内皮素-1单抗对神经源性肺水肿的治疗作用
作者：周开顺 程爱国 李建珉
单位：周开顺(唐山工人医院 河北唐山063000)；程爱国(华北煤炭医学院附属医院)；李建珉(华北煤炭医学院附属医院)
关键词：神经源性肺水肿 内皮素-1单克隆抗体
山东医药002007 摘要 采用Marmarous脑损伤模型致大鼠重度、弥漫性脑损伤，观察内皮素-1(ET-1)单克隆抗体对弥漫性脑损伤大鼠肺泡隔面积密度及肺水含量的影响，同时用光镜和电镜观察大鼠肺组织形态学改变。发现ET-1单抗可使弥漫性脑损伤大鼠肺泡隔面积密度下降，肺水含量减少。认为ET-1单抗可减轻大鼠弥漫性脑损伤所致神经源性肺水肿。
中图分类号：R651.1 文献标识码：A
Abstract To investigate the protective effect of anti-endothelin-1 antibody on neurogenetic pulmonary edema，the anti-endothelin-1 antibody was used in the rats which underwent brain injury referring to Marmarous′model.The changes of square densities in pulmonary interstitial tissue and water volumes in lungs were observed.The pathologic changes were examined with optical and eletronic microscopes respectively.The result showed anti-endothelin-1 antibody can decrease the square densities of pulmonary interstitial tissues and water volumes in lungs.This indicated anti-endothelin-1 antibody can prevent the rats undergoing diffuse brain injury from neurogenetic pulmonary edema.
, 百拇医药
Key Words Neurogenetic pulmonary edema Anti-endothelin-1 antibody
神经源性肺水肿是颅脑损伤的一种严重并发症，其病情凶险，病死率高。目前其发病机理尚未完全阐明，临床上还无有效的治疗方法。我们采用Marmarous脑损伤模型，观察了ET-1单抗对弥漫性脑损伤大鼠所致神经源性肺水肿的治疗作用。
1 资料与方法
1.1 实验动物分组及处理 健康成年雄性Wistar大鼠92只(由中国医学科学院协和医科大学提供)，体重350g～450g，随机分为正常对照组(n＝8)，实验组(n＝84)。实验组采用Marmarous脑损伤模型的制备方法致大鼠重度弥漫性脑损伤[1]，依据是否给药又分为A、B两亚组(各42只)，A组为单纯脑损伤组，B组为脑损伤+ET-1单克隆抗体组。
, 百拇医药
1.2 方法 将ET-1单抗用无菌生理盐水配成1∶2000溶液，按1ml/(kg*d)进行尾静脉注射。A、B两组分别于伤后1h、3h、6h、24h、48h、72h、168h7个时项点活杀动物，先打开胸腔，肉眼观察肺组织的大体变化，然后取出肺组织，左肺用于含水量测定，右肺下叶留做病理标本。各时项点杀大鼠6只。对照组不予致伤，标本采集同脑损伤组。
1.3 检测指标 ①肉眼观察肺水肿的发生情况。②光镜和电镜观察肺组织形态学和超微结构改变。③肺水含量的测定：采用干湿比重法[2]。将左肺取出，用滤纸吸净表面血迹，测定其湿重，然后放入110℃恒温箱中24小时，烤至恒重，再测其干重，按公式(肺含水量＝湿重-干重/湿重)计算肺含水量。④采用MAS-1图像分析系统测定各例HE染色切片肺泡隔面积密度。所有数据采用单因素方差分析，数据以
