复方制剂“稚泻停口服液”中柠檬酸的RP-HPLC测定研究
作者：陈战国 吕九如
单位：陕西师范大学化学系 西安 710062
关键词：RP-HPLC；柠檬酸；乌梅；稚泻停口服液
中草药001211
摘 要 建立了用RP-HPLC法直接测定复方制剂“稚泻停口服液”中柠 檬酸含量的方法。线性回归方程为Y=43 594X-33，r=0.999 8。 线性范围为0.47～15.64 μg，RSD为0.61%，平均回收率为100%(n=7)。一次测定只需20 min，测定时样品无需特殊处理。
Determination of Citric Acid in Compound Chinese Herbal Prepara tion
-“Zhixieting” Oral Liquid by RP-HPLC
, http://www.100md.com
Chen Zhanguo and Lu Jiurn
(Department of Chemistry, Shanxi Normal University Xi'an 710062)
Abstract To establish a method for the determination of citr ic acid in “Zhixieting” oral liquid, which is a compound Chinese herbal prepa ration containing Fructus Mume as the main active ingredient, su pplemented with several other herbal drugs, for the treatment of infantile diarr hea. Contents of citric acid in samples of the preparation were determined by R P -HPLC on SUPELCOSLL LC18 column (15 cm×4.6 mm; 5 μm) with a mobile phase of 0.5% NH4H2PO4 and detected at a wave length of 214 nm. T he linear regression equation was found to be Y=43 594X-33 (r=0.9 9 9 8); linear range of determination, 0.47～15.64 μg; average reco very rate, 100% (n=7);RSD=0.61%; minimum detect ab le amount 2.6×10-7 g; and a single determination needed only 20 min. Th e method proved to be simple, need no pretreatment of sample, and may be recommend ed for the quality control of “Zhixieting” oral liquid.
, 百拇医药
Key words RP-HPLC citric acid Fructus Mume “Zhixieting” oral liquid
复方制剂“稚泻停口服液”是我们近年来研制的一种治疗小儿腹泻的有效药物，临床试验结 果显示，总有效率达97.3%。该药是由乌梅、甘草等多味中药材组成，经提取等工艺制成的 中药制剂。中医理论研究证明，“稚泻停口服液”的止泻功能与其所含的乌梅有直接关系 。现代药理研究证明，乌梅的抗菌和固涩作用与乌梅中的有机酸密切相关[1，2]。 化学成分研究证明，乌梅中除含有多量的柠檬酸和较多量的琥珀酸外，还有少量的酒石酸、 苹果酸、草酸、抗坏血酸以及齐墩果酸[3]。因此，可以认为柠檬酸是乌梅中的有 效成分之一，也是“稚泻停口服液”中的有效成分之一。我们建立了RP-HPLC法直接测 定“稚泻停口服液”中柠檬酸的新方法，该方法也可作为“稚泻停口服液”的质量标准检验 方法。实验证明，该方法简单、准确，回收率在99.5%～101%，快速，一次测定只需20 min 。
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1 实验部分
1.1 仪器与试剂：日本岛津LC-6A 高效液相色谱系统，SPD-6AV 紫外检测器，C-R3A 色谱数据处理仪，柠檬酸、(NH4)H2PO4、H3PO4均为国产AR级。
1.2 色谱条件：色谱柱：SUPELCOSIL，LC-18(15 cm×4.6 mm，5 μm)。流动相：0.5% NH4H2PO4水溶液，用H3PO4调至pH 2.8。流速：1 mL/min，纸速：5 mm/min。A U FS：0.16，检测波长214 nm。
