柴胡皂甙对FSC激活及合成细胞外基质的实验研究
作者：陈 爽 贲长恩 杨美娟 于世瀛 赵丽云 赵福建
单位：北京中医药大学组织胚胎学教研室 北京100029
关键词：柴胡皂甙；贮脂细胞；细胞外基质；细胞培养；库普弗细胞；肝实质细胞；免疫化学
北京中医药大学学报990110 摘 要：观察柴胡有效成分柴胡皂甙对原代培养贮脂细胞(FSC)激活及合成细胞外基质(ECM)的作用。结果：治疗组库普弗细胞条件培养基(TKCncm)、治疗CCl4损伤库普弗细胞条件培养基(TKCtcm)、TKCncm加肝细胞条件培养基(PCncm)组FSC内结蛋白阳性反应明显减弱，对细胞表型转化的形态学特征有一定改善，各治疗组FSC的DNA合成及3H-脯氨酸掺入量均呈不同程度降低，FSC内Ⅰ型胶原含量明显减少。说明柴胡皂甙对肝细胞具有保护作用，直接抑制FSC内DNA的合成，还可抑制FSC的激活，从而抑制FSC合成ECM的能力。
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A Clinical Study on the Saikosaponin on FSC Activation and
Extracellular Matrix Synthesis
Chen Shuang(陈 爽),Ben Changen(贲长恩),Yang Meijuan(杨美娟),et al.
(Beijing University of Traditional Chinese Medicine, Beijing 100029)
ABSTRACT: Objective: to observe the effects of Saikosaponin, an ef fective component of Bupleurum, on activating the primary cultured Fat Store Cells (FSC ) and synthesizing extracellular matrix (ECM). Method: utilizing ultrastructure, immunocytochemistry and image pattern analysis to examine contents of collagen type 1, 3, 4 and fibronectin (FN) in FSC; using flow Cytomater to determine cont ent of DNA and measure 3H-Proline incorporation volume so as to detect collag en protein volume in FSC. Result: positive reaction of the desmin was markedly weak ened in the groups of TKCnem, TKCtem and TKCnem plus Pcnem. For the transformati on of cell phenotype, the morphological character was improved. In other treatme nt groups on FSC, DNA synthesis and 3H-Proline incorporation volume were decr eas ed at different levels. In all treatment groups, volume of collagen type 1 was d ecreased markedly, especially groups of TKCnem and TKCtem. Conclusion: Saikosapo nin can protect the hepatocytes. It could inhibit the DNA synthesis and the FSC activation so to inhibit the ECM synthesis.
, 百拇医药
KEY WORDS: Saikosaponin; FSC; ECM; Kupffer's Cell; Immunochemistry ; Liver Parenchymal Cell
柴胡皂甙的抗炎、保肝、镇静、镇痛、增强免疫机能等效应，已为临床及实验研究所证实[1～4]。但有关其抗肝纤维化的作用及其作用机制，尤其是在体外培养条件下柴胡皂甙对原代培养贮脂细胞(FSC)的激活及合成细胞外基质(ECM)的干预作用尚未见报道。我们在肝脏细胞间调节网络的实验研究[5～7]基础上进一步就柴胡皂甙对FSC激活及合成ECM进行了实验研究。
1 材料和方法
1.1 动物与试剂
雄性Wistar大鼠，以CCl4与橄榄油等量混合，皮下注射1次(150μL/g)，4d后用于实验。试剂全部为Sigma公司产品，ABC试剂盒、兔抗鼠二抗、猪抗兔二抗为DAKO公司产品，3H-脯氨酸购自中国原子能科学研究所。
, 百拇医药
1.2 肝实质细胞(PC)、库普弗细胞(KC)、FSC分离与培养
分离PC、KC选用体重140～180g大鼠；分离FSC选用体重450～550g大鼠。PC、KC分别由正常和CCl4损伤大鼠分离获得，FSC则由正常大鼠分离获取。分离及培养方法同文献[5～7]。
1.3 条件培养液的制备
由正常、CCl4损伤大鼠分离PC、KC培养后提取培养液，分别记作贮脂细胞条件培养基(PCncm)、CCl4损伤库普弗细胞条件培养基(KCncm)、库普弗细胞条件培养基(KCtcm)。由正常大鼠分离FSC，培养后分别提取“静息”FSC，自发激活的FSC培养液，分别记作贮脂细胞条件培养基(FSCncm)、CCl4损伤贮脂细胞条件培养基(FSCtcm)。制备方法同文献[5～7]。
