深低温保存自体颅骨瓣的动物实验及临床应用
作者：王沛涛 李玉军 丁昌荣 于华英 孟庆海
单位：王沛涛 丁昌荣 于华英(青岛医学院附属医院(青岛 266003)低温医学研究室 李玉军(病理科) 孟庆海(神经外科)
关键词：颅骨；低温保藏；移植，同基因；兔；人
齐鲁医学杂志990401 【摘要】 ①目的 探讨深低温保存兔及人自体颅骨瓣的移植效果。②方法 分别将深低温保存、煮沸处理及新鲜的兔颅骨瓣自体移植,观察移植后骨瓣的愈合情况、X线表现和组织病理学变化。同时，对50例病人自体颅骨瓣行深低温保存，择期行颅骨缺损修补术。③结果 兔新鲜颅骨瓣和深低温保存的颅骨瓣移植效果较好，经煮沸处理的兔颅骨瓣移植效果较差。50例病人移植后临床效果均满意。④结论 深低温保存自体颅骨瓣移植修补颅骨缺损，有与新鲜颅骨瓣近似的治疗效果，其方法简便易行，回植后骨结构和功能恢复良好。
中国图书馆分类法分类号 R651.15
, http://www.100md.com
ANIMAL EXPERIMENT AND CLINICAL APPLICATION
OF THE CRYOPRESERVED AUTO-CRANIAL FLAP
Wang Peitao, Li Yujun, Ding Changrong, et al Department of Cryomedicine, The Affiliated Hospital of Qingdao Medical College, Qingdao 266003
【ABSTRACT】 Objective To investigate the autograft effect of cryopreserved auto-cranial flaps of rabbits and human beings. Methods The cryopreserved, boiled and fresh auto-cranial flaps of rabbits were autografted. The healing condition, X-ray and histopathology after transplantation were observed. Meanwhile 50 patients' cranial flaps were cryopreserved and transplanted.Results After autograft, the cryopreserved cranial flaps recovered as perfectly as the fresh ones, the boiled ones were not satisfying and all the patients recovered satisfactorily, no complication occurred. Conclusion Using the cryopreserved auto-cranial flaps to repaire cranial defect has the same curative effect as the fresh ones. The method is simple and feasible, and worthy to be widely used.
, 百拇医药
【KEY WORDS】 skull; cryopreservation; transplantation, isogeneic; rabbit; men
颅骨修补术是颅脑损伤和其他颅脑疾病常见的二期手术。目前临床上采用的各种颅骨修补材料均存在许多缺点和不足〔1，2〕。本研究探讨深低温保存自体颅骨瓣的可行性和有效性，并应用于临床病人自体颅骨瓣的回植。现报告如下。
1 资料与方法
1.1 动物及分组
纯种健康成年新西兰大耳白兔18只，体质量2.8～3.2kg，雌雄不限，随机分成深低温保存组、煮沸处理组和新鲜对照组。