1.3 储备液的配制：取柠檬酸，在80 ℃下烘至恒重，精密称取0.064 6 g，溶于5 0 mL量瓶中，加流动相至刻度。精密移取上述溶液3.00 mL于25 mL量瓶中，加流动相至刻 度，得所需储备液，浓度为155.04 μg/mL。
, 百拇医药
2 实验结果
2.1 标准工作曲线的绘制：在上述色谱条件下，分别取储备液3，5，7，9，11，13，15， 17 μL，注入色谱柱中，每份平行进样3 次，以3 次峰面积的平均值为纵坐标(Y[ WTBZ〗)，以进样量(μg)为横坐标(X)进行线性回归，柠檬酸的回归方程 为Y=43 594X-33，r=0.999 8 ，线性范围为0.47～15.64 μg。色谱图见图1-A。
2.2 精密度试验：精密移取储备液一定量于25 mL
A-柠檬酸 B-稚泻停口服液 C-阴性对照
图1 样品色谱图
量瓶中，加流动相至刻度，摇均，得供 精密度试验用标准溶液，浓度为51.68 μg/mL，每次进标准溶液20 μL，每份平行3 次， 峰面积的精密度测定结果RSD为0.61%。
, 百拇医药
2.3 最低检出量：在0.16 AUFS时，按色谱要求，以噪音的3 倍峰高计算柠檬的最低检出 量为2.6×10-7 g。
2.4 干扰性试验：在上述色谱条件下，按样品测定法进样10 μL，色谱图见图1-B。由色 谱图可知，柠檬酸可与其它组分完全分离，无干扰。
2.5 阴性对照试验：按制备工艺，制备缺乌梅供试液。按样品测定进行色谱分析，柠檬酸 峰消失，说明柠檬酸来自乌梅中。见图1-C。
2.6 稳定性试验：储备液在1，2，4，6，8，10，12 h时分别进样10 μL，每份平行进样3 次，测得日内RSD为0.65%。在24，48，72，96 h时分别进样15 μL，每 份进样3 次，测得日间RSD为6.7%。说明在12 h内柠檬酸测定的稳定性良 好。
2.7 回收率试验：取已知浓度的口服液7 份，分别精密加入柠檬酸固体30.63，31.53， 32 .31，33.52，34.14，34.83，35.66 mg于上述7 份口服液中，使其完全溶解，微孔滤 膜(0.45 μm)过滤，最后分别定容到100 mL量瓶中，按样品测定法测定回收率，7 次测定 回 收率平均结果为100%，RSD=0.48%。
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2.8 样品测定：取3 批10 mL装口服液各10 支，用微孔滤膜(0.45 μm)过滤，分别移取1 0 mL滤液于100 mL量瓶中，加流动相至刻度，摇匀后每批各平行进样4 次，每次进样10 μL ，峰面积取平均值，分别代入回归方程，外标法定量。3 批稚泻停口服液中柠檬酸的含量测 定结果见表1。
3 讨论
3.1 本文优化的色谱条件下用RP-HPLC法测定
表1 稚泻停口服液中柠檬酸的含量测定结果 批 号
测定结果(μg/mL)
平均含量(μg/mL)
99411
2 146.8
, 百拇医药
99418
2 147.2
2 147.0
99420
2 147.0
复方制剂“稚泻停口服液”中柠檬酸含量， 由色谱图可以看出，柠檬酸能与其它组分完全分离，同时柠檬酸附近的其它组分响应值也较 低。
3.2 柠檬酸的最大吸收波长在190 nm，但在实验中发现，在190 nm处，色谱图变得十分复 杂，其它组分响应值也较高，其它组分与柠檬酸几乎无法分离。选取波长为214 nm，此时色 谱图变得较为简单，分离效果好。
3.3 本方法可作为稚泻停口服液有效成分含量测定的方法，由测定结果来看，柠檬酸 含量的平均值为2 147.0 μg/mL。为了便于控制质量，稚泻停口服液中柠檬酸的含量 建议控制在2 100～2 200 μg/mL范围内。
, http://www.100md.com
3.4 本方法的另一特点是样品不需特殊处理可直接进行色谱测定。
Address： Chen Zhanguo, Department of Chemistry, Shanxi Normal Un iversity, Xi'an
陈战国 男，1960年生，高级工程师，理学硕士。长期从事药物分析研究工作。1981年毕业 于陕西师范大学化学系，现任化学系化学实验教学中心副主任。1991年至1999年获省、部级 科学技术进步奖三项，发表论文40 余篇。共同承担并完成国家自然科学基金项目一项，陕 西省自然科学基金项目二项。研制出三类中药“稚泻停冲剂”一种，四类中药“稚泻停口服 液”一种，五类西药“盐酸二甲双胍”(治糖尿病药)粉剂和片剂生产工艺两项。
参 考 文 献
1，沈红梅，乔传卓，苏中武，等.中成药，1993，15(7)：35
2，仓田英明，王正德，成井孝雄，他.生药学杂志，1990，44(2)：101
3，李时珍.本草纲目(校点本下册)第一版.北京：人民卫生出版社，1982：1736
(2000-01-14收稿), 百拇医药
单位：陕西师范大学化学系 西安 710062
关键词：RP-HPLC；柠檬酸；乌梅；稚泻停口服液
中草药001211