, 百拇医药
1.4 实验分组
各实验组FSC以含有10%胎牛血清的DMEM培养48h后，分别换用稀释度为1∶4的KC、PC各条件培养液及其相对应的条件培养基，各相应治疗组记作“T”，同时加入50μg/mL柴胡皂甙(由中国医学科学院药物研究所提供)，以后每隔48h换液，以同样条件继续培养，至8d取样进行各项指标检测。实验分组：对照组、KCncm、KCtcm、PCncm、PCtcm(CCl4损伤肝细胞条件培养基)、KCncm+PCncm、KCncm+PCtcm7组不加入柴胡皂甙；而T对照组、TKCncm(治疗库普弗细胞条件培养基)、TKCtcm(治疗CCl4损伤库普弗细胞条件培养基)、PCncm、PCtcm、KCncm、PCncm、KCncm+PCtcm7组分别加入柴胡皂甙(50μg/mL)。
各实验组PC以含有10%小牛MEM培养液及其相对应的条件培养基培养4h后，分别换用无血清MEM培养液及稀释度为1∶4的KC、FSC条件培养基培养，各相应治疗组记作“T”，同时加入50μg/mL柴胡皂甙，24h后取样，进行各项指标检测。实验分组：对照组、KCncm、KCtcm、FSCncm、FSCtcm5组不加入柴胡皂甙；而T对照组、TKCncm、TKCtcm、TFSCncm(治疗贮脂细胞条件培养基)、TFSCtcm(治疗CCl4损伤贮脂细胞条件培养基)5组均加入柴胡皂甙(50μg/mL)。
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1.5 透射电镜标本制备
常规清洗，3%戊二醛磷酸缓冲液固定，离心，再固定，脱水，树脂包埋，薄切80nm，电子染色，JEM-1200EX电镜观察。
1.6 流式细胞仪检测细胞内DNA含量
弃去培养液，加入0.25%胰酶200～400μL，在倒置显微镜下观察，细胞稍变圆时，加入30～50μL小牛血清终止消化。用吸管反复吹打，200r/min，离心7min收集细胞，加入3～4mL无Ca2+、Mg2+PBS液，离心7min，弃上清，约留0.5mL细胞悬液，振荡使细胞分离。用注射器迅速将细胞注入70%4℃冷乙醇中，置4℃冰箱固定18h。调细胞悬液为106个/mL，加入RNA酶A(每样品50μg/mL)，至37℃水浴中孵育30min后，立即放入冰箱中，终止RNA酶的作用。加入50μg/mL碘化丙啶液，进行DNA染色。上机前尼龙网过滤。BECTONFACS420流式细胞仪，在激发光为480nm，发射光为585nm条件下，检测DNA含量。
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1.7 3H-脯氨酸掺入检测
每孔加入3H-脯氨酸1μci/mL，培养48h后弃去培养液，加入0.25%胰酶90μL，倒置显微镜下观察，细胞变圆后加入10μL小牛血清，吹打细胞至脱壁，49型玻璃纤维滤纸收集细胞，美国BeckmanLS5801型液体闪烁计数仪进行胶原蛋白合成总量的检测。
1.8 免疫细胞化学及图像分析
以稀释度为1∶4的不同条件培养基培养24h后，取出盖玻片，用ABC免疫酶法分别检测细胞内Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型胶原和纤维粘连蛋白(FN)，并用美国TN-8502型图像分析仪测量[7]。
2 结果
2.1 各组FSC表型的转化
, 百拇医药
2.1.1 结蛋白免疫组化观察：各实验组结蛋白均呈阳性反应，反应颗粒呈棕褐色，位于核周，胞突内阳性颗粒较少。与对照组相比KCncm、KCncm+PCncm各处理组阳性反应明显增强。与实验组相比，相应的TKCncm、TKCncm+PCncm治疗组阳性反应呈不同程度减弱，以TKCcnm各组减弱最为明显。
2.1.2 透射电镜观察：KCncm、KCncm+PCncm各处理组则表现出明显的表型转化特征，内质网增多、扩张；高尔基复合体肥大；胞膜下出现成束平行排列的微丝。与各实验组相比，相应的治疗组表现为TKCncm、TKCncm+PCncm各组FSC表型转化特征有一定程度改善。
2.2 FSC内DNA含量检测
流式细胞仪检测结果是各治疗组FSC内DNA含量均明显增加，与对照组相比具有统计学意义；与相应的治疗组相比，T对照组(DMEM)、TKCncm、TKCtcm,DNA含量分别下降27.00%、17.26%、14.00%，其中以TKCncm、TKCtcm组具有统计学意义(见表1)。
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2.3 FSC内胶原蛋白总量的检测
各实验组FSC内3H-脯氨酸掺入量均明显增多，与对照组相比具有统计学意义；与相应的实验组相比：T对照组(DMEM)、TKCncm、TKCtcm、TKCncm+PCncm、TKCncm+PCtcm其掺入量分别下降21%、19%、28%、18%、11%；而TPCncm、TPCtcm组变化不明显(见表1)。
表1 各组FSC内DNA含量及3H-脯氨酸掺入量(
±s) FSC培养条件
DNA含量(道数；n=3)
3H-脯氨酸掺入量(CPM；n=4)
治疗组
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实验组
实验组
治疗组
DMEM
108.95±11.30
79.67±16.01
88.58±8.90
69.20±9.30
KCncm
337.75±10.97**
279.44±10.07△△
, 百拇医药
329.18±18.09**
267.42±10.17△△
KCtcm
435.80±24.41**
374.11±25.29△