±x表示。
, 百拇医药
2 结果
2.1 大体解剖学观察 A组大鼠伤后24h起，肺组织肿胀，颜色粉白，双肺可见点片状出血，以双下肺为著，气管内可见粉红色泡沫状液体。B组及正常对照组无明显肺组织肿胀、出血等肺水肿表现。
2.2 光镜观察 正常对照组大鼠肺泡腔清晰，肺泡大小均匀，间隔纤细，毛细血管内可见少量血细胞。A组伤后1h起，可见肺组织间隔增宽，毛细血管扩张充血，肺间质有以中性粒细胞及单个核细胞为主的白细胞浸润；6h肺间隔增宽显著，血管及支气管周围可见白细胞呈围管样浸润；24h及48h可见肺泡壁破裂，肺泡腔融合，部分肺泡腔内可见红细胞及嗜伊红的蛋白渗出物，呈现典型的渗出性肺水肿表现；72h及168h水肿减轻，但仍可见白细胞浸润。B组伤后1h、6h也可见肺组织间隔增宽，毛细血管扩张充血，肺间质可见少量中性粒细胞及单个核细胞浸润；但较A组明显减轻。24h及48h肺泡腔清晰，未见红细胞及嗜伊红的蛋白渗出物。
, http://www.100md.com 2.3 电镜观察 A组自伤后1h起，可见肺各级血管不同程度收缩，偶见中性粒细胞及血小板滞留、嵌塞。3h，6h可见毛细血管扩张、充血，肺泡Ⅱ型细胞线粒体肿胀、空化，板层体排空。24h，48h肺泡Ⅱ型细胞增生显著，胞浆内可见大量肿胀、空化的线粒体及排空、融合的板层体；肺内毛细血管内可见微血栓形成；肺泡腔内可见变形、破碎的红细胞，部分肺泡腔内透明膜形成。72h，168h肺泡Ⅱ型细胞增生减轻，但仍可见肺泡Ⅱ型细胞粒体肿胀、空化、板层体排空现象。B组在伤后3h、6h可见肺微血管轻度扩张，线粒体肿胀不明显，肺泡Ⅱ型上皮增生不明显，可见Ⅱ型上皮内部分板层体排空，余各组未见明显改变。
2.4 肺组织含水量变化 A组伤后1h、3h、6h肺含水量较对照组增加，但不具有统计学意义(P>0.05)；24h肺组织含水量较正常对照组显著增加(P<0.05)；48h增加非常显著(P<0.01)；72h，168h略有下降，但仍较正常对照组显著增加(P<0.05)。B组较正常对照组肺含水量无明显增加(P>0.05)，B组较A组24、72h实验组肺水含量有显著下降(P<0.05)。48h实验组肺水含量有非常显著下降(P<0.01)。详见表1。
, 百拇医药
2.5 肺泡隔面积密度改变 A组自伤后1h起肺泡隔面积密度较正常对照组有非常显著增加(P<0.01)；6h增加达高峰；24h，48h骤然下降；72h，168h再次较正常对照组显著增加(P<0.05)。B组仅伤后6h较对照组有显著增加(P<0.05)，余各组与对照组比较无明显差异。B组较A组1h实验组肺泡隔面积密度有显著下降(P<0.05)；3h、6h实验组肺泡隔面积密度有非常显著下降(P<0.01)；余各组无明显差异。详见表2。
表1 三组肺组织含水量的变化
伤后肺组织含水量变化(g水/100g肺组织)
1h
3h
6h
24h
, 百拇医药
48h
72h
168h
实验A组
实验B组
正常对照组
75.68±4.33
76.48±4.31
72.66±6.16
77.54±1.89
77.23±2.28
72.66±6.16
, 百拇医药
78.08±1.72
74.41±4.43
72.66±6.16
80.62±1.87*
73.52±5.24△
72.66±6.16
83.64±5.67**
72.44±3.36△△
72.16±6.16
79.28±1.97*
, 百拇医药
73.38±2.42△
72.16±6.16
79.02±2.94*
74.66±3.78
72.16±6.16
注：实验组伤后各时点与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；A、B各相应实验组比较，△P<0.05，△△P<0.01表2 三组肺泡隔面积密度的改变
肺泡隔面积密度改变(肺泡隔cm2/100cm2视野)
1h
, 百拇医药
3h
6h
24h
48h
72h
168h
实验A组
实验B组
正常对照组
44.82±5.21**
