白细胞介素2，4及肿瘤坏死因子对LAK细胞活性的影响
作者：曾争 斯崇文 于敏 田秀兰
单位：100034 北京医科大学第一医院感染疾病科
关键词：白细胞介素2；白细胞介素4；肿瘤坏死因子；杀伤细胞，淋巴因子激活
中华医学杂志940413.htm
摘要 为了提高淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK细胞)对乙肝病毒感染细胞的杀伤活性，研究了白细胞介素2(IL2)，白细胞介素4(IL4)和肿瘤坏死因子(TNF)单独及不同组合时，所诱生的LAK细胞对HepG2细胞和2215细胞的杀伤活性，并初步研究了LAK细胞的活化及杀伤机制。结果表明：三种细胞因子的组合诱导较两种细胞因子组合好，而两两组合又较单独诱导好；另外，IL2单独诱导时，随其剂量的增加，细胞表面IL2受体(IL-2R)表达量也增加，细胞内溶酶体含量也增加，其对靶细胞的杀伤活性也增加，均呈正相关。提示IL-2R和溶酶体可能参与LAK细胞的活化和杀伤机制。
, 百拇医药
国家“七五”慢性肝炎治疗攻关组[1]发现自体淋巴细胞激活的杀伤细胞(LAK细胞)回输疗法治疗慢性乙型肝炎有一定的疗效。而其疗效的提高，关键是寻找能增强LAK细胞对乙型肝炎病毒(HBV)感染细胞的杀伤活性方法。近年来，我们建立的HepG2、2215靶细胞系统，为体外研究某些细胞因子及药物对LAK细胞杀伤HBV感染细胞的活性，并为提高LAK细胞回输疗法治疗慢性乙型肝炎的疗效提供了实验依据。本研究利用这一靶细胞系统，对白细胞介素2(IL2)、白细胞介素4(IL4)和肿瘤坏死因子(TNF)对LAK细胞活性的影响及LAK细胞活化及杀伤机制做了初步探讨。
资料及方法
一、LAK细胞的活性测定
方法见文献[2]。
二、白细胞介素2受体(IL-2R)的测定
, 百拇医药
方法详见文献[3]。
三、LAK细胞溶酶体的测定
方法见文献[4]。
四、统计学方法
结果用
±S(%)表示，统计学方法采用t检验和方差分析。
结 果
一、3种细胞因子单独诱导时，LAK细胞对HepG2和2215细胞的杀伤活性。
对2215细胞的杀伤活性，3种细胞因子单独诱导，以重组白细胞介素2(rIL2)为最好，高于重组肿瘤坏死因子(rTNF)诱生的LAK活性，重组白细胞介素4(rIL4)诱导不出LAK活性；对HepG2细胞的杀伤活性，仅rIL2诱导出杀伤活性，但低于对2215细胞的杀伤活性，rIL4和rTNF均未诱导出杀伤活性(表1)。
, http://www.100md.com
表1 3种细胞因子单独诱生的LAK活性(%，±S)
项目
HepG2细胞
2215细胞
未加细胞因子
0
0
rIL2
6.9±2.9
12.2±1.4*
rIL4
, 百拇医药
0
0
rTNF
0
3.0±3.0*
注：表内数据为重复6次的结果，表2-4同；*与对HepG2细胞的杀伤活性比较，P<0.01
二、3种细胞因子不同组合时，LAK细胞对HepG2和2215细胞的杀伤活性
1.rIL2与rIL4、rTNF组合诱导7天时，诱生的LAK细胞对2215细胞的杀伤活性，由表2可见，3种细胞因子不论是两两组合或是三者组合，均比rIL2单独诱生的LAK活性显著增高，而且小组中(如rIL2+rIL4、rIL2+rIL4+rTNF为一小组，以下类同)三者相加组合较两两组合诱生的LAK活性高；对HepG2细胞的杀伤活性，则与rIL2单独诱生的LAK活性差异无显著意义，而且其对HepG2细胞的杀伤活性低于对2215细胞的杀伤活性(表2)。
, 百拇医药
表2 rIL2与rIL4、rTNF组合诱生的LAK活性(%，±S)
项目
HepG2细胞
2215细胞
未加细胞因子
0
0
rIL2
6.9±2.9
12.2±1.4
rIL2+rIL4
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6.5±4.0
17.1±0.3*
rIL2+rIL4+rTNF
9.8±0.3
21.8±0.9*
rIL2+rTNF
9.7±6.6
24.4±0.8*
rIL2+rTNF+rIL4