398.61±26.69**
287.32±12.29△△
PCncm
283.27±26.50**
, 百拇医药
264.24±12.51
177.70±12.43**
158.06±12.51
PCtcm
261.48±28.95**
239.89±29.64
169.44±16.58**
150.24±20.48
KCncm+PCncm
491.22±22.11**
, 百拇医药
448.29±20.48
445.25±26.74**
364.28±20.48
KCtcm+PCtcm
466.90±27.03**
439.66±31.28
434.04±24.34**
385.99±21.28
注：与DMEM组比**P<0.01；与各相应实验组比△P<0.05 △△P<0.012.4 胶原免疫细胞化学观察
各实验组FSCⅠ、Ⅲ、Ⅳ型胶原均呈棕褐色阳性反应。细胞呈梭形，胞质内含有丰富的阳性反应颗粒，多分布于核周围，胞质突起内着色较浅。Ⅰ型胶原与对照组相比KCncm、KCncm+PCncm各实验组阳性反应明显增强。各治疗组其阳性反应均有不同程度减弱；与相应的实验组相比，各治疗组FSC内Ⅰ型胶原含量均有下降，除T对照组外，均具有统计学意义。Ⅲ型胶原特点是与相应实验组相比，TKCncm、TKCtcm组Ⅲ型胶原含量分别下降25%、15%，具有统计学意义，其余各组均呈下降趋势。Ⅳ型胶原特点是与相应实验组相比，TKCncm组下降31%，具有统计学意义。TKCtcm、TKCncm+PCncm、TKCncm+PCtcm组呈明显下降趋势(见表2)。
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表2 各组FSCⅠ、Ⅲ、Ⅳ型胶原含量(±s) FSC培养条件
Ⅰ型胶原含量(MOD；n=8)
Ⅲ型胶原含量(MOD；n=6)
Ⅳ型胶原含量(MOD；n=6)
实验组
治疗组
实验组
治疗组
实验组
治疗组
, 百拇医药 DMEM
192.48±56.89
109.23±45.54
174.40±33.01
166.67±25.07
99.54±23.07
101.87±14.18
KCncm
390.61±21.30*
240.64±27.76△△
246.28±23.34*
, 百拇医药
184.40±23.01△
182.68±20.02*
126.05±12.52△
KCtcm
718.72±53.63**
575.61±38.12△
661.67±46.63**
563.74±15.09△
351.88±35.69**
, 百拇医药
283.74±45.09
PCncm
224.05±19.28
144.64±31.46△
204.30±19.91
197.47±10.11
147.48±41.26
118.17±12.09
PCtcm
203.90±20.24
150.04±25.25
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194.04±30.82
167.79±12.53
136.48±18.60
138.75±36.02
KCncm+PCncm
495.98±12.67**
330.09±61.17△
449.60±31.95**
343.76±55.85
244.02±21.24**
, 百拇医药
186.48±38.60△
KCncm+PCtcm
484.94±45.11**
458.36±62.10△
424.23±30.18**
388.49±68.91
264.39±66.43*
231.18±49.08△
注：与DMEM组比*P<0.05 **P<0.01；与各相应实验组比 △P<0.05 △△P<0.012.5 纤维粘连蛋白(FN)免疫细胞化学观察
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各实验组FSC内FN均呈棕褐色阳性反应颗粒，多分布于核周。与对照组相比，KCncm、KCncm+PCncm各实验组阳性反应明显增强；与相应实验组相比，TKCncm组下降30%；TKCtcm、TKCncm+PCncm各组呈明显下降趋势(见表3)。
表3 各实验组、治疗组FSC内FN含量(±s) FSC培养条件
FN含量(MOD；n=6)
实验组
治疗组
DMEM
99.86±12.09
95.02±17.08
, 百拇医药
KCncm
215.07±35.72*
150.42±10.20△
KCtcm
452.42±33.64**
373.64±44.52
PCncm
140.49±25.95
128.31±13.96
PCtcm
134.05±14.75
, 百拇医药
114.42±44.40
KCncm+PCncm
358.37±43.34**
300.31±61.24
KCncm+PCtcm
390.37±43.34**
309.51±34.24
注：与DMEM组比较 *P<0.05 **P<0.01；与各相应实验组比较 △P<0.053 讨论
肝纤维化是指各种致病因子所致的肝内纤维结缔组织过度增生，其发展后果是形成肝硬化。肝纤维化是慢性肝损伤向肝硬化发展的动态过程，其起始于PC坏死，随之是炎症反应、巨噬细胞激活、纤维生成介质释放、FSC激活，最终以肝脏结缔组织成分的合成与降解明显失去平衡，导致细胞外基质过度蓄积为必然结局。
, 百拇医药