1.1.1 深低温保存组 兔耳缘静脉注射30g/L的戊巴比妥钠(1mL/kg体质量)，麻醉成功后剪除头顶部位毛发，常规消毒局部皮肤，正中切开头皮3～4cm，向两侧剥离骨膜，暴露右侧颅骨，用牙科钻取下顶骨瓣约1.0cm×1.0cm大小，将骨瓣用生理盐水冲洗后，放入装有4℃含100g/L二甲基亚砜(DMSO)的M199低温保护剂(CPM)的塑料冷冻保存袋中，再置4℃冰箱冷平衡10min，然后在QL-Ⅲ型低温生物降温仪中分步降温冷冻。待液氮不再沸腾后取出复温，生理盐水冲洗数次去掉残留CPM，回植修补颅骨缺损。
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1.1.2 煮沸处理组 麻醉及处理方法同深低温保存组，骨瓣取下后，放入水中煮沸15～20min，然后取出置生理盐水中浸泡5～10min，再将骨瓣植于缺损部位修补颅骨缺损，缝合骨膜及皮肤。
1.1.3 新鲜对照组 骨瓣取下后，不进行其他处理，仅放入生理盐水中浸泡30min，然后将骨瓣回植修补颅骨缺损。
术后所有兔均在相同的条件下饲养观察，并于移植术后30，60，90及120d时进行各实验观察。
1.2 临床资料
本组50例病人，男32例，女18例;年龄8～53岁，平均28.3岁。外伤后手术取下的骨瓣最大为10cm×8cm，最小6cm×5cm.不带骨膜的游离骨瓣在尽可能短的时间内按兔实验所述方法实施低温冷冻保存，本组骨瓣离体至实施低温保存的最长时间为24h.骨瓣深低温保存时间79～510d，平均215d.待病人病情稳定，颅内压不高时，择期行骨瓣回植术，术后若发现有皮下积液可穿刺抽液并加压包扎，所有病人修补术后定期随访检查。
, 百拇医药
2 结 果
2.1 兔移植骨瓣的肉眼及组织学观察
①深低温保存组：肉眼观察发现，骨瓣移植30d后，移植部位与周围骨已经基本连接，回植骨瓣中央部位颜色黄白，骨瓣周边部位颜色深红，结缔组织明显增生，表面粗糙。60d后见移植骨瓣颜色黄白区域缩小，周边区域结缔组织增生，血运丰富，表面粗糙，触之较坚硬，不能剥离。90及120d时，可见手术侧与未手术侧颅顶骨无明显差别，血运丰富，边缘部位略粗糙，颜色略深，移植部位弧度形态以及压力承受能力均良好。X线检查结果显示，30d时骨瓣中央点片状死骨明显，周边骨密度降低；60d时仍有少量死骨，与周边骨连接线模糊;90～120d时骨瓣密度与周围骨密度基本一致，连接线消失。组织学观察发现，30～60d时移植骨瓣中央有不同程度的点片状死骨，骨瓣与周围骨间增生的富含成纤维细胞的结缔组织，逐渐被灶状的骨样组织和骨小梁所代替；90及120d时纤维性或(和)胶质骨痂形成，部分区域髓腔已再通，由成熟板层骨构成骨小梁网的两侧有骨皮质形成。②煮沸处理组：骨移植时，骨瓣缩小，移植后可见其与周围骨间的间隙较宽，骨瓣回植后活动度较大，移植骨瓣与周围骨形成连接的时间较晚，骨瓣的血液循环建立时间也较晚。120d时形成纤维性骨连接，X线检查和组织学检查结果与之相吻合。③新鲜对照组：骨瓣移植后的肉眼及组织学表现与深低温保存组基本一致。
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2.2 人颅骨瓣回植后的效果
50例病人颅骨瓣回植修补后均无排异反应和感染等并发症发生，随访发现缺损部位修补后头颅外形曲线恢复良好，且局部压力承受能力随着修补手术后时间的延长逐渐提高，骨瓣缺损轻者回植术后1～2年可完全恢复正常。3例病人修补术后出现头皮下积液，行局部皮下穿刺抽液，加压包扎后好转。X线片及CT随访检查发现，移植后30～60d可见植骨瓣边缘有约1～2mm轻微的骨质吸收现象，与受区周围骨的缝隙较明显且增宽，120～180d时缝隙逐渐开始变窄。1年后，骨瓣与周围骨界限模糊，显示已开始出现骨性连接愈合，骨密度增高。修补术后5年颅骨X线片检查显示，骨缝模糊不清，达骨性愈合。ECT多体位颅骨静态显像示：骨显影清晰，放射性分布均匀，颅骨瓣区放射性分布较对侧略增高，回植骨成活良好。
3 讨 论
一般认为，在移植骨的愈合过程中，有三方面的因素起着决定性的作用：①植入骨内的存活细胞；②骨传导作用；③骨诱导作用。经深低温保存后的颅骨瓣不仅具有一般化学方法和冻干方法保存后的骨传导作用，同时仍然保持了组织细胞的活性，因此，移植后可以发挥上述三方面的作用，有效地刺激新生血管的再生和长入，使骨传导和诱导作用大大增强，促进移植骨与受区骨的融合〔3〕。