8.6±1.4
, 百拇医药
31.1±9.6*
*与对HepG2细胞的杀伤活性比，P<0.01
2.rIL4与rIL2、rTNF组合诱导7天时，LAK细胞对2215细胞的杀伤活性，由表3可见，3种细胞因子相加组合诱生的LAK活性较rIL2单独诱生的LAK活性高，且均较两两组合诱生的LAK活性高，对HepG2细胞的杀伤活性，3种细胞因子相加组合诱生的LAK活性亦均较rIL2单独和两两组合诱生的LAK活性高，将对2215细胞和对HepG2细胞的杀伤活性作一比较，除rIL4+rTNF+rIL2诱生的LAK细胞对2215细胞的杀伤活性低于对HepG2细胞的杀伤活性外，余均高于对HepG2细胞的杀伤活性，或差异无显著意义(rIL4+rIL2 和 rIL4+rIL2+rTNF比较 P<0.05)(表3)。
表3 rIL4与rIL2、rTNF组合诱生的LAK活性(%，±S)
, 百拇医药
项目
HepG2细胞
2215细胞
未加细胞因子
0
0
rIL2
6.9±2.9
12.2±1.4
rIL4+rIL2
4.4±3.4
4.0±3.0*
, http://www.100md.com
rIL4+rIL2+rTNF
14.4±3.5Δ
13.6±10.5*
rIL4+rTNF
2.7±1.7Δ
11.8±1.9
rIL4+rTNF+rIL2
26.9±5.7*
19.3±1.3*
注：与对HepG2细胞杀伤活性比，*P<0.01，ΔP<0.05
, 百拇医药
3.rTNF与rIL2、rIL4组合诱导7天时，LAK细胞对2215细胞的杀伤活性，由表4可见，除rTNF+rIL4诱生的LAK细胞杀伤活性与rIL2诱生的LAK细胞杀伤活性比较，差异无显著意义外，其余的组合均较rIL2诱生的LAK细胞杀伤活性高，且三者相加组合较两两组合高，2215细胞组与HepG2组比较，除rTNF+rIL4这一组合诱生的LAK活性差异无显著意义外，余均较HepG2组活性高。对HepG2细胞的杀伤活性，两两组合诱生的LAK活性与rIL2单独诱生的LAK活性比较差异无显著意义，三者相加组合诱生的LAK活性则较rIL2单独诱生及两两组合诱生的LAK活性高。 表4 rTNF与rIL2、rIL4组合诱生的LAK活性(%，±S)
项目
HepG2细胞
2215细胞
, http://www.100md.com
未加细胞因子
0
0
rIL2
6.9±2.9
12.2±1.4
rTNF+rIL2
10.3±2.2
18.5±3.98*
rTNF+rIL2+rIL4
22.3±8.5*
, 百拇医药
31.1±0.9*
rTNF+rIL4
9.0±5.4
10.7±6.7
rTNF+rIL4+rIL2
26.6±1.2*
28.1±0.5*
注：与对HepG2细胞的杀伤活性比，*P<0.01
三、不同剂量rIL2诱导7天时，对IL-2R及溶酶体的影响
, http://www.100md.com
随着rIL2剂量的增加，未加细胞因子时，细胞表面表达IL2R量(r=0.846，P<0.05)和细胞内溶酶体含量(r=0.946，P<0.05)都明显增加，且均呈正相关。
四、在rIL2诱导下，IL-2R与溶酶体的关系
在rIL2诱导下，IL-2R与溶酶体呈正相关，r=0.966，P<0.05。讨 论
一、rIL2、rIL4和rTNF对LAK活性的影响
LAK细胞是淋巴因子活化的杀伤细胞，是被细胞因子活化的多种免疫杀伤细胞群体，包括NK细胞、Tc细胞、K细胞及巨噬细胞等[5]。不同的杀伤细胞其敏感的靶细胞也不同，K562细胞是NK细胞和LAK细胞的敏感靶细胞，Raji和Daudi细胞是LAK细胞的敏感靶细胞，而NK细胞对其不敏感，故可根据细胞因子诱导后的杀伤细胞对K562细胞、Raji或Daudi细胞的杀伤活性来判断其是否为LAK细胞。
, 百拇医药