本实验是在研究肝脏细胞间调节网络及芍药甙对实验大鼠培养肝细胞损伤的防治作用[5～8]的基础上，进一步观察柴胡皂甙对FSC激活及合成细胞外基质的作用。现已证明柴胡皂甙可改善慢性肝炎患者的肝功能，抑制小鼠CCl4所致肝损伤脂质过氧化反应[9、10]。门氏[11]研究证明小柴胡汤的主要成分为柴胡皂甙，它可稳定肝细胞膜，改善肝功能。吉氏证明柴苓汤能减轻大鼠肝纤维化的发生与发展，对肝纤维化有明显的预防和治疗作用[12]。本室以往体内实验[13～17]已证明活血化瘀方药在防治肝纤维化作用的各项指标中均优于清热利湿和益气养阴方药，也优于丹参注射液和秋水仙素阳性对照药，主要呈现的是活血化瘀方药可使肝脏Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原、FN、LN的合成受到抑制，并可促使其降解和吸收，从而减轻了ECM的沉积，上述现象呈现较强的规律性。但体外有关细胞培养的实验研究却少有报道。本实验在体外进行原代细胞培养分别以不同条件培养基培养FSC，同时加入柴胡皂甙(记作“T”)，观察其对FSC激活及合成细胞外基质能力的影响。结果证明，TKCncm、TKCtcm、TKCncm+PCncm(或PCtcm)组FSC内结蛋白阳性反应明显减弱，细胞表型转化的形态学特征得到改善，除TPCncm、TPCtcm组外，其余各治疗组FSC内DNA合成及3H-脯氨酸掺入量均呈不同程度降低。各治疗组Ⅰ型胶原含量明显减少，TKCncm、TKCtcm组Ⅲ、Ⅳ型胶原及FN含量也显著减少，其余各治疗组呈明显下降趋势。这充分说明，FSC的激活是纤维化启动和迁延的关键所在，如能抑制FSC激活，即能有效地抑制肝纤维化的发展进程。而本实验证明，柴胡皂甙对肝细胞具有保护作用，可抑制FSC的激活，从而抑制了FSC的增殖及直接或间接抑制FSC合成ECM的能力，而达到防治肝损伤、肝纤维化的目的。
, 百拇医药
作者简介：陈爽，女，39岁，医学博士，讲师
参考文献
[1]范金茹，贺石林，王行宽.参附注射液与柴胡注射液抗脂质过氧化的作用.中 成药，1991，13(2)：25～27
[2]迁冈悦二.初代培养大鼠肝细胞中和汉药作用机理的研究——柴胡皂甙对体外实验中CCl 4肝损伤的影响.国外医学*中医中药分册，1983，5(6)：50～54
[3]Liu YP,Liu J,Jia XS， et al.Protective effects of fulovotopentosides on aceta minopheninduced hepatotioxicity.Acta Pharmacol.Sin,1992,12(3)：209～213
, 百拇医药 [4]于庆海，万立萍.柴胡皂甙抗炎作用初探.沈阳药学院学报，1986，3(1)：14～16
[5]陈 爽，贲长恩，杨美娟，等.库普弗细胞对原代培养贮脂细胞激活的调节作用.解剖学 杂志，1998，21(4)：393～399
[6]陈 爽，贲长恩，赵丽云，等.PC和KC在贮脂细胞激活过程中的协同作用.解剖科学进展 ，1998，4(2)：147～152
[7]陈 爽，贲长恩，杨美娟，等.KC和FSC对肝细胞增殖及合成功能的影响.解剖科学进展 ，1998，4(4)：333～336
[8]陈 爽，贲长恩，杨美娟，等.芍药甙对实验性大鼠培养肝细胞损伤的防治作用的形态学 及生物化学研究.中西医结合肝病杂志，1997，7(4)：217
[9]李迁利，吕亚彬，田振坤，等.长白柴胡中柴胡皂甙及对小鼠实验性肝损伤保护作用的实 验研究.中医药学报，1988，(1)：45～47
, 百拇医药
[10]危北海.日本应用柴胡剂治疗乙型肝炎的研究进展.河南中医，1991，11(3)：48～51
[11]门奈丈之.小柴胡汤对酒精性脂肪肝的防护作用.国外医学*中医中药分册，1988，10(5 )：54～55
[12]吉中和，谢贤春.柴苓汤治疗实验性肝纤维化的研究.中西医结合肝病杂志，1995，5(3 )：31～32
[13]于世瀛，贲长恩，杨美娟，等.活血化瘀方药抗大鼠肝纤维化的形态学和组织化学定量 研究.中西医结合肝病杂志，1996，6(2)：21～23
[14]贲长恩.中医药抗肝纤维化研究的现状和展望.北京中医药大学学报，1996，19(5)：2 ～8
[15]于世瀛，贲长恩，杨美娟，等.清热利湿方药抗肝纤维化的形态学和免疫组织化学定量 研究.北京中医药大学学报，1997，20(1)：28～31
[16]河福金，贲长恩，王德福，等.小柴胡汤对大鼠酒精性肝损伤防护作用 的组化和生化研究.北京中医药大学学报，1997，20(1)：45～47
[17]于世瀛，贲长恩，杨美娟，等.丹参对离体培养纤维化后肝细胞的细胞化学定量研究.中 国中医基础医学杂志，1996，2(6)：27～29
收稿日期：1998-02-23, http://www.100md.com
单位：北京中医药大学组织胚胎学教研室 北京100029
关键词：柴胡皂甙；贮脂细胞；细胞外基质；细胞培养；库普弗细胞；肝实质细胞；免疫化学
北京中医药大学学报990110 摘 要：观察柴胡有效成分柴胡皂甙对原代培养贮脂细胞(FSC)激活及合成细胞外基质(ECM)的作用。结果：治疗组库普弗细胞条件培养基(TKCncm)、治疗CCl4损伤库普弗细胞条件培养基(TKCtcm)、TKCncm加肝细胞条件培养基(PCncm)组FSC内结蛋白阳性反应明显减弱，对细胞表型转化的形态学特征有一定改善，各治疗组FSC的DNA合成及3H-脯氨酸掺入量均呈不同程度降低，FSC内Ⅰ型胶原含量明显减少。说明柴胡皂甙对肝细胞具有保护作用，直接抑制FSC内DNA的合成，还可抑制FSC的激活，从而抑制FSC合成ECM的能力。
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A Clinical Study on the Saikosaponin on FSC Activation and
Extracellular Matrix Synthesis
Chen Shuang(陈 爽),Ben Changen(贲长恩),Yang Meijuan(杨美娟),et al.