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有人用不含小牛血清的DMSO介质低温保存新生鼠的颅骨，并经胸苷摄取实验证实：1.3mol/L DMSO的M199组织培养液深低温冷冻保存后的颅骨，复温后连续培养24h，可摄取大量的标记胸苷，说明冷冻保存后仍保持其代谢活性〔4,5〕。本文结果显示，用含100g/L DMSO的M199细胞培养液深低温保存的颅骨瓣，复温后修补颅骨缺损，无论肉眼观察、X线检查及组织学变化，均能达到与新鲜骨瓣移植修补缺损相近的效果，而煮沸骨的移植效果较差。吴洁等〔6〕研究发现，无论煮沸自体骨还是新鲜自体骨植入均发生无菌性坏死，后由宿主新生组织进行爬行替换，但煮沸骨再植后的愈合较新鲜自体骨慢，56d后逐渐一致。许健全等〔7〕观察认为，冷冻植入骨的修复过程除爬行替换外，骨诱导可起一定作用；煮沸骨只起作为新生骨爬行的支架，起被动骨传导作用，其吸收修复过程较为缓慢。因此，从骨修复的速度和程度方面考虑，冷冻骨要比煮沸骨好。冷冻骨基质中的骨诱导物质可能未被灭活，仍能保留其骨诱导能力。煮沸处理则使骨细胞内所有蛋白质变性失活，煮沸骨哈非管凝固，骨胶原变性，影响血运的重建和骨的正常修复。
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临床上所用颅骨修补材料种类较多，合成材料易出现感染、局部创面愈合不良和排斥反应等。自体皮下保存的颅骨瓣，效果较肯定，但同时也有明显的缺陷：①自体保存需要埋植和取骨2次手术，造成病人较大痛苦和不便；②皮下埋植超过90d，会出现骨瓣与周围组织的粘连和骨质吸收，影响临床移植效果〔2，8〕。本文结果证实了深低温保存方法的可靠性和有效性，经0.5～5.0年的随访观察，除3例病人术后出现头皮下积液外(经抽液后加压包扎治愈)，所有病人均未发生感染、愈合不良、排斥反应等。深低温保存自体颅骨瓣具有如下优点：①自体骨回植无免疫排异反应；②病人心理容易接受，避免了使用其他非生物材料所引起的病人心理上的排异反应和并发症；③回植的骨瓣可成活，与周围骨组织融合为一体，不仅对颅脑起到保护作用，同时也能达到头面部理想的美容效果；④尤其适宜于儿童，儿童的颅骨尚在生长中；⑤深低温保存的骨瓣不变形、不缩小，保证了回植成功与美容效果；⑥骨瓣保存时间的长短对回植后的愈合情况无影响，故回植时间不受严格限制，为临床治疗提供了极大的便利条件；⑦骨瓣保存方法简便，宜推广。
, 百拇医药
参考文献
1 柏乃庆主编.人体保存.上海科学技术出版社，1985.120
2 袁昌彪，丁 华，徐崇光. 颅骨瓣自体不同部位埋藏与不同时间再植术的临床研究与应用.中华神经外科杂志, 1990, 6(2):133
3 狄勋元. 异体植骨的生物效应与免疫反应.骨与关节损伤杂志,1992,7(3):183
4 Laforest P， Kempf JF， Follea G， et al. Comparison of mechanical qualities of cortical bone preserved by various freezing methods. Rev Chir Orthop, 1991, 77(6):389
5 Frederick H， Wezeman F， Katrina M，et al. Retention of bone cell viability in mouse calvarial explants after cryopreservation. Cryobiology, 1986, 223:81
6 吴 洁, 钟永持. 煮沸自体下颌骨再植的实验研究.中华口腔医学杂志, 1990,25(4):279
7 许建全，任材年.冷冻和煮沸自体下颌骨再植的动物实验研究.中华口腔医学杂志，1991,26(3):158
8 陆裕朴, 葛宝丰,徐印坎,等主编. 实用骨科学. 北京：人民军医出版社 ，1991.313
(1999-04-06收稿 1999-09-29修回), http://www.100md.com
单位：王沛涛 丁昌荣 于华英(青岛医学院附属医院(青岛 266003)低温医学研究室 李玉军(病理科) 孟庆海(神经外科)