我们利用HepG2、、2215靶细胞系统，研究了rIL2、rIL4和rTNF3种细胞因子对LAK活性的影响，结果这三种细胞因子单独诱导时，以rIL2最好，rIL4诱导不出LAK活性，在联合诱导中，三者联合诱导优于两种细胞因子组合的诱导，亦优于rIL2单独的诱导，且杀伤2215细胞的活性普遍高于杀伤HepG2细胞的活性，提示这3种细胞因子组合诱导的LAK细胞可以杀伤乙肝病毒感染的细胞，其中尤以rIL2+rTNF+rIL4，rTNF+rIL2+rIL4和rTNF+rIL4+rIL2这3种组合诱导的LAK活性较高。
另外，我们也初步研究了rIL2、rIL4和rTNF三者之间的关系。目前许多学者认为rIL4无单独诱导LAK活性的作用，且有抑制rIL2诱生LAK活性的作用，我们的结果亦是如此，在表3中，先加rIL4，后加rIL2诱生LAK细胞，杀伤2215细胞的活性较rIL2单独诱生的LAK活性低，提示rIL4抑制rIL2诱生LAK活性。但在上述组合中，加入rTNF，则LAK活性增加，提示rTNF有解除rIL4抑制rIL2诱生LAK活性的作用，与Swisher等[6]和Blay[7]等的报道一致。
, http://www.100md.com
根据上述研究结果，我们认为应用自体LAK细胞回输疗法治疗慢性乙型肝炎，可用rIL2、rIL4和rTNF联合诱导，以不先加rIL4的联合诱导为好，上述结果应进一步作临床验证。
二、LAK活性产生的可能机制
实验结果表明，rIL2诱生LAK细胞时，随剂量的增加，IL-2R表达量增多，细胞内溶酶体含量亦增加，而且IL-2R与溶酶体量呈正相关，根据我们的研究，IL-2R的表达量与LAK活性呈正相关[2]，另外根据Agah等[8]的研究，LAK活性与细胞内的溶酶体含量呈正相关，因此，我们认为LAK活性的产生机制可能是：IL2诱导时，先使LAK前体细胞表面的IL-2R表达增加，使IL2与IL-2R结合增多后，激活细胞内信号传递系统，从而活化细胞内的溶酶体，使其含量增加，而产生LAK活性。因此，细胞因子诱导后，IL-2R表达和溶酶体含量的增加可能参与LAK细胞活化的杀伤机制，但其间的确切机制尚须进一步研究。
, 百拇医药
参 考 文 献
1."七五"慢性肝炎治疗攻关组.自体LAK细胞回输疗法治疗慢性乙型肝炎的临床验证.中华内科杂志,1991, 30 : 27.
2.斯崇文,王勤环,于敏等.慢性肝炎LAK细胞活性变化及影响自体LAK细胞回输疗效的因素.中华内科杂志,1992, 5 : 271.
3.王勤环,斯崇文,席宏丽等.慢性病毒性肝炎病人Tac蛋白变化及其意义探讨.北京医科大学学报,1991, 5 : 385.
4.杨景山.医学细胞化学与细胞生物学技术.北京:北京医科大学,中国协和医科大学联合出版社,1990, 45.
5.Herberman RB. Lymphokine-activated killer cell activity. Immunol Today, 1987, 8 : 178.
, http://www.100md.com
6.Swisher SG, Economou JS, Holmes EC, et al. TNF-alpha and INF-gamma reverse IL-4 inhibition of lymphokion-activated killer cell function. Cell Immunol, 1990, 128 : 450.
7.Blay JY. Brancellec D, Robinet E, et al. Functional ineractions between interleukin-4, interleukin-2 and tumor necrosis factor-alpha for lymphokine-activated killer cell generation. J Clin Lab Anal, 1990, 4 : 54.
8.Agah R, Shau H, Mazumder A, et al. Lysosome rich cells contain the lytic activity of lymphokine-activated killer cell populations. Cancer Immunol Immunother, 1987, 24 : 247.