(Beijing University of Traditional Chinese Medicine, Beijing 100029)
ABSTRACT: Objective: to observe the effects of Saikosaponin, an ef fective component of Bupleurum, on activating the primary cultured Fat Store Cells (FSC ) and synthesizing extracellular matrix (ECM). Method: utilizing ultrastructure, immunocytochemistry and image pattern analysis to examine contents of collagen type 1, 3, 4 and fibronectin (FN) in FSC; using flow Cytomater to determine cont ent of DNA and measure 3H-Proline incorporation volume so as to detect collag en protein volume in FSC. Result: positive reaction of the desmin was markedly weak ened in the groups of TKCnem, TKCtem and TKCnem plus Pcnem. For the transformati on of cell phenotype, the morphological character was improved. In other treatme nt groups on FSC, DNA synthesis and 3H-Proline incorporation volume were decr eas ed at different levels. In all treatment groups, volume of collagen type 1 was d ecreased markedly, especially groups of TKCnem and TKCtem. Conclusion: Saikosapo nin can protect the hepatocytes. It could inhibit the DNA synthesis and the FSC activation so to inhibit the ECM synthesis.
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KEY WORDS: Saikosaponin; FSC; ECM; Kupffer's Cell; Immunochemistry ; Liver Parenchymal Cell
柴胡皂甙的抗炎、保肝、镇静、镇痛、增强免疫机能等效应，已为临床及实验研究所证实[1～4]。但有关其抗肝纤维化的作用及其作用机制，尤其是在体外培养条件下柴胡皂甙对原代培养贮脂细胞(FSC)的激活及合成细胞外基质(ECM)的干预作用尚未见报道。我们在肝脏细胞间调节网络的实验研究[5～7]基础上进一步就柴胡皂甙对FSC激活及合成ECM进行了实验研究。
1 材料和方法
1.1 动物与试剂
雄性Wistar大鼠，以CCl4与橄榄油等量混合，皮下注射1次(150μL/g)，4d后用于实验。试剂全部为Sigma公司产品，ABC试剂盒、兔抗鼠二抗、猪抗兔二抗为DAKO公司产品，3H-脯氨酸购自中国原子能科学研究所。
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1.2 肝实质细胞(PC)、库普弗细胞(KC)、FSC分离与培养
分离PC、KC选用体重140～180g大鼠；分离FSC选用体重450～550g大鼠。PC、KC分别由正常和CCl4损伤大鼠分离获得，FSC则由正常大鼠分离获取。分离及培养方法同文献[5～7]。
1.3 条件培养液的制备
由正常、CCl4损伤大鼠分离PC、KC培养后提取培养液，分别记作贮脂细胞条件培养基(PCncm)、CCl4损伤库普弗细胞条件培养基(KCncm)、库普弗细胞条件培养基(KCtcm)。由正常大鼠分离FSC，培养后分别提取“静息”FSC，自发激活的FSC培养液，分别记作贮脂细胞条件培养基(FSCncm)、CCl4损伤贮脂细胞条件培养基(FSCtcm)。制备方法同文献[5～7]。
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1.4 实验分组
各实验组FSC以含有10%胎牛血清的DMEM培养48h后，分别换用稀释度为1∶4的KC、PC各条件培养液及其相对应的条件培养基，各相应治疗组记作“T”，同时加入50μg/mL柴胡皂甙(由中国医学科学院药物研究所提供)，以后每隔48h换液，以同样条件继续培养，至8d取样进行各项指标检测。实验分组：对照组、KCncm、KCtcm、PCncm、PCtcm(CCl4损伤肝细胞条件培养基)、KCncm+PCncm、KCncm+PCtcm7组不加入柴胡皂甙；而T对照组、TKCncm(治疗库普弗细胞条件培养基)、TKCtcm(治疗CCl4损伤库普弗细胞条件培养基)、PCncm、PCtcm、KCncm、PCncm、KCncm+PCtcm7组分别加入柴胡皂甙(50μg/mL)。