30.28±4.12△
26.86±3.11
, 百拇医药
62.33±3.08**
34.23±2.08△△
26.86±3.11
64.48±7.34**
44.31±6.43*△△
26.86±3.1
26.52±5.24
32.52±2.42
26.86±3.11
27.64±3.56
, http://www.100md.com
37.44±3.86
26.86±3.11
38.38±4.42*
35.38±1.14
26.86±3.11
40.62±3.78*
30.66±1.57
26.86±3.11
注：实验组伤后各时点与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；A、B各相应实验组比较，△P<0.05，△△P<0.01
, http://www.100md.com
3 讨论
脑损伤模型是研究神经源性肺水肿的主要方法。我们采用Marmarous的方法致大鼠重度弥漫性脑损伤，伤后大鼠出现肺泡腔及肺间质水肿、出血等典型肺水肿表现，成功地复制了神经源性肺水肿模型。实验中我们发现：使用ET-1单抗后，实验B组(脑创伤+ET-1单抗注射组)较A组(单纯脑致伤组)白细胞浸润减轻，肺泡隔面积密度有显著下降(P<0.05)；B组较正常对照组肺含水量无明显增加(P>0.05)，B组较A组肺水含量有显著下降(P<0.05)。说明ET-1单抗可减轻弥漫性脑损伤所致肺水肿。
研究表明，弥漫性脑损伤后，血浆和肺组织匀浆中ET-1含量增加，且与脑损伤程度一致[3]。升高的ET-1选择性地作用于肺血管，使肺脏各级血管收缩，肺血流动力学改变，白细胞、血小板在肺毛细血管内聚集、嵌塞，肺血流阻力加重。形态学显示：肺间隔增宽，白细胞浸润、滞留于肺脏(伤后1～6h)。电镜显示伤后早期血管内有微血栓形成及白细胞滞留。随着缺血、缺氧加重，滞留于肺内的白细胞坏死、崩解，释放蛋白酶类、氧自由基、磷脂酶A2等活性物质，使血管壁受损，通透性增加，肺水肿形成。此时，光镜显示肺泡壁破裂，肺泡腔融合，肺泡腔内出现蛋白渗出物等典型渗出型肺水肿表现。电镜表现为Ⅱ型上皮增生、板层体排空等缺血、缺氧表现。国内汪盛贤等直接给大鼠静脉注射ET-1多肽，也证实有白细胞在肺内的滞留、坏死、崩解，肺水肿出现[4]。ET-1单抗通过改善肺脏血流，以及拮抗ET-1多肽对白细胞直接激活作用，抑制白细胞在肺内滞留及生物活性介质的释放，从而阻断这种由白细胞介导的炎性损伤过程。此外，ET-1单抗可抑制ET-1直接增加肺血管通透性作用，从而使肺水肿减轻[5]。ET-1单抗还可通过降低肺动脉压高压，阻止压力性肺水肿的形成[6]。我们认为，ET-1单抗可减轻弥漫性脑损伤引起的神经源性肺水肿的发生。临床上可以使用ET-1单抗治疗神经源性肺水肿。
, 百拇医药
参考文献
1，Marmarous A，Foda MA，Brink WD，et al.A new model of diffuse brain injury in rat.part I：pathophysiology and biomechanics.J Neurosurg，1994，80：291～302.
2，范润金，王宪荣.钙离子在脑外伤后继发性肺损害中的作用.中华创伤杂志，1998，14(2)：37～38.
3，沈光建，邹咏文，许民辉，等.实验性颅脑损伤后内皮素的活性变化及意义.中华创伤杂志，1996，12(2)：99.
4，汪盛贤，于忠和，陈意生，等.内皮素-1介导的肺脏病变及其发生机制探讨.解放军医学杂志，1998，23(1)：54～55.
5，Helset E.Endothelin-1 induced increases in microvascular permeability in isolated perfused rat requres leukocytes and plasma.Circ Shock，1993，39：15
6，林江凯，王宪荣.内皮素在神经源性肺水肿中的意义.中华实验外科杂志，1996，13(6)：365～366.