关键词：颅骨；低温保藏；移植，同基因；兔；人
齐鲁医学杂志990401 【摘要】 ①目的 探讨深低温保存兔及人自体颅骨瓣的移植效果。②方法 分别将深低温保存、煮沸处理及新鲜的兔颅骨瓣自体移植,观察移植后骨瓣的愈合情况、X线表现和组织病理学变化。同时，对50例病人自体颅骨瓣行深低温保存，择期行颅骨缺损修补术。③结果 兔新鲜颅骨瓣和深低温保存的颅骨瓣移植效果较好，经煮沸处理的兔颅骨瓣移植效果较差。50例病人移植后临床效果均满意。④结论 深低温保存自体颅骨瓣移植修补颅骨缺损，有与新鲜颅骨瓣近似的治疗效果，其方法简便易行，回植后骨结构和功能恢复良好。
中国图书馆分类法分类号 R651.15
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ANIMAL EXPERIMENT AND CLINICAL APPLICATION
OF THE CRYOPRESERVED AUTO-CRANIAL FLAP
Wang Peitao, Li Yujun, Ding Changrong, et al Department of Cryomedicine, The Affiliated Hospital of Qingdao Medical College, Qingdao 266003
【ABSTRACT】 Objective To investigate the autograft effect of cryopreserved auto-cranial flaps of rabbits and human beings. Methods The cryopreserved, boiled and fresh auto-cranial flaps of rabbits were autografted. The healing condition, X-ray and histopathology after transplantation were observed. Meanwhile 50 patients' cranial flaps were cryopreserved and transplanted.Results After autograft, the cryopreserved cranial flaps recovered as perfectly as the fresh ones, the boiled ones were not satisfying and all the patients recovered satisfactorily, no complication occurred. Conclusion Using the cryopreserved auto-cranial flaps to repaire cranial defect has the same curative effect as the fresh ones. The method is simple and feasible, and worthy to be widely used.
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【KEY WORDS】 skull; cryopreservation; transplantation, isogeneic; rabbit; men
颅骨修补术是颅脑损伤和其他颅脑疾病常见的二期手术。目前临床上采用的各种颅骨修补材料均存在许多缺点和不足〔1，2〕。本研究探讨深低温保存自体颅骨瓣的可行性和有效性，并应用于临床病人自体颅骨瓣的回植。现报告如下。
1 资料与方法
1.1 动物及分组
纯种健康成年新西兰大耳白兔18只，体质量2.8～3.2kg，雌雄不限，随机分成深低温保存组、煮沸处理组和新鲜对照组。