各实验组PC以含有10%小牛MEM培养液及其相对应的条件培养基培养4h后，分别换用无血清MEM培养液及稀释度为1∶4的KC、FSC条件培养基培养，各相应治疗组记作“T”，同时加入50μg/mL柴胡皂甙，24h后取样，进行各项指标检测。实验分组：对照组、KCncm、KCtcm、FSCncm、FSCtcm5组不加入柴胡皂甙；而T对照组、TKCncm、TKCtcm、TFSCncm(治疗贮脂细胞条件培养基)、TFSCtcm(治疗CCl4损伤贮脂细胞条件培养基)5组均加入柴胡皂甙(50μg/mL)。
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1.5 透射电镜标本制备
常规清洗，3%戊二醛磷酸缓冲液固定，离心，再固定，脱水，树脂包埋，薄切80nm，电子染色，JEM-1200EX电镜观察。
1.6 流式细胞仪检测细胞内DNA含量
弃去培养液，加入0.25%胰酶200～400μL，在倒置显微镜下观察，细胞稍变圆时，加入30～50μL小牛血清终止消化。用吸管反复吹打，200r/min，离心7min收集细胞，加入3～4mL无Ca2+、Mg2+PBS液，离心7min，弃上清，约留0.5mL细胞悬液，振荡使细胞分离。用注射器迅速将细胞注入70%4℃冷乙醇中，置4℃冰箱固定18h。调细胞悬液为106个/mL，加入RNA酶A(每样品50μg/mL)，至37℃水浴中孵育30min后，立即放入冰箱中，终止RNA酶的作用。加入50μg/mL碘化丙啶液，进行DNA染色。上机前尼龙网过滤。BECTONFACS420流式细胞仪，在激发光为480nm，发射光为585nm条件下，检测DNA含量。
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1.7 3H-脯氨酸掺入检测
每孔加入3H-脯氨酸1μci/mL，培养48h后弃去培养液，加入0.25%胰酶90μL，倒置显微镜下观察，细胞变圆后加入10μL小牛血清，吹打细胞至脱壁，49型玻璃纤维滤纸收集细胞，美国BeckmanLS5801型液体闪烁计数仪进行胶原蛋白合成总量的检测。
1.8 免疫细胞化学及图像分析
以稀释度为1∶4的不同条件培养基培养24h后，取出盖玻片，用ABC免疫酶法分别检测细胞内Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型胶原和纤维粘连蛋白(FN)，并用美国TN-8502型图像分析仪测量[7]。
2 结果
2.1 各组FSC表型的转化
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2.1.1 结蛋白免疫组化观察：各实验组结蛋白均呈阳性反应，反应颗粒呈棕褐色，位于核周，胞突内阳性颗粒较少。与对照组相比KCncm、KCncm+PCncm各处理组阳性反应明显增强。与实验组相比，相应的TKCncm、TKCncm+PCncm治疗组阳性反应呈不同程度减弱，以TKCcnm各组减弱最为明显。
2.1.2 透射电镜观察：KCncm、KCncm+PCncm各处理组则表现出明显的表型转化特征，内质网增多、扩张；高尔基复合体肥大；胞膜下出现成束平行排列的微丝。与各实验组相比，相应的治疗组表现为TKCncm、TKCncm+PCncm各组FSC表型转化特征有一定程度改善。
2.2 FSC内DNA含量检测
流式细胞仪检测结果是各治疗组FSC内DNA含量均明显增加，与对照组相比具有统计学意义；与相应的治疗组相比，T对照组(DMEM)、TKCncm、TKCtcm,DNA含量分别下降27.00%、17.26%、14.00%，其中以TKCncm、TKCtcm组具有统计学意义(见表1)。
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2.3 FSC内胶原蛋白总量的检测
各实验组FSC内3H-脯氨酸掺入量均明显增多，与对照组相比具有统计学意义；与相应的实验组相比：T对照组(DMEM)、TKCncm、TKCtcm、TKCncm+PCncm、TKCncm+PCtcm其掺入量分别下降21%、19%、28%、18%、11%；而TPCncm、TPCtcm组变化不明显(见表1)。
表1 各组FSC内DNA含量及3H-脯氨酸掺入量(
±s) FSC培养条件DNA含量(道数；n=3)
3H-脯氨酸掺入量(CPM；n=4)
治疗组
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实验组
实验组
治疗组
DMEM
108.95±11.30
79.67±16.01
88.58±8.90
69.20±9.30
KCncm
337.75±10.97**
279.44±10.07△△
, 百拇医药
329.18±18.09**
267.42±10.17△△
KCtcm
435.80±24.41**