(2000-07-30收稿), 百拇医药
单位：周开顺(唐山工人医院 河北唐山063000)；程爱国(华北煤炭医学院附属医院)；李建珉(华北煤炭医学院附属医院)
关键词：神经源性肺水肿 内皮素-1单克隆抗体
山东医药002007 摘要 采用Marmarous脑损伤模型致大鼠重度、弥漫性脑损伤，观察内皮素-1(ET-1)单克隆抗体对弥漫性脑损伤大鼠肺泡隔面积密度及肺水含量的影响，同时用光镜和电镜观察大鼠肺组织形态学改变。发现ET-1单抗可使弥漫性脑损伤大鼠肺泡隔面积密度下降，肺水含量减少。认为ET-1单抗可减轻大鼠弥漫性脑损伤所致神经源性肺水肿。
中图分类号：R651.1 文献标识码：A
Abstract To investigate the protective effect of anti-endothelin-1 antibody on neurogenetic pulmonary edema，the anti-endothelin-1 antibody was used in the rats which underwent brain injury referring to Marmarous′model.The changes of square densities in pulmonary interstitial tissue and water volumes in lungs were observed.The pathologic changes were examined with optical and eletronic microscopes respectively.The result showed anti-endothelin-1 antibody can decrease the square densities of pulmonary interstitial tissues and water volumes in lungs.This indicated anti-endothelin-1 antibody can prevent the rats undergoing diffuse brain injury from neurogenetic pulmonary edema.
, 百拇医药
Key Words Neurogenetic pulmonary edema Anti-endothelin-1 antibody
神经源性肺水肿是颅脑损伤的一种严重并发症，其病情凶险，病死率高。目前其发病机理尚未完全阐明，临床上还无有效的治疗方法。我们采用Marmarous脑损伤模型，观察了ET-1单抗对弥漫性脑损伤大鼠所致神经源性肺水肿的治疗作用。
1 资料与方法
1.1 实验动物分组及处理 健康成年雄性Wistar大鼠92只(由中国医学科学院协和医科大学提供)，体重350g～450g，随机分为正常对照组(n＝8)，实验组(n＝84)。实验组采用Marmarous脑损伤模型的制备方法致大鼠重度弥漫性脑损伤[1]，依据是否给药又分为A、B两亚组(各42只)，A组为单纯脑损伤组，B组为脑损伤+ET-1单克隆抗体组。
, 百拇医药
1.2 方法 将ET-1单抗用无菌生理盐水配成1∶2000溶液，按1ml/(kg*d)进行尾静脉注射。A、B两组分别于伤后1h、3h、6h、24h、48h、72h、168h7个时项点活杀动物，先打开胸腔，肉眼观察肺组织的大体变化，然后取出肺组织，左肺用于含水量测定，右肺下叶留做病理标本。各时项点杀大鼠6只。对照组不予致伤，标本采集同脑损伤组。
1.3 检测指标 ①肉眼观察肺水肿的发生情况。②光镜和电镜观察肺组织形态学和超微结构改变。③肺水含量的测定：采用干湿比重法[2]。将左肺取出，用滤纸吸净表面血迹，测定其湿重，然后放入110℃恒温箱中24小时，烤至恒重，再测其干重，按公式(肺含水量＝湿重-干重/湿重)计算肺含水量。④采用MAS-1图像分析系统测定各例HE染色切片肺泡隔面积密度。所有数据采用单因素方差分析，数据以
±x表示。, 百拇医药
2 结果