(收稿：1993-05-02 修回：1993-10-10), 百拇医药
单位：100034 北京医科大学第一医院感染疾病科
关键词：白细胞介素2；白细胞介素4；肿瘤坏死因子；杀伤细胞，淋巴因子激活
中华医学杂志940413.htm
摘要 为了提高淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK细胞)对乙肝病毒感染细胞的杀伤活性，研究了白细胞介素2(IL2)，白细胞介素4(IL4)和肿瘤坏死因子(TNF)单独及不同组合时，所诱生的LAK细胞对HepG2细胞和2215细胞的杀伤活性，并初步研究了LAK细胞的活化及杀伤机制。结果表明：三种细胞因子的组合诱导较两种细胞因子组合好，而两两组合又较单独诱导好；另外，IL2单独诱导时，随其剂量的增加，细胞表面IL2受体(IL-2R)表达量也增加，细胞内溶酶体含量也增加，其对靶细胞的杀伤活性也增加，均呈正相关。提示IL-2R和溶酶体可能参与LAK细胞的活化和杀伤机制。
, 百拇医药
国家“七五”慢性肝炎治疗攻关组[1]发现自体淋巴细胞激活的杀伤细胞(LAK细胞)回输疗法治疗慢性乙型肝炎有一定的疗效。而其疗效的提高，关键是寻找能增强LAK细胞对乙型肝炎病毒(HBV)感染细胞的杀伤活性方法。近年来，我们建立的HepG2、2215靶细胞系统，为体外研究某些细胞因子及药物对LAK细胞杀伤HBV感染细胞的活性，并为提高LAK细胞回输疗法治疗慢性乙型肝炎的疗效提供了实验依据。本研究利用这一靶细胞系统，对白细胞介素2(IL2)、白细胞介素4(IL4)和肿瘤坏死因子(TNF)对LAK细胞活性的影响及LAK细胞活化及杀伤机制做了初步探讨。
资料及方法
一、LAK细胞的活性测定
方法见文献[2]。
二、白细胞介素2受体(IL-2R)的测定
, 百拇医药
方法详见文献[3]。
三、LAK细胞溶酶体的测定
方法见文献[4]。
四、统计学方法
结果用
±S(%)表示，统计学方法采用t检验和方差分析。结 果
一、3种细胞因子单独诱导时，LAK细胞对HepG2和2215细胞的杀伤活性。
对2215细胞的杀伤活性，3种细胞因子单独诱导，以重组白细胞介素2(rIL2)为最好，高于重组肿瘤坏死因子(rTNF)诱生的LAK活性，重组白细胞介素4(rIL4)诱导不出LAK活性；对HepG2细胞的杀伤活性，仅rIL2诱导出杀伤活性，但低于对2215细胞的杀伤活性，rIL4和rTNF均未诱导出杀伤活性(表1)。
, http://www.100md.com
表1 3种细胞因子单独诱生的LAK活性(%，
±S)项目
HepG2细胞
2215细胞
未加细胞因子
0
0
rIL2
6.9±2.9
12.2±1.4*
rIL4
, 百拇医药
0
0
rTNF
0
3.0±3.0*
注：表内数据为重复6次的结果，表2-4同；*与对HepG2细胞的杀伤活性比较，P<0.01
二、3种细胞因子不同组合时，LAK细胞对HepG2和2215细胞的杀伤活性
1.rIL2与rIL4、rTNF组合诱导7天时，诱生的LAK细胞对2215细胞的杀伤活性，由表2可见，3种细胞因子不论是两两组合或是三者组合，均比rIL2单独诱生的LAK活性显著增高，而且小组中(如rIL2+rIL4、rIL2+rIL4+rTNF为一小组，以下类同)三者相加组合较两两组合诱生的LAK活性高；对HepG2细胞的杀伤活性，则与rIL2单独诱生的LAK活性差异无显著意义，而且其对HepG2细胞的杀伤活性低于对2215细胞的杀伤活性(表2)。
, 百拇医药
表2 rIL2与rIL4、rTNF组合诱生的LAK活性(%，
±S)项目
HepG2细胞
2215细胞
未加细胞因子
0
0
rIL2
6.9±2.9
12.2±1.4
rIL2+rIL4
, http://www.100md.com
6.5±4.0
17.1±0.3*
rIL2+rIL4+rTNF
9.8±0.3
21.8±0.9*
rIL2+rTNF
9.7±6.6
24.4±0.8*
rIL2+rTNF+rIL4
8.6±1.4
, 百拇医药
31.1±9.6*
*与对HepG2细胞的杀伤活性比，P<0.01