摘 要 建立了用RP-HPLC法直接测定复方制剂“稚泻停口服液”中柠 檬酸含量的方法。线性回归方程为Y=43 594X-33，r=0.999 8。 线性范围为0.47～15.64 μg，RSD为0.61%，平均回收率为100%(n=7)。一次测定只需20 min，测定时样品无需特殊处理。
Determination of Citric Acid in Compound Chinese Herbal Prepara tion
-“Zhixieting” Oral Liquid by RP-HPLC
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Chen Zhanguo and Lu Jiurn
(Department of Chemistry, Shanxi Normal University Xi'an 710062)
Abstract To establish a method for the determination of citr ic acid in “Zhixieting” oral liquid, which is a compound Chinese herbal prepa ration containing Fructus Mume as the main active ingredient, su pplemented with several other herbal drugs, for the treatment of infantile diarr hea. Contents of citric acid in samples of the preparation were determined by R P -HPLC on SUPELCOSLL LC18 column (15 cm×4.6 mm; 5 μm) with a mobile phase of 0.5% NH4H2PO4 and detected at a wave length of 214 nm. T he linear regression equation was found to be Y=43 594X-33 (r=0.9 9 9 8); linear range of determination, 0.47～15.64 μg; average reco very rate, 100% (n=7);RSD=0.61%; minimum detect ab le amount 2.6×10-7 g; and a single determination needed only 20 min. Th e method proved to be simple, need no pretreatment of sample, and may be recommend ed for the quality control of “Zhixieting” oral liquid.
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Key words RP-HPLC citric acid Fructus Mume “Zhixieting” oral liquid
复方制剂“稚泻停口服液”是我们近年来研制的一种治疗小儿腹泻的有效药物，临床试验结 果显示，总有效率达97.3%。该药是由乌梅、甘草等多味中药材组成，经提取等工艺制成的 中药制剂。中医理论研究证明，“稚泻停口服液”的止泻功能与其所含的乌梅有直接关系 。现代药理研究证明，乌梅的抗菌和固涩作用与乌梅中的有机酸密切相关[1，2]。 化学成分研究证明，乌梅中除含有多量的柠檬酸和较多量的琥珀酸外，还有少量的酒石酸、 苹果酸、草酸、抗坏血酸以及齐墩果酸[3]。因此，可以认为柠檬酸是乌梅中的有 效成分之一，也是“稚泻停口服液”中的有效成分之一。我们建立了RP-HPLC法直接测 定“稚泻停口服液”中柠檬酸的新方法，该方法也可作为“稚泻停口服液”的质量标准检验 方法。实验证明，该方法简单、准确，回收率在99.5%～101%，快速，一次测定只需20 min 。
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1 实验部分
1.1 仪器与试剂：日本岛津LC-6A 高效液相色谱系统，SPD-6AV 紫外检测器，C-R3A 色谱数据处理仪，柠檬酸、(NH4)H2PO4、H3PO4均为国产AR级。
1.2 色谱条件：色谱柱：SUPELCOSIL，LC-18(15 cm×4.6 mm，5 μm)。流动相：0.5% NH4H2PO4水溶液，用H3PO4调至pH 2.8。流速：1 mL/min，纸速：5 mm/min。A U FS：0.16，检测波长214 nm。
