论
短期制动对兔MCL的初长值和横截面积没有明显的影响，其他作者的研究结果与此相似。Walsh等[3]发现制动1月兔内侧副韧带横截面积稍小于正常，而正常稍小于对侧，但没有统计学的显著性差异。最大负荷和能量吸收反映骨_韧带_骨组合体的整体抗张特性。4周制动，MCL最大负荷和能量吸收减少，反映制动影响韧带骨组合体的抗张力能力，韧带的能量储备也降低。Tipton等报道将狗膝固定6周，骨-韧带组合体的最大负荷减少37%。韧带骨组合体结构特性的变化与韧带骨止点的改变有关。
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制动除影响韧带的结构特性，也影响韧带的材料特性。制动4周，最大应力、弹性模量降低，Bindley等报道大鼠制动韧带的最大应力减少64.2%。韧带物质的材料常数正引起重视，在软组织生物力学试验中，有些作者导出组织的本构方程，据此求出组织的材料常数[4]，本文根据实验数据，推导出MCL的非线性本构方程，显示制动对材料常数x1、x2有明显影响。韧带材料特性的改变，与韧带胶原的代谢变化有关。Amiel等显示兔膝关节制动，MCL胶原合成和降解增加。
实验结果显示，MCL对侧和正常组生物力学指标之间存在差异，提示对侧对照不能代替正常对照。这种差异与制动后对侧的负重和动物全身状态改变有关。Walsh等[3]也观察到对侧MCL与年龄相匹配的正常动物的不同。
在本试验中，韧带试件浸泡在37℃的生理盐水溶液中，接近活体状态，所得出的结果类似于正常生理状态。以往进行软组织生物力学试验时，为防止试件失水，通常采用用棉签将试件浸湿的方法[5]，这增加了操作步骤，能否完全防失水也不能确定。将整个试件浸入特制的双层有机玻璃水箱中，其内充满0.9%的生理盐水溶液，使韧带不失水并保持等渗状态。
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结果显示，制动4周后尽管生物力学指标已有改变，但并不特别明显，故在临床使用制动时，制动期的选择最好不要超过4周，此时，韧带等关节周围结缔组织的改变较轻微，组织恢复的可能性较大。
参考文献
1 Newton Po,Woosl,Mackenra DA,et al.Immobilization of the knee joint alters the mechanical and ultrastructulre properties of the abbit anterior crclciate ligament .Jorthop Res ,1995,13:191～200
2 Yamamoto N,Hayashi K,kuriyama H,et al.Mechanical properties of the rabbit patellar tendon.J Biomech Eng,1992,114:332～337
, http://www.100md.com
3 Walsh S,Frank C,Shrive N,et al. Knee immobilization inhibits biomechanical maturation of the rabbit medial collateral liga ment.Clin Orthop,1993,297:253～261
4 成海平.脐带静脉的非线性本构关系.湖北医学院学报，1990，11：191～196
5 Woo SL,Newton Po,mackenra DQ,et al.A Comparative evatu alion of the mechanical properties of the rabbit medial collatral and anlerior crdciate ligaments.J Biomech,1992,25:377～386
收稿日期：1998-12-15, 百拇医药