2.1 大体解剖学观察 A组大鼠伤后24h起，肺组织肿胀，颜色粉白，双肺可见点片状出血，以双下肺为著，气管内可见粉红色泡沫状液体。B组及正常对照组无明显肺组织肿胀、出血等肺水肿表现。
2.2 光镜观察 正常对照组大鼠肺泡腔清晰，肺泡大小均匀，间隔纤细，毛细血管内可见少量血细胞。A组伤后1h起，可见肺组织间隔增宽，毛细血管扩张充血，肺间质有以中性粒细胞及单个核细胞为主的白细胞浸润；6h肺间隔增宽显著，血管及支气管周围可见白细胞呈围管样浸润；24h及48h可见肺泡壁破裂，肺泡腔融合，部分肺泡腔内可见红细胞及嗜伊红的蛋白渗出物，呈现典型的渗出性肺水肿表现；72h及168h水肿减轻，但仍可见白细胞浸润。B组伤后1h、6h也可见肺组织间隔增宽，毛细血管扩张充血，肺间质可见少量中性粒细胞及单个核细胞浸润；但较A组明显减轻。24h及48h肺泡腔清晰，未见红细胞及嗜伊红的蛋白渗出物。
, http://www.100md.com 2.3 电镜观察 A组自伤后1h起，可见肺各级血管不同程度收缩，偶见中性粒细胞及血小板滞留、嵌塞。3h，6h可见毛细血管扩张、充血，肺泡Ⅱ型细胞线粒体肿胀、空化，板层体排空。24h，48h肺泡Ⅱ型细胞增生显著，胞浆内可见大量肿胀、空化的线粒体及排空、融合的板层体；肺内毛细血管内可见微血栓形成；肺泡腔内可见变形、破碎的红细胞，部分肺泡腔内透明膜形成。72h，168h肺泡Ⅱ型细胞增生减轻，但仍可见肺泡Ⅱ型细胞粒体肿胀、空化、板层体排空现象。B组在伤后3h、6h可见肺微血管轻度扩张，线粒体肿胀不明显，肺泡Ⅱ型上皮增生不明显，可见Ⅱ型上皮内部分板层体排空，余各组未见明显改变。
2.4 肺组织含水量变化 A组伤后1h、3h、6h肺含水量较对照组增加，但不具有统计学意义(P>0.05)；24h肺组织含水量较正常对照组显著增加(P<0.05)；48h增加非常显著(P<0.01)；72h，168h略有下降，但仍较正常对照组显著增加(P<0.05)。B组较正常对照组肺含水量无明显增加(P>0.05)，B组较A组24、72h实验组肺水含量有显著下降(P<0.05)。48h实验组肺水含量有非常显著下降(P<0.01)。详见表1。
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2.5 肺泡隔面积密度改变 A组自伤后1h起肺泡隔面积密度较正常对照组有非常显著增加(P<0.01)；6h增加达高峰；24h，48h骤然下降；72h，168h再次较正常对照组显著增加(P<0.05)。B组仅伤后6h较对照组有显著增加(P<0.05)，余各组与对照组比较无明显差异。B组较A组1h实验组肺泡隔面积密度有显著下降(P<0.05)；3h、6h实验组肺泡隔面积密度有非常显著下降(P<0.01)；余各组无明显差异。详见表2。
表1 三组肺组织含水量的变化
伤后肺组织含水量变化(g水/100g肺组织)
1h
3h
6h
24h
, 百拇医药
48h
72h
168h
实验A组
实验B组
正常对照组
75.68±4.33
76.48±4.31
72.66±6.16
77.54±1.89
77.23±2.28
72.66±6.16
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78.08±1.72
74.41±4.43
72.66±6.16
80.62±1.87*
73.52±5.24△
72.66±6.16
83.64±5.67**
72.44±3.36△△
72.16±6.16
79.28±1.97*
, 百拇医药
73.38±2.42△
72.16±6.16
79.02±2.94*
74.66±3.78
72.16±6.16
注：实验组伤后各时点与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；A、B各相应实验组比较，△P<0.05，△△P<0.01表2 三组肺泡隔面积密度的改变
肺泡隔面积密度改变(肺泡隔cm2/100cm2视野)
1h
, 百拇医药
3h
6h
24h
48h
72h
168h
实验A组
实验B组
正常对照组