1.3 储备液的配制：取柠檬酸，在80 ℃下烘至恒重，精密称取0.064 6 g，溶于5 0 mL量瓶中，加流动相至刻度。精密移取上述溶液3.00 mL于25 mL量瓶中，加流动相至刻 度，得所需储备液，浓度为155.04 μg/mL。
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2 实验结果
2.1 标准工作曲线的绘制：在上述色谱条件下，分别取储备液3，5，7，9，11，13，15， 17 μL，注入色谱柱中，每份平行进样3 次，以3 次峰面积的平均值为纵坐标(Y[ WTBZ〗)，以进样量(μg)为横坐标(X)进行线性回归，柠檬酸的回归方程 为Y=43 594X-33，r=0.999 8 ，线性范围为0.47～15.64 μg。色谱图见图1-A。
2.2 精密度试验：精密移取储备液一定量于25 mL
A-柠檬酸 B-稚泻停口服液 C-阴性对照
图1 样品色谱图
量瓶中，加流动相至刻度，摇均，得供 精密度试验用标准溶液，浓度为51.68 μg/mL，每次进标准溶液20 μL，每份平行3 次， 峰面积的精密度测定结果RSD为0.61%。
, 百拇医药
2.3 最低检出量：在0.16 AUFS时，按色谱要求，以噪音的3 倍峰高计算柠檬的最低检出 量为2.6×10-7 g。
2.4 干扰性试验：在上述色谱条件下，按样品测定法进样10 μL，色谱图见图1-B。由色 谱图可知，柠檬酸可与其它组分完全分离，无干扰。
2.5 阴性对照试验：按制备工艺，制备缺乌梅供试液。按样品测定进行色谱分析，柠檬酸 峰消失，说明柠檬酸来自乌梅中。见图1-C。
2.6 稳定性试验：储备液在1，2，4，6，8，10，12 h时分别进样10 μL，每份平行进样3 次，测得日内RSD为0.65%。在24，48，72，96 h时分别进样15 μL，每 份进样3 次，测得日间RSD为6.7%。说明在12 h内柠檬酸测定的稳定性良 好。
2.7 回收率试验：取已知浓度的口服液7 份，分别精密加入柠檬酸固体30.63，31.53， 32 .31，33.52，34.14，34.83，35.66 mg于上述7 份口服液中，使其完全溶解，微孔滤 膜(0.45 μm)过滤，最后分别定容到100 mL量瓶中，按样品测定法测定回收率，7 次测定 回 收率平均结果为100%，RSD=0.48%。
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2.8 样品测定：取3 批10 mL装口服液各10 支，用微孔滤膜(0.45 μm)过滤，分别移取1 0 mL滤液于100 mL量瓶中，加流动相至刻度，摇匀后每批各平行进样4 次，每次进样10 μL ，峰面积取平均值，分别代入回归方程，外标法定量。3 批稚泻停口服液中柠檬酸的含量测 定结果见表1。
3 讨论
3.1 本文优化的色谱条件下用RP-HPLC法测定
表1 稚泻停口服液中柠檬酸的含量测定结果 批 号
测定结果(μg/mL)
平均含量(μg/mL)
99411
2 146.8
, 百拇医药
99418
2 147.2
2 147.0
99420
2 147.0
复方制剂“稚泻停口服液”中柠檬酸含量， 由色谱图可以看出，柠檬酸能与其它组分完全分离，同时柠檬酸附近的其它组分响应值也较 低。
3.2 柠檬酸的最大吸收波长在190 nm，但在实验中发现，在190 nm处，色谱图变得十分复 杂，其它组分响应值也较高，其它组分与柠檬酸几乎无法分离。选取波长为214 nm，此时色 谱图变得较为简单，分离效果好。
3.3 本方法可作为稚泻停口服液有效成分含量测定的方法，由测定结果来看，柠檬酸 含量的平均值为2 147.0 μg/mL。为了便于控制质量，稚泻停口服液中柠檬酸的含量 建议控制在2 100～2 200 μg/mL范围内。
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3.4 本方法的另一特点是样品不需特殊处理可直接进行色谱测定。
Address： Chen Zhanguo, Department of Chemistry, Shanxi Normal Un iversity, Xi'an
陈战国 男，1960年生，高级工程师，理学硕士。长期从事药物分析研究工作。1981年毕业 于陕西师范大学化学系，现任化学系化学实验教学中心副主任。1991年至1999年获省、部级 科学技术进步奖三项，发表论文40 余篇。共同承担并完成国家自然科学基金项目一项，陕 西省自然科学基金项目二项。研制出三类中药“稚泻停冲剂”一种，四类中药“稚泻停口服 液”一种，五类西药“盐酸二甲双胍”(治糖尿病药)粉剂和片剂生产工艺两项。
参 考 文 献
1，沈红梅，乔传卓，苏中武，等.中成药，1993，15(7)：35
2，仓田英明，王正德，成井孝雄，他.生药学杂志，1990，44(2)：101
3，李时珍.本草纲目(校点本下册)第一版.北京：人民卫生出版社，1982：1736
(2000-01-14收稿), 百拇医药