374.11±25.29△
398.61±26.69**
287.32±12.29△△
PCncm
283.27±26.50**
, 百拇医药
264.24±12.51
177.70±12.43**
158.06±12.51
PCtcm
261.48±28.95**
239.89±29.64
169.44±16.58**
150.24±20.48
KCncm+PCncm
491.22±22.11**
, 百拇医药
448.29±20.48
445.25±26.74**
364.28±20.48
KCtcm+PCtcm
466.90±27.03**
439.66±31.28
434.04±24.34**
385.99±21.28
注：与DMEM组比**P<0.01；与各相应实验组比△P<0.05 △△P<0.012.4 胶原免疫细胞化学观察
各实验组FSCⅠ、Ⅲ、Ⅳ型胶原均呈棕褐色阳性反应。细胞呈梭形，胞质内含有丰富的阳性反应颗粒，多分布于核周围，胞质突起内着色较浅。Ⅰ型胶原与对照组相比KCncm、KCncm+PCncm各实验组阳性反应明显增强。各治疗组其阳性反应均有不同程度减弱；与相应的实验组相比，各治疗组FSC内Ⅰ型胶原含量均有下降，除T对照组外，均具有统计学意义。Ⅲ型胶原特点是与相应实验组相比，TKCncm、TKCtcm组Ⅲ型胶原含量分别下降25%、15%，具有统计学意义，其余各组均呈下降趋势。Ⅳ型胶原特点是与相应实验组相比，TKCncm组下降31%，具有统计学意义。TKCtcm、TKCncm+PCncm、TKCncm+PCtcm组呈明显下降趋势(见表2)。
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表2 各组FSCⅠ、Ⅲ、Ⅳ型胶原含量(
±s) FSC培养条件Ⅰ型胶原含量(MOD；n=8)
Ⅲ型胶原含量(MOD；n=6)
Ⅳ型胶原含量(MOD；n=6)
实验组
治疗组
实验组
治疗组
实验组
治疗组
, 百拇医药 DMEM
192.48±56.89
109.23±45.54
174.40±33.01
166.67±25.07
99.54±23.07
101.87±14.18
KCncm
390.61±21.30*
240.64±27.76△△
246.28±23.34*
, 百拇医药
184.40±23.01△
182.68±20.02*
126.05±12.52△
KCtcm
718.72±53.63**
575.61±38.12△
661.67±46.63**
563.74±15.09△
351.88±35.69**
, 百拇医药
283.74±45.09
PCncm
224.05±19.28
144.64±31.46△
204.30±19.91
197.47±10.11
147.48±41.26
118.17±12.09
PCtcm
203.90±20.24
150.04±25.25
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194.04±30.82
167.79±12.53
136.48±18.60
138.75±36.02
KCncm+PCncm
495.98±12.67**
330.09±61.17△
449.60±31.95**
343.76±55.85
244.02±21.24**
, 百拇医药
186.48±38.60△
KCncm+PCtcm
484.94±45.11**
458.36±62.10△
424.23±30.18**
388.49±68.91
264.39±66.43*
231.18±49.08△
注：与DMEM组比*P<0.05 **P<0.01；与各相应实验组比 △P<0.05 △△P<0.012.5 纤维粘连蛋白(FN)免疫细胞化学观察
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各实验组FSC内FN均呈棕褐色阳性反应颗粒，多分布于核周。与对照组相比，KCncm、KCncm+PCncm各实验组阳性反应明显增强；与相应实验组相比，TKCncm组下降30%；TKCtcm、TKCncm+PCncm各组呈明显下降趋势(见表3)。
表3 各实验组、治疗组FSC内FN含量(
±s) FSC培养条件FN含量(MOD；n=6)
实验组
治疗组
DMEM
99.86±12.09
95.02±17.08
, 百拇医药
KCncm
215.07±35.72*
150.42±10.20△
KCtcm
452.42±33.64**
373.64±44.52
PCncm
140.49±25.95
128.31±13.96
PCtcm
134.05±14.75
, 百拇医药
114.42±44.40
KCncm+PCncm
358.37±43.34**
300.31±61.24
KCncm+PCtcm
390.37±43.34**
309.51±34.24
注：与DMEM组比较 *P<0.05 **P<0.01；与各相应实验组比较 △P<0.053 讨论