44.82±5.21**
30.28±4.12△
26.86±3.11
, 百拇医药
62.33±3.08**
34.23±2.08△△
26.86±3.11
64.48±7.34**
44.31±6.43*△△
26.86±3.1
26.52±5.24
32.52±2.42
26.86±3.11
27.64±3.56
, http://www.100md.com
37.44±3.86
26.86±3.11
38.38±4.42*
35.38±1.14
26.86±3.11
40.62±3.78*
30.66±1.57
26.86±3.11
注：实验组伤后各时点与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；A、B各相应实验组比较，△P<0.05，△△P<0.01
, http://www.100md.com
3 讨论
脑损伤模型是研究神经源性肺水肿的主要方法。我们采用Marmarous的方法致大鼠重度弥漫性脑损伤，伤后大鼠出现肺泡腔及肺间质水肿、出血等典型肺水肿表现，成功地复制了神经源性肺水肿模型。实验中我们发现：使用ET-1单抗后，实验B组(脑创伤+ET-1单抗注射组)较A组(单纯脑致伤组)白细胞浸润减轻，肺泡隔面积密度有显著下降(P<0.05)；B组较正常对照组肺含水量无明显增加(P>0.05)，B组较A组肺水含量有显著下降(P<0.05)。说明ET-1单抗可减轻弥漫性脑损伤所致肺水肿。
研究表明，弥漫性脑损伤后，血浆和肺组织匀浆中ET-1含量增加，且与脑损伤程度一致[3]。升高的ET-1选择性地作用于肺血管，使肺脏各级血管收缩，肺血流动力学改变，白细胞、血小板在肺毛细血管内聚集、嵌塞，肺血流阻力加重。形态学显示：肺间隔增宽，白细胞浸润、滞留于肺脏(伤后1～6h)。电镜显示伤后早期血管内有微血栓形成及白细胞滞留。随着缺血、缺氧加重，滞留于肺内的白细胞坏死、崩解，释放蛋白酶类、氧自由基、磷脂酶A2等活性物质，使血管壁受损，通透性增加，肺水肿形成。此时，光镜显示肺泡壁破裂，肺泡腔融合，肺泡腔内出现蛋白渗出物等典型渗出型肺水肿表现。电镜表现为Ⅱ型上皮增生、板层体排空等缺血、缺氧表现。国内汪盛贤等直接给大鼠静脉注射ET-1多肽，也证实有白细胞在肺内的滞留、坏死、崩解，肺水肿出现[4]。ET-1单抗通过改善肺脏血流，以及拮抗ET-1多肽对白细胞直接激活作用，抑制白细胞在肺内滞留及生物活性介质的释放，从而阻断这种由白细胞介导的炎性损伤过程。此外，ET-1单抗可抑制ET-1直接增加肺血管通透性作用，从而使肺水肿减轻[5]。ET-1单抗还可通过降低肺动脉压高压，阻止压力性肺水肿的形成[6]。我们认为，ET-1单抗可减轻弥漫性脑损伤引起的神经源性肺水肿的发生。临床上可以使用ET-1单抗治疗神经源性肺水肿。
, 百拇医药
参考文献
1，Marmarous A，Foda MA，Brink WD，et al.A new model of diffuse brain injury in rat.part I：pathophysiology and biomechanics.J Neurosurg，1994，80：291～302.
2，范润金，王宪荣.钙离子在脑外伤后继发性肺损害中的作用.中华创伤杂志，1998，14(2)：37～38.
3，沈光建，邹咏文，许民辉，等.实验性颅脑损伤后内皮素的活性变化及意义.中华创伤杂志，1996，12(2)：99.
4，汪盛贤，于忠和，陈意生，等.内皮素-1介导的肺脏病变及其发生机制探讨.解放军医学杂志，1998，23(1)：54～55.
5，Helset E.Endothelin-1 induced increases in microvascular permeability in isolated perfused rat requres leukocytes and plasma.Circ Shock，1993，39：15
6，林江凯，王宪荣.内皮素在神经源性肺水肿中的意义.中华实验外科杂志，1996，13(6)：365～366.
(2000-07-30收稿), 百拇医药