1.1.1 深低温保存组 兔耳缘静脉注射30g/L的戊巴比妥钠(1mL/kg体质量)，麻醉成功后剪除头顶部位毛发，常规消毒局部皮肤，正中切开头皮3～4cm，向两侧剥离骨膜，暴露右侧颅骨，用牙科钻取下顶骨瓣约1.0cm×1.0cm大小，将骨瓣用生理盐水冲洗后，放入装有4℃含100g/L二甲基亚砜(DMSO)的M199低温保护剂(CPM)的塑料冷冻保存袋中，再置4℃冰箱冷平衡10min，然后在QL-Ⅲ型低温生物降温仪中分步降温冷冻。待液氮不再沸腾后取出复温，生理盐水冲洗数次去掉残留CPM，回植修补颅骨缺损。
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1.1.2 煮沸处理组 麻醉及处理方法同深低温保存组，骨瓣取下后，放入水中煮沸15～20min，然后取出置生理盐水中浸泡5～10min，再将骨瓣植于缺损部位修补颅骨缺损，缝合骨膜及皮肤。
1.1.3 新鲜对照组 骨瓣取下后，不进行其他处理，仅放入生理盐水中浸泡30min，然后将骨瓣回植修补颅骨缺损。
术后所有兔均在相同的条件下饲养观察，并于移植术后30，60，90及120d时进行各实验观察。
1.2 临床资料
本组50例病人，男32例，女18例;年龄8～53岁，平均28.3岁。外伤后手术取下的骨瓣最大为10cm×8cm，最小6cm×5cm.不带骨膜的游离骨瓣在尽可能短的时间内按兔实验所述方法实施低温冷冻保存，本组骨瓣离体至实施低温保存的最长时间为24h.骨瓣深低温保存时间79～510d，平均215d.待病人病情稳定，颅内压不高时，择期行骨瓣回植术，术后若发现有皮下积液可穿刺抽液并加压包扎，所有病人修补术后定期随访检查。
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2 结 果
2.1 兔移植骨瓣的肉眼及组织学观察
①深低温保存组：肉眼观察发现，骨瓣移植30d后，移植部位与周围骨已经基本连接，回植骨瓣中央部位颜色黄白，骨瓣周边部位颜色深红，结缔组织明显增生，表面粗糙。60d后见移植骨瓣颜色黄白区域缩小，周边区域结缔组织增生，血运丰富，表面粗糙，触之较坚硬，不能剥离。90及120d时，可见手术侧与未手术侧颅顶骨无明显差别，血运丰富，边缘部位略粗糙，颜色略深，移植部位弧度形态以及压力承受能力均良好。X线检查结果显示，30d时骨瓣中央点片状死骨明显，周边骨密度降低；60d时仍有少量死骨，与周边骨连接线模糊;90～120d时骨瓣密度与周围骨密度基本一致，连接线消失。组织学观察发现，30～60d时移植骨瓣中央有不同程度的点片状死骨，骨瓣与周围骨间增生的富含成纤维细胞的结缔组织，逐渐被灶状的骨样组织和骨小梁所代替；90及120d时纤维性或(和)胶质骨痂形成，部分区域髓腔已再通，由成熟板层骨构成骨小梁网的两侧有骨皮质形成。②煮沸处理组：骨移植时，骨瓣缩小，移植后可见其与周围骨间的间隙较宽，骨瓣回植后活动度较大，移植骨瓣与周围骨形成连接的时间较晚，骨瓣的血液循环建立时间也较晚。120d时形成纤维性骨连接，X线检查和组织学检查结果与之相吻合。③新鲜对照组：骨瓣移植后的肉眼及组织学表现与深低温保存组基本一致。
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2.2 人颅骨瓣回植后的效果
50例病人颅骨瓣回植修补后均无排异反应和感染等并发症发生，随访发现缺损部位修补后头颅外形曲线恢复良好，且局部压力承受能力随着修补手术后时间的延长逐渐提高，骨瓣缺损轻者回植术后1～2年可完全恢复正常。3例病人修补术后出现头皮下积液，行局部皮下穿刺抽液，加压包扎后好转。X线片及CT随访检查发现，移植后30～60d可见植骨瓣边缘有约1～2mm轻微的骨质吸收现象，与受区周围骨的缝隙较明显且增宽，120～180d时缝隙逐渐开始变窄。1年后，骨瓣与周围骨界限模糊，显示已开始出现骨性连接愈合，骨密度增高。修补术后5年颅骨X线片检查显示，骨缝模糊不清，达骨性愈合。ECT多体位颅骨静态显像示：骨显影清晰，放射性分布均匀，颅骨瓣区放射性分布较对侧略增高，回植骨成活良好。
3 讨 论
一般认为，在移植骨的愈合过程中，有三方面的因素起着决定性的作用：①植入骨内的存活细胞；②骨传导作用；③骨诱导作用。经深低温保存后的颅骨瓣不仅具有一般化学方法和冻干方法保存后的骨传导作用，同时仍然保持了组织细胞的活性，因此，移植后可以发挥上述三方面的作用，有效地刺激新生血管的再生和长入，使骨传导和诱导作用大大增强，促进移植骨与受区骨的融合〔3〕。