肝纤维化是指各种致病因子所致的肝内纤维结缔组织过度增生，其发展后果是形成肝硬化。肝纤维化是慢性肝损伤向肝硬化发展的动态过程，其起始于PC坏死，随之是炎症反应、巨噬细胞激活、纤维生成介质释放、FSC激活，最终以肝脏结缔组织成分的合成与降解明显失去平衡，导致细胞外基质过度蓄积为必然结局。
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本实验是在研究肝脏细胞间调节网络及芍药甙对实验大鼠培养肝细胞损伤的防治作用[5～8]的基础上，进一步观察柴胡皂甙对FSC激活及合成细胞外基质的作用。现已证明柴胡皂甙可改善慢性肝炎患者的肝功能，抑制小鼠CCl4所致肝损伤脂质过氧化反应[9、10]。门氏[11]研究证明小柴胡汤的主要成分为柴胡皂甙，它可稳定肝细胞膜，改善肝功能。吉氏证明柴苓汤能减轻大鼠肝纤维化的发生与发展，对肝纤维化有明显的预防和治疗作用[12]。本室以往体内实验[13～17]已证明活血化瘀方药在防治肝纤维化作用的各项指标中均优于清热利湿和益气养阴方药，也优于丹参注射液和秋水仙素阳性对照药，主要呈现的是活血化瘀方药可使肝脏Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原、FN、LN的合成受到抑制，并可促使其降解和吸收，从而减轻了ECM的沉积，上述现象呈现较强的规律性。但体外有关细胞培养的实验研究却少有报道。本实验在体外进行原代细胞培养分别以不同条件培养基培养FSC，同时加入柴胡皂甙(记作“T”)，观察其对FSC激活及合成细胞外基质能力的影响。结果证明，TKCncm、TKCtcm、TKCncm+PCncm(或PCtcm)组FSC内结蛋白阳性反应明显减弱，细胞表型转化的形态学特征得到改善，除TPCncm、TPCtcm组外，其余各治疗组FSC内DNA合成及3H-脯氨酸掺入量均呈不同程度降低。各治疗组Ⅰ型胶原含量明显减少，TKCncm、TKCtcm组Ⅲ、Ⅳ型胶原及FN含量也显著减少，其余各治疗组呈明显下降趋势。这充分说明，FSC的激活是纤维化启动和迁延的关键所在，如能抑制FSC激活，即能有效地抑制肝纤维化的发展进程。而本实验证明，柴胡皂甙对肝细胞具有保护作用，可抑制FSC的激活，从而抑制了FSC的增殖及直接或间接抑制FSC合成ECM的能力，而达到防治肝损伤、肝纤维化的目的。
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作者简介：陈爽，女，39岁，医学博士，讲师
参考文献
[1]范金茹，贺石林，王行宽.参附注射液与柴胡注射液抗脂质过氧化的作用.中 成药，1991，13(2)：25～27
[2]迁冈悦二.初代培养大鼠肝细胞中和汉药作用机理的研究——柴胡皂甙对体外实验中CCl 4肝损伤的影响.国外医学*中医中药分册，1983，5(6)：50～54
[3]Liu YP,Liu J,Jia XS， et al.Protective effects of fulovotopentosides on aceta minopheninduced hepatotioxicity.Acta Pharmacol.Sin,1992,12(3)：209～213
, 百拇医药 [4]于庆海，万立萍.柴胡皂甙抗炎作用初探.沈阳药学院学报，1986，3(1)：14～16
[5]陈 爽，贲长恩，杨美娟，等.库普弗细胞对原代培养贮脂细胞激活的调节作用.解剖学 杂志，1998，21(4)：393～399
[6]陈 爽，贲长恩，赵丽云，等.PC和KC在贮脂细胞激活过程中的协同作用.解剖科学进展 ，1998，4(2)：147～152
[7]陈 爽，贲长恩，杨美娟，等.KC和FSC对肝细胞增殖及合成功能的影响.解剖科学进展 ，1998，4(4)：333～336
[8]陈 爽，贲长恩，杨美娟，等.芍药甙对实验性大鼠培养肝细胞损伤的防治作用的形态学 及生物化学研究.中西医结合肝病杂志，1997，7(4)：217
[9]李迁利，吕亚彬，田振坤，等.长白柴胡中柴胡皂甙及对小鼠实验性肝损伤保护作用的实 验研究.中医药学报，1988，(1)：45～47
, 百拇医药
[10]危北海.日本应用柴胡剂治疗乙型肝炎的研究进展.河南中医，1991，11(3)：48～51
[11]门奈丈之.小柴胡汤对酒精性脂肪肝的防护作用.国外医学*中医中药分册，1988，10(5 )：54～55
[12]吉中和，谢贤春.柴苓汤治疗实验性肝纤维化的研究.中西医结合肝病杂志，1995，5(3 )：31～32
[13]于世瀛，贲长恩，杨美娟，等.活血化瘀方药抗大鼠肝纤维化的形态学和组织化学定量 研究.中西医结合肝病杂志，1996，6(2)：21～23
[14]贲长恩.中医药抗肝纤维化研究的现状和展望.北京中医药大学学报，1996，19(5)：2 ～8
[15]于世瀛，贲长恩，杨美娟，等.清热利湿方药抗肝纤维化的形态学和免疫组织化学定量 研究.北京中医药大学学报，1997，20(1)：28～31
[16]河福金，贲长恩，王德福，等.小柴胡汤对大鼠酒精性肝损伤防护作用 的组化和生化研究.北京中医药大学学报，1997，20(1)：45～47
[17]于世瀛，贲长恩，杨美娟，等.丹参对离体培养纤维化后肝细胞的细胞化学定量研究.中 国中医基础医学杂志，1996，2(6)：27～29
收稿日期：1998-02-23, http://www.100md.com