2.rIL4与rIL2、rTNF组合诱导7天时，LAK细胞对2215细胞的杀伤活性，由表3可见，3种细胞因子相加组合诱生的LAK活性较rIL2单独诱生的LAK活性高，且均较两两组合诱生的LAK活性高，对HepG2细胞的杀伤活性，3种细胞因子相加组合诱生的LAK活性亦均较rIL2单独和两两组合诱生的LAK活性高，将对2215细胞和对HepG2细胞的杀伤活性作一比较，除rIL4+rTNF+rIL2诱生的LAK细胞对2215细胞的杀伤活性低于对HepG2细胞的杀伤活性外，余均高于对HepG2细胞的杀伤活性，或差异无显著意义(rIL4+rIL2 和 rIL4+rIL2+rTNF比较 P<0.05)(表3)。
表3 rIL4与rIL2、rTNF组合诱生的LAK活性(%，
±S), 百拇医药
项目
HepG2细胞
2215细胞
未加细胞因子
0
0
rIL2
6.9±2.9
12.2±1.4
rIL4+rIL2
4.4±3.4
4.0±3.0*
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rIL4+rIL2+rTNF
14.4±3.5Δ
13.6±10.5*
rIL4+rTNF
2.7±1.7Δ
11.8±1.9
rIL4+rTNF+rIL2
26.9±5.7*
19.3±1.3*
注：与对HepG2细胞杀伤活性比，*P<0.01，ΔP<0.05
, 百拇医药
3.rTNF与rIL2、rIL4组合诱导7天时，LAK细胞对2215细胞的杀伤活性，由表4可见，除rTNF+rIL4诱生的LAK细胞杀伤活性与rIL2诱生的LAK细胞杀伤活性比较，差异无显著意义外，其余的组合均较rIL2诱生的LAK细胞杀伤活性高，且三者相加组合较两两组合高，2215细胞组与HepG2组比较，除rTNF+rIL4这一组合诱生的LAK活性差异无显著意义外，余均较HepG2组活性高。对HepG2细胞的杀伤活性，两两组合诱生的LAK活性与rIL2单独诱生的LAK活性比较差异无显著意义，三者相加组合诱生的LAK活性则较rIL2单独诱生及两两组合诱生的LAK活性高。 表4 rTNF与rIL2、rIL4组合诱生的LAK活性(%，
±S)项目
HepG2细胞
2215细胞
, http://www.100md.com
未加细胞因子
0
0
rIL2
6.9±2.9
12.2±1.4
rTNF+rIL2
10.3±2.2
18.5±3.98*
rTNF+rIL2+rIL4
22.3±8.5*
, 百拇医药
31.1±0.9*
rTNF+rIL4
9.0±5.4
10.7±6.7
rTNF+rIL4+rIL2
26.6±1.2*
28.1±0.5*
注：与对HepG2细胞的杀伤活性比，*P<0.01
三、不同剂量rIL2诱导7天时，对IL-2R及溶酶体的影响
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随着rIL2剂量的增加，未加细胞因子时，细胞表面表达IL2R量(r=0.846，P<0.05)和细胞内溶酶体含量(r=0.946，P<0.05)都明显增加，且均呈正相关。
四、在rIL2诱导下，IL-2R与溶酶体的关系
在rIL2诱导下，IL-2R与溶酶体呈正相关，r=0.966，P<0.05。讨 论
一、rIL2、rIL4和rTNF对LAK活性的影响
LAK细胞是淋巴因子活化的杀伤细胞，是被细胞因子活化的多种免疫杀伤细胞群体，包括NK细胞、Tc细胞、K细胞及巨噬细胞等[5]。不同的杀伤细胞其敏感的靶细胞也不同，K562细胞是NK细胞和LAK细胞的敏感靶细胞，Raji和Daudi细胞是LAK细胞的敏感靶细胞，而NK细胞对其不敏感，故可根据细胞因子诱导后的杀伤细胞对K562细胞、Raji或Daudi细胞的杀伤活性来判断其是否为LAK细胞。
, 百拇医药
我们利用HepG2、、2215靶细胞系统，研究了rIL2、rIL4和rTNF3种细胞因子对LAK活性的影响，结果这三种细胞因子单独诱导时，以rIL2最好，rIL4诱导不出LAK活性，在联合诱导中，三者联合诱导优于两种细胞因子组合的诱导，亦优于rIL2单独的诱导，且杀伤2215细胞的活性普遍高于杀伤HepG2细胞的活性，提示这3种细胞因子组合诱导的LAK细胞可以杀伤乙肝病毒感染的细胞，其中尤以rIL2+rTNF+rIL4，rTNF+rIL2+rIL4和rTNF+rIL4+rIL2这3种组合诱导的LAK活性较高。