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有人用不含小牛血清的DMSO介质低温保存新生鼠的颅骨，并经胸苷摄取实验证实：1.3mol/L DMSO的M199组织培养液深低温冷冻保存后的颅骨，复温后连续培养24h，可摄取大量的标记胸苷，说明冷冻保存后仍保持其代谢活性〔4,5〕。本文结果显示，用含100g/L DMSO的M199细胞培养液深低温保存的颅骨瓣，复温后修补颅骨缺损，无论肉眼观察、X线检查及组织学变化，均能达到与新鲜骨瓣移植修补缺损相近的效果，而煮沸骨的移植效果较差。吴洁等〔6〕研究发现，无论煮沸自体骨还是新鲜自体骨植入均发生无菌性坏死，后由宿主新生组织进行爬行替换，但煮沸骨再植后的愈合较新鲜自体骨慢，56d后逐渐一致。许健全等〔7〕观察认为，冷冻植入骨的修复过程除爬行替换外，骨诱导可起一定作用；煮沸骨只起作为新生骨爬行的支架，起被动骨传导作用，其吸收修复过程较为缓慢。因此，从骨修复的速度和程度方面考虑，冷冻骨要比煮沸骨好。冷冻骨基质中的骨诱导物质可能未被灭活，仍能保留其骨诱导能力。煮沸处理则使骨细胞内所有蛋白质变性失活，煮沸骨哈非管凝固，骨胶原变性，影响血运的重建和骨的正常修复。
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临床上所用颅骨修补材料种类较多，合成材料易出现感染、局部创面愈合不良和排斥反应等。自体皮下保存的颅骨瓣，效果较肯定，但同时也有明显的缺陷：①自体保存需要埋植和取骨2次手术，造成病人较大痛苦和不便；②皮下埋植超过90d，会出现骨瓣与周围组织的粘连和骨质吸收，影响临床移植效果〔2，8〕。本文结果证实了深低温保存方法的可靠性和有效性，经0.5～5.0年的随访观察，除3例病人术后出现头皮下积液外(经抽液后加压包扎治愈)，所有病人均未发生感染、愈合不良、排斥反应等。深低温保存自体颅骨瓣具有如下优点：①自体骨回植无免疫排异反应；②病人心理容易接受，避免了使用其他非生物材料所引起的病人心理上的排异反应和并发症；③回植的骨瓣可成活，与周围骨组织融合为一体，不仅对颅脑起到保护作用，同时也能达到头面部理想的美容效果；④尤其适宜于儿童，儿童的颅骨尚在生长中；⑤深低温保存的骨瓣不变形、不缩小，保证了回植成功与美容效果；⑥骨瓣保存时间的长短对回植后的愈合情况无影响，故回植时间不受严格限制，为临床治疗提供了极大的便利条件；⑦骨瓣保存方法简便，宜推广。
, 百拇医药
参考文献
1 柏乃庆主编.人体保存.上海科学技术出版社，1985.120
2 袁昌彪，丁 华，徐崇光. 颅骨瓣自体不同部位埋藏与不同时间再植术的临床研究与应用.中华神经外科杂志, 1990, 6(2):133
3 狄勋元. 异体植骨的生物效应与免疫反应.骨与关节损伤杂志,1992,7(3):183
4 Laforest P， Kempf JF， Follea G， et al. Comparison of mechanical qualities of cortical bone preserved by various freezing methods. Rev Chir Orthop, 1991, 77(6):389
5 Frederick H， Wezeman F， Katrina M，et al. Retention of bone cell viability in mouse calvarial explants after cryopreservation. Cryobiology, 1986, 223:81
6 吴 洁, 钟永持. 煮沸自体下颌骨再植的实验研究.中华口腔医学杂志, 1990,25(4):279
7 许建全，任材年.冷冻和煮沸自体下颌骨再植的动物实验研究.中华口腔医学杂志，1991,26(3):158
8 陆裕朴, 葛宝丰,徐印坎,等主编. 实用骨科学. 北京：人民军医出版社 ，1991.313
(1999-04-06收稿 1999-09-29修回), http://www.100md.com