另外，我们也初步研究了rIL2、rIL4和rTNF三者之间的关系。目前许多学者认为rIL4无单独诱导LAK活性的作用，且有抑制rIL2诱生LAK活性的作用，我们的结果亦是如此，在表3中，先加rIL4，后加rIL2诱生LAK细胞，杀伤2215细胞的活性较rIL2单独诱生的LAK活性低，提示rIL4抑制rIL2诱生LAK活性。但在上述组合中，加入rTNF，则LAK活性增加，提示rTNF有解除rIL4抑制rIL2诱生LAK活性的作用，与Swisher等[6]和Blay[7]等的报道一致。
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根据上述研究结果，我们认为应用自体LAK细胞回输疗法治疗慢性乙型肝炎，可用rIL2、rIL4和rTNF联合诱导，以不先加rIL4的联合诱导为好，上述结果应进一步作临床验证。
二、LAK活性产生的可能机制
实验结果表明，rIL2诱生LAK细胞时，随剂量的增加，IL-2R表达量增多，细胞内溶酶体含量亦增加，而且IL-2R与溶酶体量呈正相关，根据我们的研究，IL-2R的表达量与LAK活性呈正相关[2]，另外根据Agah等[8]的研究，LAK活性与细胞内的溶酶体含量呈正相关，因此，我们认为LAK活性的产生机制可能是：IL2诱导时，先使LAK前体细胞表面的IL-2R表达增加，使IL2与IL-2R结合增多后，激活细胞内信号传递系统，从而活化细胞内的溶酶体，使其含量增加，而产生LAK活性。因此，细胞因子诱导后，IL-2R表达和溶酶体含量的增加可能参与LAK细胞活化的杀伤机制，但其间的确切机制尚须进一步研究。
, 百拇医药
参 考 文 献
1."七五"慢性肝炎治疗攻关组.自体LAK细胞回输疗法治疗慢性乙型肝炎的临床验证.中华内科杂志,1991, 30 : 27.
2.斯崇文,王勤环,于敏等.慢性肝炎LAK细胞活性变化及影响自体LAK细胞回输疗效的因素.中华内科杂志,1992, 5 : 271.
3.王勤环,斯崇文,席宏丽等.慢性病毒性肝炎病人Tac蛋白变化及其意义探讨.北京医科大学学报,1991, 5 : 385.
4.杨景山.医学细胞化学与细胞生物学技术.北京:北京医科大学,中国协和医科大学联合出版社,1990, 45.
5.Herberman RB. Lymphokine-activated killer cell activity. Immunol Today, 1987, 8 : 178.
, http://www.100md.com
6.Swisher SG, Economou JS, Holmes EC, et al. TNF-alpha and INF-gamma reverse IL-4 inhibition of lymphokion-activated killer cell function. Cell Immunol, 1990, 128 : 450.
7.Blay JY. Brancellec D, Robinet E, et al. Functional ineractions between interleukin-4, interleukin-2 and tumor necrosis factor-alpha for lymphokine-activated killer cell generation. J Clin Lab Anal, 1990, 4 : 54.
8.Agah R, Shau H, Mazumder A, et al. Lysosome rich cells contain the lytic activity of lymphokine-activated killer cell populations. Cancer Immunol Immunother, 1987, 24 : 247.
(收稿：1993-05-02 修回：1993-10-10), 百拇医药